Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Badamy biofilmy jako struktury ochronne umożliwiające przetrwanie środowiska i gospodarza, badając dynamikę powstawania, skład molekularny, cechy adaptacyjne oraz wkład w infekcję. Połączenie bioanalizy kryształowej, obrazowania tekstu czasowego, mikroskopii konfokalnej, skaningowej mikroskopii elektronowej i transkryptomiki w naszych laboratoriach przyczynia się do rozwoju badań nad biofilmem dzięki zintegrowanej analizie wielowymiarowej. Na początek hoduj komórki Leptospiry w podłożu EMJH w szklanych rurkach z płaskodenną śrubą i nakrętką.

Inkubuj hodowle w warunkach tlenowych w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez potrząsania, aż osiągną fazę średnią logarytmiczną. Upewnij się, że hodowle osiągają gęstość optyczną między 0,2 a 0,4 na 405 nanometrach, co odpowiada od dwóch do pięciu razy 10 do mocy ośmiu komórek na mililitr. Używając mikroskopu ciemnego pola przy powiększeniu 20x, sprawdź, czy komórki są modalne, a nie zlepione.

Rozcieńcz zweryfikowaną hodowlę arytmiczną w średnim logarytmie w stosunku 1 do 100 w świeżym podłożu EMJH, aby uzyskać około 1 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr i delikatnie mieszać przez inwersję bez wirowania. Teraz użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić jedną 0,1-mikrometrową sterylną membranę hydrofilową poliwęglanową płasko na dnie każdego dołka w sterylnej płycie o pojemności 24 dołków i pokrywce. Do każdego dołka dodaj jeden mililitr sterylnego medium EMJH i namocz błonę przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie usuń roztwór moczeniowy z każdego dołka bez przesuwania błony i dodaj 1,5 mililitra rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej, zapewniając, że membrana pozostaje na miejscu na dnie. Następnie umieść tacę wypełnioną wodą wewnątrz inkubatora, aby utrzymać wilgotność. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w warunkach statycznych, aby umożliwić powstawanie biofilmu.

Zostawianie płyty na maksymalnie trzy tygodnie dla powoli rosnących szczepów. W pożądanym momencie ostrożnie zasysaj jak najwięcej medium kulturowego, nie naruszając biofilmu. Delikatnie przepłucz każdy dołek jednym mililitrem sterylnego PBS, utrzymując błonę płasko przy dnie.

Do każdego dołku należy dodać jeden mililitr 4% aldehydu paraformowego w PBS i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby utrwalić próbki biofilmu. Po inkubacji usuń utrwalacz i delikatnie przepłucz dwa razy jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr roztworu kryształowego fioletu o masie 0,1% objętości do każdego dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, upewniając się, że pokrywa jest całkowicie zanurzona.

Następnie wyrzuć barwnik fioletowy z każdego dołka i dwukrotnie przepłucz jednym mililitrem PBS. Przechyl płytę i opróżnij cały pozostały płyn. Pozostawić talerz w temperaturze pokojowej, aby wyschła na powietrzu, aż podłoże będzie wyglądać na całkowicie suche, najlepiej przez noc.

Następnie do każdego odwiertu dodaj 500 mikrolitrów buforu elucian składającego się z 50% etanolu i 50% kwasu octowego lodowcowego objętościowo. Pipetować w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić plamę związaną z biofilmem. Teraz przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki na optycznie przezroczystą mikropłytkę o pojemności 96 dołków.

Zmierz absorpcję na 570 nanometrów i odejmij wartości tła od nieosadzonych kontrol przetwarzanych na wszystkich etapach. Zanotuj średnią i odchylenie standardowe dla co najmniej trzech powtórzeń technicznych. Uzyskaj biofilmy na płytkach dołkowych, jak pokazano wcześniej.

Do dołków należy dodać roztwór 4% aldehydu paraformowego oraz 1% glutaraldehydu w buforze sodu 0,2 molowym o pH 7,4. Inkubuj ustalone próbki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń utrwalacz i dwukrotnie przepłucz próbkę PBS, aby zachować przymocowany biofilm na powierzchni i minimalizować odklejanie.

Następnie zanurz pokrywę w 1% rozcieńczonym czterotlenkiem osmu w PBS i inkubuj przez godzinę, aby poprawić kontrast skaningowej mikroskopii elektronowej. Następnie dwukrotnie opłukaj podłoże PBS. Próbki odwodnij, zanurzając je kolejno przez 10 minut każdą w serii etanolu z klasą stopniową.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów heksametylodylizany i inkubuj przez pięć minut. Następnie zamień je świeżym heksasametylodisilazanem i inkubuj przez dodatkowe pięć minut. Następnie usuń nadmiar roztworu i pozwól próbce całkowicie wyschnąć na powietrzu pod okapem oparowym.

Teraz zamontuj wysuszone próbki na odcinkach mikroskopii skaningowej za pomocą dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej. Preparat pokryj próbki cienką warstwą, około 10 nanometrów złota lub platyny, aby zwiększyć kontrast elektronów do obrazowania. Na koniec załaduj przygotowane fragmenty do skaningowego mikroskopu elektronowego za pomocą odpowiedniego uchwytu na próbkę.

Jeśli to możliwe, ewakuuj komorę na noc, aby poprawić jakość obrazowania. Następnie wykonaj obrazy elektronów wtórnych o napięciu od pięciu do 15 kilowoltów, używając odpowiednich powiększań, aby zobrazować ultrastrukturę biofilmu. Po 21 dniach inkubacji barwienie fioletowe kryształowe ujawniło widoczne wzory biofilmu zarówno na filtrach poliwęglanowych, jak i szklanych pokrywkach dla leptospira interrogan i leptospira biflexa.

Każdy gatunek wykazuje charakterystyczne ślady architektoniczne, takie jak kropkowate, rozgałęzione lub siatkowate formy. Pomiary absorpcji na 570 nanometrów potwierdziły większą retencję fioletów kryształów w biofilmach leptospira byflexa w porównaniu do interferana leptospira we wszystkich punktach czasowych, co wskazuje na wyższe nagromadzenie biomasy w szczepie. Skaningowa mikroskopia elektronowa biofilmów leptospira interrogan uchwyciła wczesne osady macierzy zewnątrzkomórkowej w trzydniowych biofilmach, dojrzałą i kanałowaną powierzchnię podstawową o trójwymiarowej strukturze po 14 dniach oraz w pełni rozwiniętą konsolidację macierzy o gęstej architekturze o 21 dniach.

Nasz zoptymalizowany protokół synchronizuje komplementarne odczyty z identycznych kultur, zwiększając odporność, zmniejszając zmienność oraz ujawniając informacje dynamiczne i strukturalne, dostępne przy użyciu podejść z jedną metodą. Poprzez integrację analizy komplementarnej, nasze wyniki standaryzowały ocenę biofilmu, wyjaśniając dynamikę i architekturę leptospiry. Łączą strukturę z zjadliwością i wzmacniają powtarzalne badania porównawcze.

Przyszłe mutanty połączą regulacje z morfologią i dynamiką biofilmu, wyjaśniając trwałość środowiskową oraz oceniając strategie zakłócające informacje o biofilmie lub sprzyjające rozprzestrzenianiu się.