Name: Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj szybką metodę ekstrakcji rozpuszczalnikowej do oczyszczania polipeptydów podobnych do elastyny z E. coli. Technika zachowuje aktywność białek fuzyjnych i umożliwia skalowanie produkcji biomateriałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Instytutowi Badań nad Rakiem Uniwersytetu Purdue oraz programowi NIH CCSG (CA23168) za wsparcie tej pracy.

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Szczep bakteryjny: Stosuj chemicznie kompetentne komórki Escherichia coli BL21(DE3) jako gospodarza ekspresyjnego. UWAGA: Wybrano je ze względu na wysoką efektywność transformacji oraz przydatność do produkcji białek rekombinowanych.</li>
	<li>Plazmid ekspresyjny: Użyj białka fuzyjnego kodującego wektor pET21(+) z ampicylinową opornością9. Kup wektor plazmidowy od addgene. Wprowadź gen Cm2 za pomocą miejsca BsrG I na końcu inteiny. UWAGA: Sekwencja DNA plazmidowego dla tego białka jest podana w Pliku Uzupełniającym 1.</li>
	<li>Podłoże wzrostowe: Świetna przygotowania do bulionu (TB) dla podłoża 1200 mL<ol>
		<li>Przygotuj podłoże (część 1), dodając 16 g tryptonu, 32 g ekstraktu drożdżowego, 16 g proliny, 6,8 mL glicerolu do 1100 ml ultraczystej wody. Dokładnie wymieszaj, aby rozpuścić wszystkie składniki. Dostosuj ostateczną objętość do 1200 mL używając ultraczystej wody.</li>
		<li>Przygotuj bufor fosforanu potasu (Część 2), mieszając 23,1 g KH2PO4 i 125,4 g K2HPO4, a następnie zwiększ objętość do 1 L z ultraczystą wodą.</li>
		<li>Autoklawuj komponenty (części 1 i 2) osobno. Po autoklawowaniu należy złożyć nośnik, dzieląc bazę gruźlicy na cztery alikwoty po 300 mL. Dodaj 33 mL buforu fosforanowego do każdego aliquotu w warunkach sterylnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodatki do wyrażania<ol>
		<li>IPTG: Przeprowadz indukcję przy użyciu IPTG przy końcowym stężeniu 1,2 mM (np. dodaj 396 μL 1 M IPTG do hodowli 330 mL).</li>
		<li>Antybiotyk: Dodaj ampicylinę do końcowego stężenia 100 μg/mL, aby zapewnić selekcję plazmidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor lizowy (pH 8,5): Przygotuj bufor lizowy z 10 mM Tris Base i 22 mM etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA). Dostosuj pH do 8,5 za pomocą HCl lub NaOH w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Rozpuszczalniki organiczne do ekstrakcji<ol>
		<li>Do ekstrakcji białka fuzyjnego ELP-I-Cm2 z ciał inkluzyjnych stosuj różne rozpuszczalniki organiczne (Tabela 1). Testuj te rozpuszczalniki zarówno indywidualnie, jak i w kombinacjach binarnych (1:1 vol: vol), aby ocenić efektywność i czystość ELP. UWAGA: Wszystkie używane rozpuszczalniki były klasy HPLC, z wyjątkiem acetonitrylu (klasa Optima), etanolu (klasa USP) i 1-Butanolu (99% czystości). UWAGA: Wszystkie wymienione powyżej rozpuszczalniki są lotne i łatwopalne. Należy je obsługiwać w okapie chemicznym z użyciem odpowiedniej ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i ochrona oczu). Wiele rodzajów naczyń nie jest kompatybilnych z rozpuszczalnikami organicznymi. Plastik polipropylenowy jest wysoko zalecany do eksperymentów ekstrakcyjnych i wytrącających się z użyciem rozpuszczalników organicznych; W przeciwnym razie plastik powinien być testowany bez cennej próbki, aby upewnić się, że jest odpowiedni do użycia. Utylizacja odpadów rozpuszczalnikowych powinna przebiegać zgodnie z procedurami określonymi w odpowiednich instytucjonalnych politykach dotyczących odpadów niebezpiecznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Liza i przygotowanie komórek (Rysunek 4A)
<ol>
	<li>Ponowna zawiesina: Odważ 1 g granulatu komórkowego i zawiesz go w 4 mL świeżo przygotowanego buforu lizy. Delikatnie wiruj, aż granulka całkowicie się rozproszy i wymiesza z buforem.</li>
	<li>Liza enzymatyczna (enzymatyczna): Dodaj ~5 mg lizozymu, aby wspomóc trawienie ściany komórkowej. Pozwól zawiesinie inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Ułatwia to częściowe trawienie enzymatyczne, co przyspiesza lizę komórek.</li>
	<li>Sonikacja: Po inkubacji sonikuj próbkę, aby przeprowadzić lizę komórek i ściąć DNA genomowe. Stosuj krótkie serie sonifikacji mikrotipowej sondy (urządzenie 350 W, poziom mocy 3) z odstępami, aby uniknąć przegrzewania (np. 5 s włączone/10 sekund wyłączone, powtarzane w razie potrzeby). Sonikować próbki na lodzie i stosować energię ultradźwiękową aż do uzyskania jednolitego lizatu wolnego od widocznych cząstek, zazwyczaj przez około 5-8 minut. UWAGA: Po zakończeniu sonikacji przechowuj 100 μL aliquot próbki (lub lizatu) do analizy ekspresji ELP, aby monitorować postęp oczyszczania przed i po etapach ekstrakcji i wytrącenia.</li>
	<li>Wirowanie i analiza ekspresji.<ol>
		<li>Lizat klarować przez wirowanie w 10 000 g przez 10 minut w 20 °C, a następnie ostrożnie oddzielić supernatant (frakcję rozpuszczalną) od granulki (frakcja nierozpuszczalna/inkluzyjna).</li>
		<li>Ocena ekspresji ELP w obu frakcjach za pomocą SDS-PAGE: usunięcie aliquotu (np. 10-20 μL) supernatantu i ponowna zawiesina równoważnej masy granulatu w buforze lizy (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) do tej samej objętości; Wymieszaj każdy z 4x buforem Laemmli do ostatniego 1x, podgrzej w 95 °C przez 5 minut i ładuj równe ilości, aby umożliwić bezpośrednie porównanie.</li>
		<li>Jeśli docelowy ELP jest przeważnie rozpuszczalny, należy przeprowadzić ekstrakcję rozpuszczalnikową organiczną przy użyciu klaryfikowanego supernatantu. Jeśli jest przeważnie nierozpuszczalny (ciała inkluzyjne), odrzuć supernatant i kontynuować proces inkluzji (płukanie/rozpuszczanie i ekstrakcja) poprzez obróbkę pelletu przez ekstrakcję rozpuszczalną organiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i suszenie pelletów (tylko dla ELP w ciałach inkluzyjnych): Odwróć rurki wirówki, aby umożliwić grawitacyjne odprowadzanie resztek buforu lizy. Po odpłynięciu widocznej cieczy (~1-2 minuty) pozostaw pellet do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut, aby upewnić się, że jest wolny od nadmiaru wilgoci przed przystąpieniem do ekstrakcji organicznej.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja organiczna (Rysunek 4B)
UWAGA: Każdy ELP ma własny preferowany stan rozpuszczalnika do uzyskania ekstrakcji o wysokiej czystości (np. wydajność AC na Rysunku 1). Dlatego należy przeprowadzić wstępne badanie 28 rozpuszczalników organicznych i ich kombinacji, a izolaty analizować przez PAGE, aby zidentyfikować optymalne warunki efektywności rozpuszczalności dla interesującego konstruktu.
<ol>
	<li>Przesiewanie rozpuszczalnikiem. Przesiewaj poszczególne rozpuszczalniki pokazane w kroku 1.6 oraz ich mieszaniny rozpuszczalników binarnych w stosunku 1:1 (v/v). Oceń dodatkowe mieszanki (np. 1:2, 2:1, 4:1), aby zwiększyć skuteczność procesu. UWAGA: Obecnie nie istnieją wytyczne dotyczące racjonalnego wyboru najskuteczniejszych rozpuszczalników lub kombinacji, dlatego konieczna jest kampania przesiewowa, aby wybrać rozpuszczalniki, które wcześniej skutecznie rozpuszczały agregaty białek hydrofobowych. Ostateczny wybór ekstraktora rozpuszczalnika organicznego do oczyszczania powinien opierać się na analizie SDS-PAGE izolatów uzyskanych z tego przesiewu.</li>
	<li>Procedura ekstrakcji<ol>
		<li>Dodawanie rozpuszczalnika: Dodaj 4 mL rozpuszczalnika organicznego lub mieszaniny rozpuszczalników do suszonego na powietrzu pelletu/supernatantu uzyskanego po lizie. W przypadku kombinacji mieszanych należy zapewnić precyzyjne proporcje objętościowe (np. 2 mL każdej dla kombinacji 1:1).</li>
		<li>Wirowanie: Intensywnie zawies wymieszaj przez 1 minutę, aby zapewnić dokładne wymieszanie i przeniknięcie rozpuszczalnika do pelletu.</li>
		<li>Inkubacja (czas retencji): Pozwól zawiesie inkubować się w 20 °C przez 5 minut, zapewniając wystarczający czas interakcji dla agregacji i sedymentacji białek zewnątrzkomórkowych, podczas gdy ELP rozpuszczają się w fazie organicznej.</li>
		<li>Wirowanie: Wiruj mieszankę w 13 000 × g przez 10 minut w 20 °C, aby oddzielić rozpuszczone białka od pozostałości nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.</li>
		<li>Zbieranie supernatantów: Ostrożnie zbieraj supernatant, nie naruszając granulki. Supernatant zawiera rozpuszczony ELP, natomiast osad zawiera białka komórek gospodarza, kwasy nukleinowe i lipidy.</li>
		<li>Pomiar objętości: Dokładnie zapisz objętość odzyskanego supernatantu. Należy zadbać, aby supernatant był wolny od cząstek granulek. Ten pomiar jest kluczowy dla etapu opadów w dół rzeki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wytrącanie białek
<ol>
	<li>Dodatek antyrozpuszczalnika: Dodaj aceton lub acetonitryl do organicznego supernatantu w ilości 2,33 razy większej objętości niż zmierzona objętość.</li>
	<li>Inkubacja: Inkubuj mieszankę w temperaturze 20 °C przez 5-7 minut.</li>
	<li>Wirowanie: Wirówka w 10 000 g przez 10 minut w 20 °C.</li>
	<li>Obsługa pelletów: Po wirowaniu ostrożnie wyrzuć supernatant i susz próbkę na powietrzu, pozostawiając probówkę bez zakrętki pod delikatnym strumieniem azotu przez 10-15 minut, lub inkubuj, umieszczając niezakorkowane rurki wirówki do góry nogami na chusteczkach bez kłaczków w okapie przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C (nie stosować ciepła).</li>
</ol>
5. Obsługa i ponowna zawiesina w granulatach białkowych
<ol>
	<li>Ponowna spensja: Po wytrąceniu i wyschnięciu na powietrzu ponownie zawiesz białkowy pellet w 50 μL soli fosforanowej (PBS). Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby upewnić się, że granulat jest całkowicie rozpuszczony.</li>
	<li>Przechowywanie: Przechowuj ponownie zawiesowane białko w temperaturze -20 °C do krótko- i średniotrwałego użycia. Unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania, aby zachować funkcjonalną integralność białka.</li>
</ol>
6. Walidacja za pomocą SDS-PAGE
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki: Wymieszaj oczyszczone białko z buforem ładowania 4× SDS-PAGE w proporcji 3:1 i krótko zawij, aby zapewnić jednorodność.</li>
	<li>Warunki elektroforezy: Nakładaj żel 15% SDS-PAGE dla ELP-I-Cm2 i pracuj przy napięciu 100-120 V, aż barwnik śledzący dotrze do dna. UWAGA: Procent sieciowania w żelu powinien być oparty na rozmiarze konstruktu ELP, który nas interesuje</li>
	<li>Barwienie i wizualizacja: Barw żel za pomocą bejcy Instant Blue Coomassie lub innego odpowiedniego barwienia przez 2 godziny w temperaturze 20 °C. Farbuj przez płukanie wodą dejonizowaną, aż uzyskasz przezroczyste tło. Przetestuj białko izolowane w testach aktywności, aby potwierdzić, że zatrzymanie aktywności nastąpiło po procesie ekstrakcji rozpuszczalnika organicznego-oczyszczania wytrącenia.</li>
</ol>

<ol><li>Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides%3A+therapeutic+applications+for+an+emerging+class+of+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines.</a> J Control Release. 240, 93-108 (2016).</li>
<li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery.</a> J Control Release. 190, 314-330 (2014).</li>
<li>Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+elastin-like+polypeptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery.</a> Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targeting+of+immunosuppressants+using+a+bifunctional+elastin-like+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide.</a> Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally+responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+purification+of+elastin-like+polypeptides+directly+from+whole+cells+and+cell+lysates+by+organic+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction.</a> Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).</li>
<li>Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fast+organic+extraction-precipitation+method+for+improved+purification+of+elastin-like+polypeptides+that+is+independent+of+sequence+and+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).</li>
<li>Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+mechanism+of+elastin-like+polypeptide-enzyme+fusion+stabilization+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents.</a> Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+elastin-like+polypeptides+and+their+applications+in+drug+delivery+system+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair.</a> J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).</li>
<li>Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bioengineered+elastin-like+polypeptide-based+system+for+targeted+gene+delivery+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells.</a> Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).</li>
<li>Clement, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+the+recombinant+expression+and+chemical+synthesis+of+a+short+cysteine-rich+insecticidal+spider+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Venom+Anim+Toxins+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide.</a> J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).</li>
<li>Miranda, L. P., Alewood, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+chemical+synthesis+of+peptides+and+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).</li>
<li>Eweje, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+nanoparticles+for+cytosolic+delivery+of+nucleic+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins.</a> Nat Biotechnol. , (2025).</li>
<li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+purification+by+organic+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein purification by organic extraction.</a> Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).</li>
<li>Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+elastin-like+polypeptide-based+nucleic+acid+delivery+system+targeted+to+EGFR%2B+bladder+cancer+cells+using+a+layer-by-layer+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach.</a> Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).</li>
<li>Christensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+order+controls+expression+level+and+activity+of+elastin-like+polypeptide+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins.</a> Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

ITC było wcześniej stosowane do oczyszczania ELP19 niechromatograficznego; Jednak może to być metoda czasochłonna i o niskiej wydajności. W metodach opisanych powyżej opisujemy podejście do szybkiego oczyszczania białka fuzyjnego ELP-I-Cm2, pokazując, jak metoda ekstrakcji i wytrącenia oparta na rozpuszczalnikach organicznych może być skutecznie stosowana do oczyszczania szerokiej gamy fuzji ELP i ELP. Protokół rozpuszczalnika organicznego jest nie tylko szybszy niż ITC, ale także znacznie skutecz...

Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) to biopolimery złożone z powtarzających się (VPGXG)n motywów 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Reszta gościnna X w jednostce pentapeptydowej może być dowolnym aminokwasem innym niż prolina. Zmiany w X mogą być wykorzystane do dostrojenia hydrofobowości, zachowania przejścia termicznego oraz cech funkcjonalnych konstrukcji ELP w celu stworzenia modułowych materiałów biokompatybilnych, które były szeroko badane w różnych zastosowaniach biomedycznych 10,11,12.
Chociaż synteza chemiczna może być wykorzystywana do produkcji krótkich peptydów, jest ona słabo przystosowana do ELP o wysokiej masie cząsteczkowej lub do zachowania funkcjonalności białek fuzji13,14. Z takich powodów ELP są zazwyczaj wyrażane rekombinowanie w E. coli, co pozwala na produkcję zdefiniowaną sekwencją w dużych ilościach. Jednak takie podejście może również przynosić wyzwania. Podczas ekspresji u E. coli ELP często gromadzą się w gęstych ciałach inkluzyjnych, co wymaga skutecznych strategii odzyskiwania do ekstrakcji funkcjonalnegobiałka 15. Ponadto ekspresja bakterii wprowadza niepożądane biocząsteczki, takie jak białka komórek gospodarza, kwasy nukleinowe oraz lipopolisacharydy (endotoksyny), które muszą zostać oddzielone od ELP podczas oczyszczania. Tradycyjne strategie rozpuszczalności z użyciem detergentów (np. siarczan sodu dodecylowego (SDS) lub Triton X-100) lub środków chaotropowych, takich jak mocznik, odniosły ograniczone sukcesy w naszych sekwencjach fuzji ELP. Z naszego doświadczenia wynika, że tryton i mocznik nie wyekstrahowały ELP z fazy pelletowej, podczas gdy SDS umożliwiło częściową rozpuszczalność, ale zakłócało oczyszczanie powinowactwa i trudno było go całkowicie usunąć z hydrofobowej sekwencji ELP.
Do dziś cykl odwrotnych przejść (ITC) pozostaje najczęściej stosowaną metodą oczyszczania ELP. Technika ta wykorzystuje ich zachowanie LCST do selektywnego wytrącenia i resosolizacji ELP w gradientach temperaturowych i solnych16. Jednak przy białkach o niższej masie cząsteczkowej ITC jest czasochłonnym, wieloetapowym procesem, który słabo nadaje się do ELP uwięzionych w ciałach inkluzyjnych, wymagając wielu cykli ITC, co może prowadzić do utraty białek na każdym kroku 7,16.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, przyjęliśmy proces ekstrakcji i wytrącenia na bazie rozpuszczalników organicznych. Podczas gdy Yakhnin i in. po raz pierwszy zaprezentowali strategię partonowania opartą na hydrofobiczności przy oczyszczaniu GFP z użyciem gradientów etanolu i soli w 1998roku, opracowana przez nas nowa metoda wykorzystuje mieszanki rozpuszczalników organicznych do bezpośredniej ekstrakcji białek fuzji ELP z komórek E. coli 7. Sweet i in. oraz Darji i in. zaadaptowali to podejście do fuzji ELP, pokazując, że ekstrakcja rozpuszczalnika organicznego umożliwia szybkie odzyskiwanie funkcjonalnych ELP przy zachowaniu integralności strukturalnej i bioaktywności 8,9. Podejście to wykorzystuje sonikację i rozpuszczalniki organiczne do lizy komórek bakteryjnych i ekstrakcji ELP w jednej operacji, wytrącając większość białek gospodarza i kwasów nukleinowych. Odzysk bogatej w ELP fazy organicznej, a następnie szybkie wytrącanie w celu izolacji ELP z rozpuszczalników i rozpuszczonych zanieczyszczeń, daje wysoce czyste ELP. To podejście pozwala również uzyskać czysty ELP z pelletów E. coli z poziomem endotoksyny poniżej 1 EU/mL w mniej niż trzy godziny 7,8.
Dotychczasowe badania pokazują, że metoda ta jest zdolna do oczyszczania konstruktów ELP oraz białek fuzji ELP o różnej masie cząsteczkowej i punktach izoelektrycznych, bez konieczności wielokrotnych cykli ITC czy kroków rozpuszczania (Rysunek 1). Mikroskopia sił atomowych (AFM) oraz transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) sugerują, że białka ELP fuzyjne oczyszczone w ten sposób tworzą struktury przypominające odwrócone micele (Rysunek 2), co pomaga zachować strukturę i funkcję domen fuzji ELP podczas ekstrakcji rozpuszczalnika organicznego. Ten usprawniony przepływ pracy umożliwia szybsze i bardziej niezawodne oczyszczanie ELP dla różnorodnych zastosowań biomedycznych 7,8. Warto zauważyć, że Aayush i in. poinformowali, że konstrukty ELP oczyszczone tą metodą zachowały funkcję wiązania receptorówwspółczynnika wzrostu naskórka 18, podkreślając, że ta metoda nie tylko produkuje czysty materiał ELP, ale także utrzymuje aktywność domeny białka fuzyjnego.
Jako kolejne dowód użyteczności tej metody w izolowaniu fuzji enzymów ELP, opisujemy szczegółową metodę opartą na rozpuszczalniku organicznym do oczyszczania konstrukcji mutazy ELP-Intein-Chorismate 2 (ELP-I-Cm2) (Rysunek 3). Metoda ta może być przydatna do szybkiego oczyszczania innych ELP do dostarczania leków i nanomateriałów.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% akryloamidu/bisakrylamidu</td><td>TCI</td><td>A3218</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Gold Bio- Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>APS (nadsiarczan amonu)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>L13171</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP118-500</td><td>Komponent buforu lizy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>UN1170</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Fisher Scientific</td><td>E195</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Research Products International</td><td>G22020-0.5</td><td>Świetny komponent mediów bulionu (TB)</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Komponent buforu lizy</td></tr><tr><td>Natychmiastowa plama Coomasie</td><td>Abcam</td><td>ab119211</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Bio- Gold Biotechnology</td><td>12481C25</td><td>Komponent ekspresji białek</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>K2HPO4 (Fosforan potasu, monozasadowy)</td><td>Nauka Warda</td><td>470302-246</td><td>Część 2 Komponent bufora</td></tr><tr><td>KH2PO4 (dwubazowy fosforan potasu)</td><td>Nauka Warda</td><td>470302-254</td><td>Część 2 Komponent bufora</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Research Products International</td><td>P5200-500.0</td><td>Świetny komponent mediów bulionu (TB)</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Gold Bio- Gold Biotechnology</td><td>L-040-1</td><td>Komponent buforu lizy</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>Rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Natywny bufor próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0738</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Drabinka białkowa</td><td>Gold Bio- Gold Biotechnology</td><td>P008-500</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Rozdzielanie buforu żelowego</td><td>Bio-Rad</td><td>1610798</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Siarczan sodim Dodecyl (SDS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J18220-36</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Komponent buforu lizy</td></tr><tr><td>Bufor żelowy do stosowania</td><td>Bio-Rad</td><td>1610799</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>Komponent SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP-152</td><td>Komponent buforu lizy</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Research Products International</td><td>T60065-1000.0</td><td>Świetny komponent mediów bulionu (TB)</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Research Products International</td><td>Y20025-1000.0</td><td>Świetny komponent mediów bulionu (TB)</td></tr></tbody></table>

efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (elp) z e. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Efficient Purification of Elastin-Like Polypeptides (ELPs) from E. coli Using an Organic Solvent-based Extraction and Precipitation Method

Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) to biopolimery zbudowane z powtarzających się sekwencji pentapeptydów, które naśladują motywy występujące w tropoelastynie ssaków. Ich unikalne cechy czynią je idealnymi kandydatami do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, od dostarczania leków i genów po inżynierię tkanek i ukierunkowane obrazowanie molekularne. Konwencjonalne metody oczyszczania z ekspresji Escherichia coli (E. coli) mogą być nieskuteczne dla ELP ze względu na powstawanie ciał inkluzyjnych. Inne metody, takie jak cykl odwrotnych przejść (ITC), wykorzystują właściwości ELP o niższej krytycznej temperaturze roztworu (LCST) do oddzielenia go od zanieczyszczeń, takich jak lipopolisacharydy (LPS), ale zazwyczaj wymagają wielu etapów podgrzewania i chłodzenia, które są czasochłonne i mogą prowadzić do niskich odzysków w zależności od sekwencji, stężenia i masy cząsteczkowej konstrukcji ELP. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy proces ekstrakcji i wytrącenia oparty na rozpuszczalnikach organicznych, który wykorzystuje wewnętrzną hydrofobiczność ELP, umożliwiając szybkie, solidne i szeroko stosowane oczyszczanie bezpośrednio z pelletów komórkowych E. coli . Metoda ta wykorzystuje polarne rozpuszczalniki organiczne do wspomagania rozbicia komórek i selektywnej rozpuszczania ELP w jednym kroku. Kolejny etap wytrącenia skutecznie usuwa pozostałości rozpuszczalników organicznych, zanieczyszczenia o niskiej masie molekularnej oraz endotoksyny, dając wysoce czyste ELP z poziomem LPS poniżej 1 EU/mL w mniej niż 3 godziny. Dane z mikroskopii siłowej z zakresu sił atomowych sugerują, że białka ELP fuzyjne oczyszczone w ten sposób mogą samoorganizować się w odwrócone struktury przypominające micele, które zachowują funkcję białka fuzyjnego. Ta metoda szybkiego oczyszczania oferuje naukowcom prosty i potencjalnie skalowalny sposób oczyszczania ELP, tworząc nowe możliwości wykorzystania ELP i ich białek fuzji jako elastycznych elementów budulcowych dla zastosowań materialnych i biomedycznych.

Po przejściu przez ostatnie fazy protokołu kolejnym krokiem jest wizualizacja wyniku ekstrakcji i opadania za pomocą analizy SDS-PAGE oraz barwienia na błękit Coomasie. Gdy przed ekstracją organiczną następuje etap lizy, powinien być widoczny wyraźny pas ELP. W przypadku ELP-I-Cm2 pasmo to pojawia się na 100 kDa (rysunek 3A).
Przesiewanie różnych kombinacji rozpuszczalników organicznych wykazało zmienną efektywność ekstrakcyjną (rysunek 3B</st...

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Elastin-like polypeptides (ELP) are engineered biopolymers built from repetitive pentapeptide sequences that mimic motifs found in mammalian tropoelastin. ...

Zakres tych badań, czy wytrącanie rozpuszczalnikowym może szybko oczyszczać białka fuzji ELP, zachowując jednocześnie funkcję aktywności fuzyjnej. Najnowsze osiągnięcia obejmują szybkie oczyszczanie ELP na bazie rozpuszczalnika z lepszą kontrolą endotoksyn, umożliwiające aktywne samoorganizujące się nanocząstki do ukierunkowanego dostarczania kwasów nukleinowych. Na początek odważ jeden gram granulki komórkowej E. coli.Dodaj cztery mililitry świeżo przygotowanego buforu lizy, aby ponownie zawiesować pellet komórkowy. Delikatnie wiruj, aż granulka całkowicie się rozproszy i wymiesza z buforem. Dodaj około pięciu miligramów lizozymu do komórek zawieszonych na nowo zawieszonych, aby wspomóc trawienie ściany komórkowej.Następnie umieszczam probówkę w lodzie i inkubuj przez godzinę. Po inkubacji sonikatuj próbkę za pomocą soniki mikro-końcówki w odstępach pięciosekundowych. Trzymaj próbkę na lodzie i kontruj sonifikację, aż uzyska się jednolity lizat wolny od widocznych cząstek, zazwyczaj przez pięć do ośmiu minut.Wirówka lizatu sonikanowego w stężeniu 10 000 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby go wyklarować. Następnie ostrożnie oddzieli supernatant zawierający frak

efficient-purification-elastin-like-polypeptides-elps-from-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

W tym filmie demonstrujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami do oczyszczania peptydów z mieszaniny strawionych lizatów białkowych. Te oczyszczone peptydy są następnie liofilizowane i przechowywane do dalszych zastosowań. Analiza peptydów może pomóc w zrozumieniu mechaniki związanej z sygnalizacją komórkową i rakiem.

Oczyszczanie peptydów: technika ekstrakcji peptydów z trawionych lizatów białkowych oparta na RP-HPLC

Polipeptydy podobne do elastyny to biopolimery reagujące na bodźce, o różnych zastosowaniach, od oczyszczania białek rekombinowanych po dostarczanie leków. Protokół ten opisuje oczyszczanie i charakterystykę polipeptydów podobnych do elastyny oraz ich fuzji peptydów lub białek z Escherichia coli przy użyciu ich zachowania przemiany fazowej w dolnej temperaturze roztworu krytycznego jako prostej alternatywy dla chromatografii.

Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Technologie rekombinowane umożliwiły projektantom materiałów tworzenie nowatorskich sztucznych białek z dostosowanymi funkcjami do zastosowań inżynierii tkankowej. Na przykład sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej można zaprojektować tak, aby zawierały domeny strukturalne i biologiczne pochodzące z natywnych ECM. W tym miejscu opisujemy budowę i oczyszczanie białek aECM zawierających powtórzenia podobne do elastyny.

Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Protokół zapewnia metodologię rozpuszczania tlenowego granulowanego osadu w celu ekstrakcji alginianopodobnych polimerów zewnątrzkomórkowych (ALE).

Ekstrakcja strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych z tlenowego osadu granulowanego

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Niniejszy protokół opisuje wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika w kontrolowanych warunkach, co zapewnia solidne i szybkie odzyskiwanie oraz oczyszczanie próbek proteomu przed spektrometrią mas.

Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Poznaj szybką metodę ekstrakcji rozpuszczalnikowej do oczyszczania polipeptydów podobnych do elastyny z E. coli. Technika zachowuje aktywność białek fuzyjnych i umożliwia skalowanie produkcji biomateriałów.

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych (Wideo) | JoVE Journal

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Przeglądaj więcej filmów