Name: Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj modułowy protokół analizy biofilmów Leptospira łączący barwienie krystaliczne, mikroskopię konfokalną i SEM. Ta metoda standaryzuje ocenę biomasy i architektury biofilmów w badaniach nad chorobami zakaźnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe udzielone przez Fundusz Badawczy AXA w formie stypendium podoktorskiego (źródło: 15-AXA-PDOC-037), przez Instytut Pasteura Nowej Kaledonii (IPNC) oraz Uniwersytet Nowej Kaledonii (UNC) w ramach stypendium doktoranckiego oraz przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) w ramach grantu numer SPIraL-19-CE35-0006-01. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji ma na celu wyłącznie udokumentowanie materiałów użytych w procedurach eksperymentalnych. Takie odniesienia nie stanowią poparcia, rekomendacji ani wskazania zainteresowania komercyjnego przez Instytut Pasteur Nowej Kaledonii.

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurujących interesów finansowych ani niefinansowych. Wszyscy autorzy przeanalizowali i zatwierdzili to ujawnienie.

Protokół ten przedstawia modułowy i integracyjny sposób badania biofilmów Leptospira, integrując ilościową biomasę (fiolet kryształowy)9,27, dynamikę (kontrast fazowy poklatkowy), skład trójwymiarowy (konfokalna mikroskopia laserowa z celowanymi sondami)38, ultrastrukturę (skaningową mikroskopię elektronową) oraz ocenę funkcjonalną (infekcja chomika). Stosując tę samą serię hodowli w modułach, minimalizowane są efekty wsadowe, a w ramach eksperymentu umożliwiana jest walidacja krzyżowa, co jest szczególnie ważne dla wolno rosnących, delikatnych spirochetów. Każdy moduł uzupełnia pozostałe: CV ilościowo określa "ile", time-lapse pokazuje "jak szybko", CLSM ujawnia "co jest w środku", SEM rozstrzyga "jak jest zbudowany", a testy in vivo dostarczają "dowodu funkcji". Wprowadzenie L. biflexa pokazuje elastyczność w różnych gatunkach, podkreślając szybsze i gęstsze tworzenie biofilmu oraz podkreślając elastyczność metodologiczną35.
Sukces każdego modułu zależy od jakości inokulum i stanu fizjologicznego. Kultury planktoniczne w połowie logu (3-5 dni), bardzo ruchome i wolne od kruszyw, dają powtarzalną adhezję i rozwój biofilmu. Należy stosować jedynie izolaty o niskim przepuszczeniu, aby zapewnić solidne tworzenie i powtarzalność biofilmu.
Analiza CV opiera się na procesie pracy dzięki szybkości, skalowalności i przepustowości 9,27. Umożliwia szybkie badanie mutantów, mediów lub związków antybiofilmowych. Jednak ponieważ biofilmy Leptospira są delikatne i niejednorodne, delikatna manipulacja i weryfikacja replik są niezbędne. CV nie potrafi rozróżnić architektur kompaktowych od porowatych ani wykryć składania macierzy — stąd jego rola jako bramki przesiewowej dla głębszych analiz strukturalnych.
Obrazowanie poklatkowe niweluje tę lukę, ujawniając kinetykę biofilmu w czasie rzeczywistym. Rejestruje on proces wyłaniania się, zlewania i unieruchamiania agregatów ruchomych, ujawniając zjawiska przejściowe, których testy końcowe pomijają. Stabilność środowiskowa (temperatura, wilgotność, autofokus) jest kluczowa. Te nagrania wykazały, że nawet gdy biomasa CV wydaje się stabilna, dynamika może się rozbieżać — wskazując na przekształcenia strukturalne lub utratę żywotności w głębszych warstwach.
CLSM dostarcza wglądu w objętość i chemię bez artefaktów odwodnienia39. Barwienie żywe/martwe ujawnia gradienty żywotności komórek w biofilmie, co jest zgodne z doniesieniami o ograniczonej dyfuzji tlenu i stratyfikacji metabolycznej 6,40. Lektyny i barwniki kwasów nukleinowych ujawniają obfitość DNA zewnątrzkomórkowego oraz specyficznych motywów glikanowych, co pozwala na ilościową identyfikację i charakteryzację składników matrycy41,42. Dane CLSM często ujawniają wewnętrzne pustki, co odzwierciedla zbiorowe przearanżowania widoczne w time-lapse38. Ograniczenia obejmują jednak specyficzność sondy, fotobielenie oraz rozdzielczość osiową ograniczoną dyfrakcją; Dlatego ustawienia mikroskopu i wydajność barwnika powinny być standaryzowane i testowane wcześniej, aby zapewnić wiarygodne, porównywalne wyniki w różnych eksperymentach.
SEM oferuje komplementarną rozdzielczość ultrastrukturalną43. Na wczesnych etapach rozwiązuje się początkujące agregaty; W dojrzałości (≈ 15-21 dni) ujawnia spolaryzowaną architekturę: szorstką, kanałowaną warstwę podstawową do kotwiczenia i wymiany oraz gładką, wierzchołkową powierzchnię bogatą w matrycę37. Ostrożna fiksacja, suszenie HMDS oraz korelacja z danymi konfokalnymi łagodzą artefakty spowodowane odwodnieniem lub zapadaniemsię 44.
Razem te cztery moduły umożliwiają wewnętrzną walidację krzyżową: gdy CV, CLSM i SEM się zbiegają, wnioski są solidne; Gdy się rozchodzą, same rozbieżności są pouczające – ujawniając na przykład zwiększoną biomasę przy zmniejszonej żywotności lub niezmienioną biomasę ze zmienionym składem matrycy.
Pozostało kilka wewnętrznych ograniczeń. Biofilmy Leptospiry są niejednorodne i delikatne, co czyni je wrażliwymi na dotykanie i odwodnienie. CV integruje całkowitą biomasę, ale nie żywotność16; CLSM nie może przekraczać limitów optycznych38; SEM ryzykuje artefakty przygotowawcze. Śmiertelność w głębszych warstwach jest spodziewana ze względu na gradienty tlenu6, ale to ukierunkowanie jest systematyczne i porównywalne w różnych warunkach. Dojrzewanie biofilmu osiąga plateau około 15-21 dni, związane z transkrypcyjnymi sygnaturami ograniczenia składników odżywczych36. Późniejsze etapy pozostają słabo scharakteryzowane.
Testy in vivo dostarczają kontekstu funkcjonalnego. Wstrzykiwanie agregatów wewnątrzotrzewnowkowo sprawdza, czy komórki pochodzące z biofilmu różnią się pod względem zjadliwości czy trwałości w porównaniu z odpowiednikami planktonicznymi. Chociaż inokulacja wewnątrzotrzewnowkowa nie jest naturalną drogą, oferuje kontrolowany model porównawczy36. Heterogeniczność agregatu wprowadza pewną zmienność, ale konsekwentne traktowanie i dopasowany rozmiar inokulum łagodzą ten problem. Co istotne, cechy trwałości biofilmu (np. tolerancja na stres wywołana przez ECM) niekoniecznie przekładają się na zwiększoną ostrą zjadliwość, co podkreśla ekologiczną, a nie patogeniczną rolę powstawania biofilmu24.
Modułowa konstrukcja umożliwia skalowalne użytkowanie. Do szybkiego testu wystarczy CV i time-lapse. Dla wglądu mechanistycznego CLSM i SEM dodają rozdzielczość kompozycyjną i architektoniczną. Moduły mogą integrować zaburzenia enzymatyczne lub chemiczne (DNaza, glikozydaza), alternatywne sondy glikany lub kwasy nukleinowe, a także systemy mikrofluidyczne do testowania odpowiedzi przepływu. To samo inokulum może zasilać analizy transkryptomiczne lub proteomiczne, bezpośrednio łącząc fenotyp biofilmu z regulacją (np. sygnalizacja c-di-GMP, reakcja głodowa). Ramy te umożliwiają również badania przesiewowe mutantów, testy perturbacji środowiskowych oraz ocenę związków antybiofilmowych lub przeciwwirusowych.
Ten zintegrowany przepływ pracy przekształca izolowane obserwacje w spójne, wielowymiarowe zrozumienie biofilmów Leptospira. Łącząc przepustowość (CV), dynamikę (time-lapse), chemię i głębię (CLSM) oraz ultrastrukturę (SEM), podejście to wiernie oddaje mobilną, porowatą i spolaryzowaną naturę społeczności Leptospira. Rozszerzając wcześniejsze badania 17,35,36, pokazuje, że skoordynowana, modułowa eksperymentacja ujawnia zjawiska niewidoczne dla badań jednometodowych — takie jak rosnąca biomasa mimo spadku żywotności czy rozbieżna kinetyka między gatunkami. Ostatecznie to podejście wspiera analizy porównawcze, powtarzalne i funkcjonalnie istotne dla gatunków, mutantów i schorzeń, stanowiąc podstawę dla mikrobiologii mechanicznej, odporności ekologicznej oraz projektowania strategii antybiofilmowych.

Biofilmy to ustrukturyzowane społeczności mikrobiologiczne, w których komórki są osadzone w matrycy samowydzielającej się zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS) złożonej z polisacharydów, białek, kwasów nukleinowych i lipidów1. Ta matryca zapewnia stabilność mechaniczną, pośredniczy w adhezji do powierzchni i zwiększa przeżywalność mikroorganizmów, zapewniając odporność na stresy środowiskowe, takie jak wysychanie, stres oksydacyjny i środki przeciwdrobnoustrojowe 2,3. W bakteriach patogennych biofilmy ułatwiają trwałość, unikanie odporności oraz przewlekłe infekcje 4,5.
W porównaniu z komórkami planktonicznymi, które są swobodnie pływające i metabolicznie bardziej jednorodne, komórki związane z biofilmem wykazują zmienioną ekspresję genów, tempo wzrostu i aktywność metaboliczną6. Te różnice zapewniają zwiększoną tolerancję na wyzwania środowiskowe, antybiotyki i mechanizmy obronne gospodarza, jednocześnie umożliwiając skoordynowane zachowania, takie jak wykrywanie kworum, zatrzymywanie składników odżywczych i organizacja przestrzenna 7,8.
Formowanie biofilmu zostało szeroko scharakteryzowane u organizmów modelowych takich jak Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Vibrio cholerae, które wspólnie ukształtowały nasze rozumienie genetycznych, strukturalnych i fizjologicznych podstaw stylu życia opartego na biofilmie. Badania nad Pseudomonasem wykazały, że egzopolisacharydy i detekcja kworum współdziałają, kształtując złożone trójwymiarowe architektury biofilmu 9,10. Badania nad gronkowcem podkreślają rolę białek powierzchniowych i DNA zewnątrzkomórkowego w poprawie kohezji biofilmu i tolerancji na antybiotyki 11,12. Badania gatunków Vibrio dodatkowo uwypukliły niezwykłą różnorodność morfologii biofilmów oraz ich znaczenie ekologiczne w środowiskach wodnych¹³. Łącznie systemy te zapewniły solidne ramy koncepcyjne i metodologiczne dla badań nad biofilmem, wzmocnione przez standaryzowane protokoły14 oraz krytyczne oceny istniejących technik15,16, które razem podkreślają potrzebę zharmonizowanych podejść przy badaniu powstawania biofilmu u mniej zbadanych bakterii, takich jak Leptospira.
Członkowie rodzaju Leptospira z rodziny przełomkowatych, będących czynnikami powodującymi leptospirozę, byli przez długi czas uznawani za przeważnie planktoniczne. Najnowsze badania wykazały eksperymentalnie solidne tworzenie biofilmu u wielu gatunków17. Podczas gdy niektóre badania sugerują powstawanie biofilmu w środowiskowych18 i powiązanych z gospodarzem kontekstach19, inne eksperymentalnie wykazały zdolność leptospirów do tworzenia biofilmu w kanalikach nerkowych Rattus norvegicus20 oraz w skórze szklistej koni21, a także wykrywanie gatunków leptospiralnych w biofilmach środowiskowych22,23. Rozszyfrowanie warunków i mechanizmów rządzących biofilmami Leptospira jest zatem kluczowe dla zrozumienia transmisji środowiskowej, trwałości rezerwuarów oraz patogenezy chorób 24,25.
Istniejące testy biofilmu Leptospira są fragmentaryczne, obejmujące jakościowe obserwacje mikroskopowe17,26 po kolorymetryczne lub kryształowe barwienia fioletowe27,28. Chociaż badania te dostarczyły cennych informacji na temat powstawania biofilmu, często brakuje im zarówno rozdzielczości kinetycznej potrzebnej do monitorowania dojrzewania i rozprzestrzeniania biofilmu w czasie rzeczywistym, jak i ultrastrukturalnego kontekstu zapewnianego przez mikroskopię konfokalną lub elektronową. Ciągły monitoring i analiza strukturalna 3D są uważane za niezbędne do uchwycenia dynamicznego charakteru powstawania i rozprzestrzeniania biofilmu14,15. Te ograniczenia utrudniają porównywalność między badaniami i ograniczają systematyczną ocenę czynników lub interwencji wpływających na powstawanie i rozprzestrzenianie biofilmu, co podkreśla potrzebę ustandaryzowanego, wieloodczytowego workflow, który w sposób powtarzalny i kompleksowy obejmuje zarówno dynamikę strukturalną, jak i funkcjonalną biofilmu Leptospira biofilm.
Aby wypełnić te luki, opracowaliśmy zintegrowany, modułowy workflow, który łączy sześć uzupełniających się odczytów pochodzących z tej samej serii kultur. Po pierwsze, wysokoprzepustowy test mikromiarek CV ilościowo określa przyłączoną biomasę w wielu punktach czasowych. Po drugie, przeprowadzono test frakcjonacyjny o rozdzieleniu czasowym w 96-dołkowych płytach podziałowych całkowitych, w fazie ciekłej (nieprzyłączonej lub częściowo odłączonej) oraz (biofilm) populacji według OD₄₀₅, aby śledzić ich ewolucję podczas formowania się i rozpraszania. Termin faza ciecza używany jest tutaj zarówno do komórek planktonicznych, jak i odłączonych, uznając dynamiczny kontinuum między fenotypami wolno żyjącymi a powierzchniowymi29,30. Po trzecie, obrazowanie fazowe z kontrastem poklatkowym zapewnia nieniszczycielską kinetykę adhezji, ruchliwości agregatu i koalescencji. Po czwarte, konfokalna mikroskopia laserowo-skaningowa (CLSM) pozwala na pełne rekonstrukcje 3D z odczytami żywymi/martwymi oraz sondami matrycowymi, umożliwiając żywotność zależną od głębokości i mapowanie macierzy. Po piąte, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wspierana przez membranę lub pokrywę umożliwia rozdzielczość architektury zewnątrzkomórkowej oraz polaryzacji podstawowo-wierzchołkowej w wysokiej rozdzielczości. Ponadto włączono moduł in vivo do oceny zjadliwości za pomocą intraperitonealnego wstrzyknięcia agregatów biofilmu do modelu wrażliwego złotego chomika syryjskiego, wrażliwego i dobrze ugruntowanego modelu leptospirozy 31,32,33. To podejście łączy fenotypy biofilmu z potencjałem patogennym, dostarczając kontekstu funkcjonalnego, który uzupełnia analizy in vitro.
W porównaniu z podejściami jednomodalnymi, platforma ta oferuje kilka zalet: (i) zsynchronizowane odczyty ilościowe (CV i frakcjonowane OD) oraz strukturalne (CLSM/SEM); (ii) nieniszczącym monitorowaniem kinetycznym wczesnej adhezji, wzrostu, dojrzewania i rozprzestrzeniania się; (iii) żywotność 3D i charakterystyka macierzy z użyciem sond ukierunkowanych; (iv) ultrastrukturalną wizualizację architektury macierzy zewnątrzkomórkowej; oraz (v) bezpośrednią ocenę funkcjonalną zjadliwości związanej z biofilmem w porównaniu z planktonową w modelu chomika podatnego, co jest możliwe do osiągnięcia przy standardowej infrastrukturze BSL-2. Wykorzystując formaty wielostudniowe oraz wymienne podłoża szklane lub poliwęglanowe, workflow umożliwia replikację przesiew zmiennych środowiskowych, związków przeciwdrobnoustrojowych lub bibliotek mutantów, jednocześnie utrzymując bezpłodność, przepustowość i walidację krzyżową między modułami.
Laboratoria skupione na ekologii, trwałości, interakcjach gospodarz-patogen lub odkrywaniu antybiofilmu mogą przyjmować pojedyncze moduły lub cały pipeline. Wymagane zasoby ograniczają się do czytnika płyt, mikroskopu odwróconego z kontrolą środowiskową dla poklatkowego pomiaru czasu, dostępu do mikroskopu konfokalnego i urządzenia SEM oraz standardowych obiektów zwierzęcych dla modelu chomika, co umożliwia szerokie wdrożenie i powtarzalne porównania w różnych badaniach.

<table><tbody><tr><td>0,1 & mikro; M Sterylna Hydrofilowa Membrana Poliwęglanowa</td><td>it4IP</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szklana pokrywa 12 mm</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% paradehydu (PFA) &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Igła 21G</td><td>BD Medical</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka 24-dołkowa</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie o szklanym dnie 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>Szklane dno 35 mm Hi-Q4</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka 96-dołkowa</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie antyfade medium&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka węglowa</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>Śladnik CFDA/SE</td><td>Biolegenda</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Przewodzący klej węglowy</td><td>Nauka o mikroskopii elektronowej</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>Kryształowy fiolet (CV)</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ciemnego pola</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B wyposażona w kondensator dark fiel (katalizator n&stupień; 11505142)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowcowy</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glutaraldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Heksametyldisilazana</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>Mikroskop konfokalny SP8</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop wyposażony w optykę fazową z kontrastem</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>Leptospira Medium Base EMJH &nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&nbsp; 279410</td><td>Medium EMJH dla Leptospiry</td></tr><tr><td>Czterotlenek osmu (OsO4) &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodek & nbsp;</td><td>Biot</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylatan sodu&nbsp;</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Varioskan Lux</td><td>Thermo Scientific</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 mL)</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9 zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów leptospira

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

Przedstawiamy tutaj zintegrowany zestaw protokołów do hodowli, monitorowania ilościowego, charakteryzacji strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira spp. w czasie. Ten workflow łączy mikromiatrowe testy kryształowego fioletu do pomiaru biomasy biofilmu w wielu punktach czasowych, z podejściem frakcjonowania czasowo, które rozróżnia populacje bakterii przyłączonych (biofilm) i nieprzyłączonych (faza ciekłą), obrazowanie poklatkowe fazowe do nieniszczącej obserwacji kinetycznej, konfokalną mikroskopię laserową do generowania pełnych rekonstrukcji 3D z odczytami sond matrycowych oraz mikroskopię skaningową wspieraną przez membranę do analizy ultrastrukturalnej. Równolegle szczegółowo przedstawiamy ustandaryzowaną procedurę pozyskiwania nienaruszonych agregatów biofilmu i przygotowania ich do iniekcji wewnątrzotrzewnowej do modelu wrażliwego złotego chomika syryjskiego, umożliwiając bezpośrednią ocenę zjadliwości związanej z biofilmem in vivo obok dopasowanych kontrol planktonu.
Zoptymalizowany pod patogenny szczep Leptospira interrogans Manilae L495, każdy moduł jest łatwo przenoszony do innych gatunków i bibliotek mutantów Leptospira w celu porównania zdolności do tworzenia biofilmu. Razem te skoordynowane moduły stanowią solidne podstawy do analizy strategii antybiofilmowych, badania determinantów genetycznych oraz wyjaśniania wkładu biofilmów w trwałość i patogenezę Leptospiry .

Gdy inokulum jest prawidłowo przygotowane, hodowle wchodzą w fazę środkową logariażu w ciągu 3-5 dni i wykazują wartości OD405 ~ 0,2-0,4 przy jasnych, bardzo ruchomych polach pod mikroskopią ciemnego pola (≥ 90% komórek ruchomych) i bez widocznych grudek. Preparaty nieoptymalne objawiają się ospałymi bakteriami i niejednorodną ruchliwością w całym polu; Takie kultury często dają słabe biofilmy i powinny być wyrzucane. W praktyce potwierdzenie ruchliwości i przedawkowania obok siebie tuż przed siewem minimalizuje liczbę nieudanych występów. Ustanowienie tych bram kontroli jakości na etapie inokulum jest najlepszym wskaźnikiem sukcesu we wszystkich dalszych zastosowaniach. Chociaż metodologia została zoptymalizowana dla L. interrogans serovar Manilae L495, te same procedury zastosowano także do szczepu Leptospira biflexa Patoc, aby wykazać zastosowanie międzygatunkowe. L. biflexa zazwyczaj tworzy mniej spójne i cieńsze biofilmy w porównaniu do L. interrogans, jednak charakterystyczne cechy sekwencji rozwojowej i strukturalne pozostają wykrywalne przy odpowiednich korektach parametrów. Włączenie obu gatunków podkreśla zatem zdolność procesu do patogennych i saprofitycznych Leptospira .
Po 21 dniach statycznej inkubacji w temperaturze 30 °C w nawilżonej komorze (lub odpowiednim czasie dla stosowanego gatunku Leptospira ), biofilmy stają się widoczne gołym okiem zarówno na szklanych pokrywkach, jak i hydrofilowych membranach poliwęglanowych. Udany wzrost po 2-3 tygodniach prowadzi do charakterystycznych wzorców CV, takich jak kropkowate, rozgałęzione lub siatkowate ślady przymocowane do powierzchni (Rysunek 2A).
W typowym biegu dzikie typy L. interrogan Manilae L495 osiągają ~ 50% pokrycia powierzchni do 3. tygodnia, podczas gdy u mutantów o niskiej zawartości biofilmu zatrzymują się na poziomie blisko ~ 20%, a fenotypy o wysokiej zawartości biofilmu zbliżają się do ~70-80%, co ustanawia praktyczny zakres dynamiczny do przesiewu. Zakres tworzenia biofilmu może się również różnić w zależności od gatunku i szczepu Leptospira ; na przykład szczep L. biflexa Patoc szybciej wytwarza widoczne biofilmy, a wcześniejsze badania uznawały struktury już 120 godzin po inokulacji za dojrzałe biofilmy35.
Barwienie kryształowego fioletu stanowi niezawodną i powtarzalną metodę ilościowego określania biomasy biofilmu. W dobrze rozwiniętych biofilmach barwienie powoduje głębokie fioletowe ubarwienie lokalizowane na powierzchni pokrywy lub błonie, co wskazuje na wysoki poziom przyłączonej biomasy (Rysunek 2A). Wskazówki wizualne podczas fazy barwienia i rozpuszczania również stanowią użyteczne wskaźniki sukcesu protokołu. Na przykład nierównomierne rozmieszczenie CV lub blade barwienia mogą być spowodowane niedosiewem, parowaniem lub agresywnym płukaniem powodującym odłączanie wczesnych biofilmów.
Odczyty absorpcji przy 570 nm odzwierciedlają ilość zatrzymanej barwnicy, a tym samym względną gęstość biofilmu (Rysunek 2B). W eksperymentach reprezentatywnych hodowle L. interrogans, hodowane w optymalnych warunkach, wykazują spójne i powtarzalne odczyty OD₅₇₀ w powtórkach, co odzwierciedla stabilną formację biofilmu. Natomiast duże różnice między replikami często obserwuje się, gdy próbki poddawane są nadmiernemu pipetowaniu podczas zmian medium, co wskazuje na słabą przyczepność lub częściowe odwarstwienie biofilmu. Taka zmienność powinna być traktowana jako oznaka problemów technicznych, a dotknięte próbki powinny być wyłączone lub procedura dokładnie przeanalizowana. Warto zauważyć, że L. biflexa Patoc tworzy bardziej rozbudowane biofilmy zarówno na szklanych pokrywkach, jak i membranach poliwęglanowych w podobnych warunkach, co odzwierciedla wyższe wartości absorpcji CV, co pokazuje, że protokół jest adaptowalny i skuteczny we wszystkich gatunkach Leptospira .
Udane przygotowanie SEM pozwala ujawnić osady macierzy zewnątrzkomórkowej już w trzecim dniu, po czym następuje uderzająco spolaryzowana architektura w dojrzałych biofilmach: szorstka, kanałowana powierzchnia podstawowa (często z kanałami &gt; 5 μm), która kotwiczy porowatą strukturę wewnętrzną, oraz gładsza wierzchołkowa ściana, gdzie przełetki leżą splecione w gęstej matrycy (Rysunek 2C, D, E, F). Pola o dużym powiększeniu często rejestrują rozgałęzione włókna zewnątrzkomórkowe oraz okazjonalne grzybowate wypustki; cechy odpowiadające dynamice koalescencji obserwowanej przez timelapse (Wideo uzupełniające 1). W nieoptymalnych przygotowaniach można zaobserwować zwinięte macierze, naładowanie i niewyraźne kontury komórek, zwykle świadczące o niewystarczającym postfiksacji, niewystarczającej warstwie przewodzącej lub słabym schnięciu. Gdy widoczna jest polaryzacja bazalno-wierzchołkowa oraz wszechobecne kanały, odczyty SEM są ściśle zgodne z konfokalnymi szacunkami grubości i porowatości, potwierdzając pomyślne wykonanie zarówno przygotowania, jak i obrazowania.
W efektywnych seriach poklatkowych izolowane punkty pojawiają się w ciągu 24-72 godzin i stopniowo łączą się w większe agregaty, które przesuwają się po powierzchni, zanim ograniczenia przestrzeni spowolnią ich ruch (Rysunek 3A, B, C). Segmentacja ilościowa powoduje monotoniczny wzrost całkowitego obszaru objętości, podczas gdy suma rośnie, szczytuje, a następnie maleje, gdy kolizje i połączenia dominują między ~12 a 216 godzinami. Kinetyka ta (powierzchnia w górę, liczba agregatów w dół) wskazuje na aktywną akrecję, a nie na prostą sedymentację. Nieudane lub graniczne przejazdy nie mają wczesnych punktów punktowych, pokazują płaskie krzywe powierzchniowe w czasie lub cierpią na dryf ostrości związany z niestabilną temperaturą/wilgotnością. Utrzymanie stabilnego środowiska o temperaturze 30 °C przy wilgotności 95% oraz stosowanie autofokusa w każdym momencie zazwyczaj przywraca wyraźne trajektorie odpowiednie do porównywania mutantów lub zabiegów.
Reprezentatywne stosy Z z dojrzałych biofilmów wykazują pianowate, wielowarstwową architekturę zwykle przekraczającą 50 μm grubości, z większością komórek barwiących się żywo (SYTO 9-dodatnie) oraz sporadycznymi centralnymi pustkami wskazującymi na zbiorowe przemianowania podczas wzrostu (Rysunek 3D). Sondy matrycowe mogą być wykorzystywane do badania składu matrycy: WGA podkreśla epitopy polisacharydów, BOBO-3 oznacza obfitość DNA zewnątrzkomórkowego, a barwienia selektywne na białko dostarczają niewielki sygnał związany z komórką zewnętrzną (Rysunek 3E). Wyniki suboptymalne obejmują cienkie lub nieciągłe stosy zdominowane przez jodek propidiu, silne fotoblajchowanie lub niespójne ustawienia wzmocnienia, z których każdy podważa porównywalność ilościową. Interpretacja grubości, objętości biologicznej oraz stosunków żywych do martwych (przy jednoczesnym utrzymaniu stałej mocy lasera, wzmocnienia detektora i dziurki w różnych warunkach) potwierdza status dojrzewania i wspiera bezpośrednie porównania z ultrastrukturą SEM i biomasą CV.
Proces tworzenia biofilmu u Leptospira zazwyczaj przebiega według wyraźnych faz, choć dokładne czasy i wartości mogą się różnić w zależności od gatunku lub szczepu. Korzystając ze szczepu L. interrogans Manilae L495 jako odniesienia, przewidywana progresja przez 21 dni obejmuje początkową fazę (dni 0-3), podczas której bakterie pozostają głównie planktoniczne, z minimalnym biofilmem (Rysunek 4A). Następnie następuje wykładnicza faza wzrostu (dni 3-7), podczas której zarówno bakterie planktonowe, jak i związane z biofilmem zwiększają wzrost, osiągając około 9 x 10⁸ komórek/mL, a towarzyszy im tworzenie i rozszerzanie agregatów biofilmu. Między dniem 7 a 12 bakterie planktoniczne znacząco spadają na spadek, podczas gdy komórki związane z biofilmem osiągają szczyt, stanowiąc około 80% populacji. Wreszcie, w fazie dojrzewania (dni 12-21) liczba bakterii biofilmowych maleje bez wzrostu liczby komórek planktonowych, a jednak rozmiar i złożoność biofilmu nadal rosną. Obserwowanie tej sekwencji zmian wskazuje, że protokół skutecznie rejestruje dynamiczny rozwój i dojrzewanie biofilmów Leptospira .
Jeśli jest prawidłowo przeprowadzany, protokół infekcji wykorzystuje inokule zawierające ~2 x 10⁸ leptospiry w 200 μL EMJH, przygotowane z dobrze zdefiniowanych hodowli planktonu (5-dniowe) lub biofilmowego (21-dniowe). Chociaż te dwa typy hodowli reprezentują odrębne stany fizjologiczne, różnica ta jest celowa, ponieważ eksperyment ma na celu ustalenie, czy biofilmy Leptospira — charakteryzujące się obniżoną aktywnością metaboliczną i zróżnicowaniem strukturalnym — zachowują zdolność do inicjowania infekcji. Ten kontrast potwierdzają badania transkryptomiczne pokazujące istotne zmiany w ekspresji genów między planktoniczną a biofilmem Leptospira 35,36. Agregaty biofilmowe są starannie pozyskiwane, aby zachować ich strukturę i pozostać nienaruszone po przejściu przez igłę 21 G, co potwierdzono przed wstrzyknięciem (Rysunek 4C, D). Po wstrzyknięciu dootrzewnewkowym, złote chomiki syryjskie zazwyczaj wykazują kliniczne objawy leptospirozy w ciągu 3 do 5 dni (np. ospałość, potargane futro, pokłon). Negatywne kontrole, które podawano wyłącznie podłoże EMJH, nie wykazują oznak choroby. Przebieg i nasilenie objawów klinicznych, a także czas do eutanazji, różnią się w zależności od inokulum: bakterie planktoniczne często wywołują wcześniejsze i bardziej ostre objawy, podczas gdy agregaty pochodzące z biofilmu mogą powodować opóźnione, lecz utrzymujące się zakażenie (Rysunek 4B). Monitorowanie dwa razy dziennie przez okres do 21 dni pozwala uchwycić pełny przebieg choroby.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Barwienie fioletowe, ilościowe i ultrastrukturalne obrazowanie biofilmów Leptospira. (A) Barwienie kryształowym fioletem (CV) biofilmów uprawianych na różnych podłożach. Barwienie CV pozwala na wizualizację architektury biofilmu oraz początkowych wzorców przyczepienia dla różnych gatunków i podłoży. i. L. interrogan na filtrze poliwęglanowym; ii. L. biflexa na filtrze poliwęglanowym; iii. L. interrogansa na szklanej pokrywce; iv. L. biflexa na szklanej pokrywce. (B) Przykład ilościowego powstawania biofilmu ocenianego przez absorpcję CV (OD570 nm) w czasie dla L. interrogans i L. biflexa. Ten odczyt kinetyczny rejestruje zarówno wczesną adhezję, jak i dynamikę akumulacji biomasy, podkreślając różnice w wzroście biofilmu między gatunkami patogenicznymi a saprofitycznymi. Ilustracja ta została zmodyfikowana na podstawie27. (C-E) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) biofilmów L. interrogans: (c) 3-dniowy biofilm pokazujący wczesne powstawanie mikrokolonii i początkowe osadzanie macierzy zewnątrzkomórkowej; (d) 14-dniowy biofilm prezentujący dojrzałą architekturę z rozległą organizacją matrycową i trójwymiarową; (e-f) 3-tygodniowy biofilm ilustrujący konsolidację strukturalną i dojrzewanie macierzy podczas długotrwałej hodowli. To połączenie barwienia CV, ilościowych pomiarów przedawkowania oraz obrazowania SEM zapewnia kompleksowy przegląd rozwoju biofilmu, od wczesnego przyłączenia po dojrzałą organizację ultrastrukturalną, umożliwiając bezpośrednie porównania między gatunkami i okresami trwania hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja powstawania biofilmu Leptospira .Obrazy z kontrastem fazowym uzyskane za pomocą BioStation pokazują wywoływanie biofilmu w (A) 48 h, (B) 96 h i (C) 144 h. (D) rekonstrukcja CLSM biofilmu Leptospira pokazująca całkowitą objętość biofilmu z ortogonalnymi fragmentami do wizualizacji 3D. (E) Konfokalne barwienie dojrzałego biofilmu DAPI (zielony) i WGA (czerwony), podkreślające komórki bakteryjne i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta liczba została zmieniona z37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4. Ilościowa definicja w czasie frakcji planktonu i biofilmu oraz funkcjonalna ocena biofilmów Leptospira .(A) Kinetyka powstawania biofilmu mierzona przez absorpcję przy 405 nm. Dla każdego punktu czasowego pobierano odczyty z całkowitej studni, ułamku biofilmu oraz supernatantu zawierającego leptospiry planktonowe, co pozwalało rozróżnić bakterie przyczepione i swobodnie pływające. (B) Przykładowe krzywe przeżycia chomików wstrzykniętych agregatami biofilmu, leptospirów planktonowych lub kontroli EMJH. Zwierzęta poddane biofilmowi wykazują zmniejszoną zjadliwość, niektóre przeżywają aż 21 dni, podczas gdy leptospiry planktonowe powodują szybką śmiertelność. (C-D) Wstępna walidacja integralności biofilmu: kruszywa są widoczne w strzykawce przed wstrzyknięciem (C) i pozostają nienaruszone po przejściu przez igłę 21 G (D, białe strzałki), co potwierdza, że struktura biofilmu jest zachowana podczas manipulacji. Ta liczba została zmieniona z36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Here, we present an integrated suite of protocols for the cultivation, quantitative monitoring, structural and functional characterization of Leptospira ...

Badamy biofilmy jako struktury ochronne umożliwiające przetrwanie środowiska i gospodarza, badając dynamikę powstawania, skład molekularny, cechy adaptacyjne oraz wkład w infekcję. Połączenie bioanalizy kryształowej, obrazowania tekstu czasowego, mikroskopii konfokalnej, skaningowej mikroskopii elektronowej i transkryptomiki w naszych laboratoriach przyczynia się do rozwoju badań nad biofilmem dzięki zintegrowanej analizie wielowymiarowej. Na początek hoduj komórki Leptospiry w podłożu EMJH w szklanych rurkach z płaskodenną śrubą i nakrętką.Inkubuj hodowle w warunkach tlenowych w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez potrząsania, aż osiągną fazę średnią logarytmiczną. Upewnij się, że hodowle osiągają gęstość optyczną między 0,2 a 0,4 na 405 nanometrach, co odpowiada od dwóch do pięciu razy 10 do mocy ośmiu komórek na mililitr. Używając mikroskopu ciemnego pola przy powiększeniu 20x, sprawdź, czy komórki są modalne, a nie zlepione.Rozcieńcz zweryfikowaną hodowlę arytmiczną w średnim logarytmie w stosunku 1 do 100 w świeżym podłożu EMJH, aby uzyskać około 1 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr i delikatnie mieszać przez inwersję bez wirowania. Teraz użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić jedną 0,1-mikrometrową sterylną membranę hydrofilową poliwęglanową płasko na dnie każdego dołka w sterylnej płycie o pojemności 24 dołków i pokrywce. Do każdego dołka dodaj jeden mililitr sterylnego medium EMJH i namocz błonę przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Następnie usuń roztwór moczeniowy z każdego dołka bez przesuwania błony i dodaj 1,5 mililitra rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej, zapewniając, że membrana pozostaje na miejscu na dnie. Następnie umieść tacę wypełnioną wodą wewnątrz inkubatora, aby utrzymać wilgotność. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w warunkach statycznych, aby umożliwić powstawanie biofilmu.Zostawianie płyty na maksymalnie trzy tygodnie dla powoli rosnących szczepów. W pożądanym momencie ostrożnie zasysaj jak najwięcej medium kulturowego, nie naruszając biofilmu. Delikatnie przepłucz każdy dołek jednym mililitrem sterylnego PBS, utrzymując błonę płasko przy dnie.Do każdego dołku należy dodać jeden mililitr 4% aldehydu paraformowego w PBS i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby utrwalić próbki biofilmu. Po inkubacji usuń utrwalacz i delikatnie przepłucz dwa razy jednym mililitrem PBS. Dodaj jeden mililitr roztworu kryształowego fioletu o masie 0,1% objętości do każdego dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, upewniając się, że pokrywa jest całkowicie zanurzona.Następnie wyrzuć barwnik fioletowy z każdego dołka i dwukrotnie przepłucz jednym mililitrem PBS. Przechyl płytę i opróżnij cały pozostały płyn. Pozostawić talerz w temperaturze pokojowej, aby wyschła na powietrzu, aż podłoże będzie wyglądać na całkowicie suche, najlepiej przez noc.Następnie do każdego odwiertu dodaj 500 mikrolitrów buforu elucian składającego się z 50% etanolu i 50% kwasu octowego lodowcowego objętościowo. Pipetować w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić plamę związaną z biofilmem. Teraz przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki na optycznie przezroczystą mikropłytkę o pojemności 96 dołków.Zmierz absorpcję na 570 nanometrów i odejmij wartości tła od nieosadzonych kontrol przetwarzanych na wszystkich etapach. Zanotuj średnią i odchylenie standardowe dla co najmniej trzech powtórzeń technicznych. Uzyskaj biofilmy na płytkach dołkowych, jak pokazano wcześniej.Do dołków należy dodać roztwór 4% aldehydu paraformowego oraz 1% glutaraldehydu w buforze sodu 0,2 molowym o pH 7,4. Inkubuj ustalone próbki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń utrwalacz i dwukrotnie przepłucz próbkę PBS, aby zachować przymocowany biofilm na powierzchni i minimalizować odklejanie.Następnie zanurz pokrywę w 1% rozcieńczonym czterotlenkiem osmu w PBS i inkubuj przez godzinę, aby poprawić kontrast skaningowej mikroskopii elektronowej. Następnie dwukrotnie opłukaj podłoże PBS. Próbki odwodnij, zanurzając je kolejno przez 10 minut każdą w serii etanolu z klasą stopniową.Następnie dodaj 500 mikrolitrów heksametylodylizany i inkubuj przez pięć minut. Następnie zamień je świeżym heksasametylodisilazanem i inkubuj przez dodatkowe pięć minut. Następnie usuń nadmiar roztworu i pozwól próbce całkowicie wyschnąć na powietrzu pod okapem oparowym.Teraz zamontuj wysuszone próbki na odcinkach mikroskopii skaningowej za pomocą dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej. Preparat pokryj próbki cienką warstwą, około 10 nanometrów złota lub platyny, aby zwiększyć kontrast elektronów do obrazowania. Na koniec załaduj przygotowane fragmenty do skaningowego mikroskopu elektronowego za pomocą odpowiedniego uchwytu na próbkę.Jeśli to możliwe, ewakuuj komorę na noc, aby poprawić jakość obrazowania. Następnie wykonaj obrazy elektronów wtórnych o napięciu od pięciu do 15 kilowoltów, używając odpowiednich powiększań, aby zobrazować ultrastrukturę biofilmu. Po 21 dniach inkubacji barwienie fioletowe kryształowe ujawniło widoczne wzory biofilmu zarówno na filtrach poliwęglanowych, jak i szklanych pokrywkach dla leptospira interrogan i leptospira biflexa.Każdy gatunek wykazuje charakterystyczne ślady architektoniczne, takie jak kropkowate, rozgałęzione lub siatkowate formy. Pomiary absorpcji na 570 nanometrów potwierdziły większą retencję fioletów kryształów w biofilmach leptospira byflexa w porównaniu do interferana leptospira we wszystkich punktach czasowych, co wskazuje na wyższe nagromadzenie biomasy w szczepie. Skaningowa mikroskopia elektronowa biofilmów leptospira interrogan uchwyciła wczesne osady macierzy zewnątrzkomórkowej w trzydniowych biofilmach, dojrzałą i kanałowaną powierzchnię podstawową o trójwymiarowej strukturze po 14 dniach oraz w pełni rozwiniętą konsolidację macierzy o gęstej architekturze o 21 dniach.Nasz zoptymalizowany protokół synchronizuje komplementarne odczyty z identycznych kultur, zwiększając odporność, zmniejszając zmienność oraz ujawniając informacje dynamiczne i strukturalne, dostępne przy użyciu podejść z jedną metodą. Poprzez integrację analizy komplementarnej, nasze wyniki standaryzowały ocenę biofilmu, wyjaśniając dynamikę i architekturę leptospiry. Łączą strukturę z zjadliwością i wzmacniają powtarzalne badania porównawcze.Przyszłe mutanty połączą regulacje z morfologią i dynamiką biofilmu, wyjaśniając trwałość środowiskową oraz oceniając strategie zakłócające informacje o biofilmie lub sprzyjające rozprzestrzenianiu się.

a-modular-workflow-for-quantitative-structural-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Poznaj modułowy protokół analizy biofilmów Leptospira łączący barwienie krystaliczne, mikroskopię konfokalną i SEM. Ta metoda standaryzuje ocenę biomasy i architektury biofilmów w badaniach nad chorobami zakaźnymi.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Przeglądaj więcej filmów