Name: Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj izolację i ilościową analizę mRNA aksonalnego z wykorzystaniem wkładek z błony porowatej oraz RT-ddPCR. Ta metoda umożliwia wykrywanie niskopoziomowych transkryptów w neuronach z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane grantami z Merkin Peripheral Neuropathy and Nerve Regeneration Center (dla P.K.S.).

1. Przygotowanie wkładek do siewania komórek
<ol>
	<li>Umieść wkładki o odpowiednim rozmiarze porów w płytkach z 6 dołkami. UWAGA: Użyj poru o wielkości 1 μm do oddzielania aksonów od soma oraz poru 3 μm do oddzielania wszystkich neuritów (aksonów i dendrytów) od soma.</li>
	<li>Dodaj 100 μg/mL poli-L-lizyny (PLL) do płytki 6-dołkowej tak, aby stykała się z dolną częścią wkładów oraz z górą wkładów (2 mL/dołek i 1 mL/wkładka).</li>
	<li>Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj dołki (dolną część wkładów) oraz górę wkładów sterylną, ultraczystą wodą – 4 razy × 5 minut.</li>
	<li>Dla neuronów zwoju grzbietowego korzenia (DRG) należy dodać 5 μg/mL lamininy (2 mL/włęk i 1 mL/wkładka) i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że zarówno góra, jak i dół wkładki są równomiernie pokryte.</li>
	<li>Przemyj sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) (pH 7,4) zawierającą 100 U/mL penicyliny/streptomycyny – 2 płukania × 5 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić sekcję i zasiać około 1 × 106 komórek/wkładkę dla neuronów korowychzarodkowych 5, hipokampa45 oraz rdzenia mózgu przedniego mózgu31,32. Dla dorosłych szczurów DRG należy podłożyć płytkę 6-8 DRG/insert 5,7 (Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Zbieranie podkomórkowych frakcji neuronalnych z wstawek 6-dołkowych
<ol>
	<li>Wystarczy 250 μL TRIzol w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL na wkład oraz jedna włówka/wkładka na płytce 6-dołkowej. Odłóż to na bok.</li>
	<li>Do innej płytki 6-dołkowej dodaj 2 mL/dołek sterylnego PBS. Liczba wwiertów/płyt powinna być proporcjonalna do liczby wkładów.</li>
	<li>Aspiruj podłoże hodowlane od góry i dołu wkładu oraz przenieś wkład na płytkę z 6 dołkami zawierającą PBS.</li>
	<li>Używając kleszczy, delikatnie umieść wkład i dodaj 2 mL PBS na wierzch. Aspiruj medium od góry i dołu wkładki i powtarzaj. Łącznie myj dwukrotnie PBS i zostawiaj w świeżym PBS (odpowiednio 1 mL i 2 mL na górze i dole wkładki).</li>
	<li>Izolacja całej frakcji neuronu<ol>
		<li>Używając skrobaka do komórek sterylnych, zeskrobaj całą frakcję neuronu (górę wkładki). Należy wywierać wystarczający nacisk, aby komórki zaczęły się odklejać, ale błona nie pękła (Rysunek 1).</li>
		<li>Zbierz cały neuron z wkładki i przenieś go do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Wiruj probówkę w 10000-15000 g przez 2 minuty.</li>
		<li>Odrzuć supernatant i ponownie zawiesijcie lizatan w 250 μL Trizolu.</li>
		<li>Oznacz tę rurkę jako całkowitą frakcję neuronu.</li>
		<li>Kontynuuj zbieranie frakcji neurytów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja frakcji neurytów<ol>
		<li>Weź sterylny patyczek watowy i jednym końcem poruszaj się zygzakowato od góry do dołu bardzo powoli po całej stronie neuronu. Obróć wkład o 90 stopni i powtórz ten proces z drugim końcem wymazu (jeśli używasz dwustronnego wymazu, lub użyj nowego do jednostronnego). Wyrzuć ten wymaz (Rysunek 1).</li>
		<li>Użyj nowego wymazu i poruszaj się koncentrycznymi okręgami, zaczynając od środka wkładu i idąc na zewnątrz. Upewnij się, że wyczyścisz też ściany (obwód).</li>
		<li>Odwróć wkład membranowy (strona neurytowa skierowana do góry) i przetnij membranę nowym, sterylnym ostrzem skalpela, trzymając ją kleszczemi. Upewnij się, że zostawisz ~2-3 mm na obrzeżach.</li>
		<li>Umieść przeciętą błonę w 6-dołkowej płycie zawierającej TRIzol tak, że strona neurytowa jest skierowana do dołu. Upewnij się, że jest zanurzona.</li>
		<li>Pobierz TRIzol zawierający lizat neurytowy z płytki 6-dołkowej i przelej do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarówno dla lizatów całego neuronu, jak i neurytów należy izolować RNA lub zachować lizaty w temperaturze -80 °C na późniejsze przetwarzanie.</li>
</ol>
3. Izolacja i ilościowość RNA
<ol>
	<li>Izolacja RNA UWAGA: W tej części zawsze pracuj w środowisku wolnym od RNazy, z dedykowanym, sterylnym plastikiem i rękawicami.<ol>
		<li>Dodaj 0,2 mL chloroformu na 1 mL TRIzolu, intensywnie wstrząśnij przez 15 sekund i inkubuj przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Wirówka w 12 000 × g przez 15 minut w 4 °C, aby rozdzielić warstwy na warstwy: organiczną, międzyfazową i wodną (zawierającą RNA).</li>
		<li>Przenieś górną fazę wodną do nowej rurki, unikając interfazy. Aby wytrącić RNA, dodaj 1 objętość izopropanolu i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (lub dłużej w -20 °C dla wyższej wydajności), aby wytrącić RNA. Wirować w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby pobrać granulki RNA.</li>
		<li>Usuń supernatant i myj granulat 1 mL 75% etanolu. Krótko wiruj i wiruj w 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozpuszczanie RNA: Ostrożnie usuń płukanie etanolem i susz granulat na powietrzu przez 5-10 minut, unikając całkowitego wyschnięcia. Ponownie zawiesij pellet w niewielkiej objętości wody wolnej od RNazy lub 1x buforu Tris-EDTA (TE), inkubując w temperaturze 55-60 °C dla całkowitego rozpuszczenia. Przechowuj oczyszczone RNA w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowość RNA za pomocą testu RiboGreen UWAGA: Test RiboGreen (poniżej) wykorzystuje barwnik fluorescencyjny specyficzny dla kwasów nukleinowych, oferujący wyższą czułość, swoistość oraz możliwość wykrywania nienaruszonego RNA niż metody absorpcji UV. Rozważ leczenie DNazą, jeśli problem jest z zanieczyszczeniem DNA.<ol>
		<li>Przygotuj 1x bufor TE, rozcieńcz dostarczony bufor 20x TE 20-krotnie wodą wolną od RNazy. Przygotuj roztwory robocze RiboGreen i chroń barwnik światłoczuły folią. Rozcieńcz skoncentrowany barwnik w 1:200 w 1x TE dla testu wysokiego zakresu (10 ng/mL-1 μg/mL), lub 1:2000 w 1x TE dla testu niskiego zakresu (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Przygotuj standardy RNA poprzez seryjne rozcieńczanie standardu RNA zestawu w 1x TE, aby pokryć oczekiwany zakres próbek. Uciekaj standardów w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Przygotuj próbki, rozcieńczając próbki RNA w 1x TE, aby dopasowały się do zakresu dynamicznego testu. Uruchom próbki w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Dodaj równe objętości roztworu roboczego RiboGreen oraz standardu lub próbki RNA (np. po 100 μL każda). Inkubuj przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem. Zmierz fluorescencję przy odpowiednich ustawieniach (wzbudzenie ~500 nm, emisja ~525 nm). Zmierz i odejmij odczyt odczynnika (1x TE + barwnik RiboGreen).</li>
		<li>Analizuj i ilościowuj: Rysuj krzywą standardową, używając wartości fluorescencji standardów w porównaniu do ich stężenia. Użyj tej krzywej do określenia stężenia RNA w próbkach (Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Rozmroz wszystkie komponenty na lodzie. Delikatnie wymieszaj każdą tubkę, przekręcając i krótko skręć przed użyciem. W probówce PCR na lodzie połącz następujące składniki dla każdej reakcji: RT master mix (5x): 4 μL Próbka RNA: zmienna (do 1 μg całkowitego RNA) Woda wolna od nukleazy: do 20 μL całkowitej objętości UWAGA: W przypadku kontroli bez szablonu (NTC) zamień próbkę RNA na wodę wolną od nukleazy.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj i obróć rurki, aby zebrać zawartość na dnie i uruchomić program thermocycler. Wyżarzanie podkładowe: 25 °C przez 2 minuty synteza cDNA: 55 °C przez 10 minut Inaktywacja termiczna: 95 °C przez 1 minutę</li>
</ol>
5. Projektowanie i walidacja podkładów
UWAGA: Projekt zapalnika RTddPCR zasadniczo opiera się na tych samych zasadach co ilościowy qPCR, ale wymaga dodatkowej uwagi, aby zapewnić wyraźne rozdzielenie kropelek dodatnich i ujemnych. Skorzystaj z narzędzi do projektowania podkładów od NEB, IDT lub ThermoFisher, aby ułatwić ten proces. Skuteczny test RTddPCR definiuje się wysoką swoistością i solidnym amplifikowaniem, które generuje wyraźne rozdzielenie między amplifikowanymi (dodatnimi) a nieamplifikowanymi (ujemnymi) kroplami. Do projektowania primerów PCR użyto następujących identyfikatorów przystępnych NCBI RefSeq:
Actg: NM_001127449.1 Forward 1: CAGTCTAACAGGGTGTGGGAAAG Rewers 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC Długość ampliconu: 98 Forward 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT Rewers 2: GACTTTCCCACCCTGTTAGAC Długość Amplicon: 118
Gap43: NM_017195.3 Forward 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC Rewers 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT Długość ampliconu: 122 Forward 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC Rewers 2: CATTGCACACACACTTGG Długość ampliconu: 116
<ol>
	<li>Zaprojektuj podkład z zalecaną długością podkładu 18-30 par bazowych i zawartością GC 40-60%. Upewnij się, że temperatura topnienia (Tm) wynosi 55-65 °C, a spłony do przodu i do tyłu znajdują się w odległości od siebie w odległości 2-5 °C. Włącz zacisk GC, jedną lub dwie bazy G lub C w ostatnich pięciu bazach na końcu 3′, aby zwiększyć specyficzność wiązania, ale unikaj długich serii G lub C.</li>
	<li>Weryfikacja specyficzności primerów za pomocą narzędzi do wyrównania, takich jak National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), aby upewnić się, że startery wiążą się tylko z docelową sekwencją. Projektuj amplikony o rozmiarze 50-200 par zasad, z ~100 parami zasad jako optymalnym, ponieważ krótsze produkty wzmacniają się wydajniej, pozostając jednocześnie odróżnialne od zapalników-dimerów. UWAGA: W tym badaniu krótkotrwałe produkty PCR są zazwyczaj wzmacniane z wyższą efektywnością niż dłuższe produkty w RT-ddPCR.</li>
	<li>Minimalizuj dymery podkładowe, projektując spłony o zawartości GC 50-60%, unikając struktur wtórnych i komplementarności 3'. Podczas walidacji podkładów stosuj elektroforezę żelową z agarozą i zawsze stosuj kontrolę bez szablonu do oceny dimerów podkładów.</li>
	<li>Unikaj projektowania sprężyn w obszarach szablonu, gdzie istnieje duże prawdopodobieństwo powstania struktur wtórnych, ponieważ może to zakłócać efektywność wzmacniania.</li>
</ol>
6. RTddPCR
UWAGA: Do wykonywania RTddPCR według instrukcji producenta oraz według wcześniejszych opisów Das i in. (2022)43, używaj systemu QX200 ddPCR (Bio-Rad) do wykonywania RTddPCR.
<ol>
	<li>Przygotowanie reakcji RTddPCR z gotową do użycia uniwersalną mieszanką ddPCR oraz skondensowane dla celów sprzymierzone z odpowiednim cDNA.</li>
	<li>Wygeneruj krople za pomocą generatora kropel.</li>
	<li>Odczytaj fluorescencję końcową za pomocą czytnika kropel i przeanalizuj dane za pomocą wbudowanego oprogramowania.</li>
	<li>Stosuj następujące środki kontroli jakości, aby zapewnić precyzyjną ilościową identyfikację i powtarzalne tworzenie kropli:<ol>
		<li>Uruchamiaj zestawy podkładów konsekwentnie w tym samym wierszu lub kolumnie, aby zminimalizować efekty płyt.</li>
		<li>Przygotuj mieszanki master, aby zmniejszyć pipetowanie małych objętości.</li>
		<li>Pipetuj o niskim przepływie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków, oraz używaj pipet wielokanałowych do równomiernego oddawania próbek.</li>
		<li>Po powstaniu kropelek delikatnie obsługuj płyty i natychmiast uszczelniaj, aby zapobiec parowaniu.</li>
		<li>Przygotuj wszystkie reakcje na lodzie i unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania dla odczynników.</li>
		<li>Uwzględnij kontrole bez szablonów dla każdego zestawu podkładów do monitorowania zanieczyszczeń.</li>
		<li>Wyklucz studnie zawierające mniej niż 10 000 zaakceptowanych kropelek z analizy.</li>
		<li>Wykonaj techniczne replikacje dla wszystkich próbek, aby zapewnić powtarzalność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręcznie sprawdź wykresy amplitudy fluorescencji kropelki, aby zweryfikować dokładność automatycznego progowania.</li>
</ol>

PKS posiada amerykańskie patenty na zastosowanie peptydu przepuszczalnego przez komórki G3BP1 do regeneracji aksonów i neurodegeneracji. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Kilka kroków jest kluczowych dla powtarzalności. Powłoka wkładu musi być jednolita, aby wspierać przyczepność neuronów; Niepełna powłoka prowadzi do słabego wzrostu neurytów i aksonów. Gęstość powłoki komórkowej jest równie ważna, ponieważ nadmierna gęstość zwiększa przejście dendrytyczne, podczas gdy rzadka powłoka daje niewystarczającą ilość RNA aksonalnego. Sekwencja skrobania i wymazywania musi być wykonywana precyzyjnie: zbyt małe ciśnienie powoduje zanieczyszczenie somatyczne, natomiast zbyt duże ciśnienie grozi uszkodzeniem wkładu.
Walidacja primerów stanowi kolejny kluczowy krok. Uruchomienie dwóch niezależnych zestawów primerów dla każdego transkryptu pozwala wybrać najbardziej niezawodną parę, podczas gdy gradient PCR może dodatkowo doprecyzować temperatury wyżarzania. Ta praktyka zmniejsza tworzenie się dimerów starterów, zwiększa klarowność kropel i zapewnia powtarzalną ilościową identyfikację w biologicznych replikacjach. Chociaż takie podejście osiąga wysoką czystość przedziałową, śladowe zanieczyszczenia materiałem somatycznym nie mogą być całkowicie wykluczone. Wydajność RNA aksonalnego jest z natury niska, co ogranicza zakres analiz wymagających wysokiego wkładu, takich jak sekwencjonowanie pełnego transkryptomu. Krytycznym ograniczeniem tej metody jest jej niezdolność do uwzględnienia lokalizacji transkryptów w obrębie aksonów dystalnych i bliższych. Chociaż występują przedłużenia gleja lub śródbłonka przez pory błonowe w określonych warunkach, nasz system hodowli minimalizuje tę możliwość. W dorosłych hodowlach DRG dodanie cytozyny β-D-arabinofuranozydu (Ara-C)5,7 oraz stosowanie pożywek wolnych od surowicy dla innych kultur neuronalnych (korowych, hipokampalnych i BFCN)5,45 skutecznie ograniczają proliferację komórek glejowych i śródbłonkowych. Dodatkowo, sztywne membrany poliwęglanowe lub polietylenowetereftalanowe (PC/PET) stosowane tutaj są nieelastyczne i nieprzepuszczalne na aktywną migrację komórek. Ponadto używamy wkładek o porach o rozmiarze 3 μm do hodowli DRG, aby umożliwić przejście aksonów o dużej średnicy. Natomiast dla hodowli korowych lub BFCN stosujemy wkładki o rozmiarze porów 1 μm, co dodatkowo ogranicza migrację glejów. Te właściwości odróżniają nasz zestaw od mikrourządzeń opartych na PDMS, które wspierają migrację śródbłonka przez elastyczne pory. Zgodnie z wcześniejszymi raportami 34,35,36,40, walidacja molekularna w tym badaniu potwierdza silne wzbogacenie transkrypcji aksonalnych (np. Gap43) oraz znikome wykrywanie markerów somatycznych (np. Actγ), co wspiera specyficzność neuronalną materiału przechodzącego przez błonę. Ponieważ ograniczenie fizyczne nie eliminuje całkowicie migracji glejów, badacze powinni również używać Gfap jako wskaźnika ujemnego.
W porównaniu z urządzeniami mikrofluidycznymi system wkładów jest prostszy, bardziej skalowalny i kompatybilny z rutynowym procesem hodowlania. Unika specjalistycznego sprzętu, a jednocześnie umożliwia powtarzalną separację akson-soma. Łącząc inserty z RTddPCR, metoda ta zapewnia zarówno dostępność, jak i wysoką czułość, umożliwiając bezwzględną ilościfikację transkrypcji często poniżej progów wykrywania qPCR. Protokół ten jest dobrze przystosowany do badania zmian w lokalizacji transkrypcji aksonalnej, oceny lokalnej translacji w odpowiedzi na bodźce rozwojowe, neurotoksyczne lub urazowe, a także do badania defektów transportu RNA związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi lub zaburzeniami neurorozwojowymi. Przyszłe udoskonalenia mogą obejmować multipleksowany RTddPCR do jednoczesnej ilościowej analizy wielu mRNA lub integrację z podejściami sekwencjonowania RNA o niskim wejściu w celu rozszerzenia pokrycia transkryptomem. Ponadto adaptacja tego systemu do neuronów pochodzących z iPSC u ludzi może rozszerzyć jego zastosowania na modelowanie chorób i badania regeneracyjne.

Neurony są jednymi z najbardziej złożonych i spolaryzowanych komórek strukturalnych w biologii. Mają one długie procesy, które czasem mogą przekraczać metr. Ta polaryzacja utrudnia komunikację komórkową i homeostazę białek na różne sposoby. Udoskonalonym podejściem do tych wymagań jest transport mRNA do odległych przedziałów, takich jak aksony i dendryty, co ułatwia ich translację w sposób regulowany w odpowiedzi na lokalizowane sygnały 1,2,3. Translacja lokalna umożliwia aksonom syntezę białek w sposób przestrzenno-czasowy. Proces ten jest kluczowy dla rozwoju aksonów, plastyczności synaptycznej, regeneracji po urazie oraz reakcji na bodźce rozwojowe i zewnątrzkomórkowe 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Zdolność analizy funkcji lokalnych mRNA w aksonach jest kluczowa dla zrozumienia ich ról zarówno w normalnej funkcji neuronów, jak i w kontekście patofizjologii. Zaburzenia translacji mRNA aksonalnego zostały powiązane zróżnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak zanikowa stwardnienie boczne (ALS)17,18,19, zanik mięśni kręgosłupa (SMA)20,21 oraz choroba Alzheimera (AD)22. Regeneracja aksonów po uszkodzeniu jest silnie zależna od szybkiej, precyzyjnej translacji białek cytoszkieletowych, cząsteczek sygnałowych oraz receptorów 3,23,24,25,26,27,28. Pomimo tych nowych koncepcji, dyscyplina nadal napotyka wyzwania w skutecznym ilościowym określaniu i wychwytywaniu populacji mRNA specyficznych dla aksonów.
Jednym z wyzwań transkryptomiki aksonalnej jest czyste rozdzielenie soma i aksonów. Ponieważ większość mRNA jest wzbogacona w somę, nawet niewielkie ilości zanieczyszczenia z ciała komórki mogą wpłynąć na wyniki oceny zawartości aksonalnej danego mRNA. Konwencjonalne techniki, w tym komory mikrofluidyczne 29,30,31,32 czy komory Campenota 33, zapewniają kierunkowy wzrost aksonów i wyraźne rozdzielenie między tymi dwoma przedziałami, jednak wydajność aksonów może być zbyt niska do badań biochemicznych, takich jak sekwencjonowanie RNA (RNA-seq), współimmunoprecypitacja RNA oraz sekwencjonowanie RNA czy ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR). Bulk RNA-seq i qPCR, choć są korzystne, często nie mają odpowiedniej czułości do dokładnej identyfikacji transkryptów o niskiej liczbie kopii w aksonach, co skutkuje błędnym oszacowaniem istotnych gatunków fizjologicznie.
Aby sprostać tym wyzwaniom, my i inni użyliśmy wkładek błonowych przepuszczalnych do fizycznego rozdzielania aksonów i somat 34,35,36,37,38,39,40,41. Te wstawki pozwalają neuronom rozwijać się na mikroporowatej powierzchni, a aksony mogą przez nie przeniknąć do dolnej komory, ale nie do soma. Ta podstawowa, ale skuteczna architektura umożliwia hodowlę ogromnej liczby neuronów z wyraźnym fizycznym oddzieleniem soma od aksonów. Metoda oparta na membranach jest ważna, ponieważ unika problemów technicznych związanych z urządzeniami mikrofluidycznymi i zapewnia duże ilości materiału aksonalnego, który może być wykorzystywany do badań molekularnych i biochemicznych. System wkładek jest również łatwy w użyciu do takich przypadków jak uszkodzenia mechaniczne, co czyni go przydatnym w wielu różnych eksperymentach związanych z naprawą neuronów. Opisana tutaj metoda dodatkowo optymalizuje wydajność i czystość neuronów poprzez udoskonalanie warunków hodowli, dostosowanie charakterystyki porów błony oraz zastosowanie walidacji opartej na cyfrowym PCR (RTddPCR) opartej na kroplach odwrotnych transkryptazy dla próbek RNA o niskim wydajności.
Ważne jest również, aby ułamki aksonalne były czyste. Aksony pobieramy tylko z dolnej komory po ostrożnym usunięciu pozostałości somatycznej z górnej powierzchni. Walidacja primerów wykazuje silne wzbogacenie markerów aksonalnych oraz brak lub pomijalny charakter somatyczny markerów. Potwierdzenie molekularne wzmacnia to rozróżnienie: frakcje aksonalne są wzbogacone o uznane mRNA aksonalne, takie jak Gap43, oraz niższą ekspresję Actγ42. Pokazuje to, że system insertów wytwarza próbki aksonalne o znikomej zawartości somy, które są dobre do dalszych badań.
Po wyizolowaniu wzbogaconych frakcji aksonalnych, kolejnym wyzwaniem jest pomiar mRNA występujących w bardzo niskiej liczbie kopii. Niewielka ilość materiału wyjściowego pochodząca z frakcji aksonalnych oraz obecność mRNA o niskiej liczbie kopii w aksonach przesuwają granice czułości konwencjonalnej transkryptozy odwróconej w zakresie ilościowej PCR (RT-qPCR), która wykorzystuje standardowe krzywe do ilości. Ponadto RT-qPCR nie podaje również bezwzględnych liczb kopii konkretnego wykazu ocen. RTddPCR natomiast rozdziela próbki cDNA na tysiące kropelek, co pomaga uzyskać dokładną liczbę transkrypcji za pomocą statystyki Poissona. Pozwala to na wiarygodne znalezienie transkrypcji nawet jeśli tylko kilka kopii transkryptów może być obecnych w jednym nanogramie o łącznej wartości RNA 5,6,7,43.
W tym manuskrypcie przedstawiamy uproszczenie podejścia, które obejmuje metody hodowli różnych dorosłych lub embrionalnych neuronów gryzoni na wstawkach, izolację RNA z przedziałów całych neuronów w porównaniu z przedziałami wzbogaconymi aksonami, sprawdzanie czystości aksonów oraz bezwzględną ilościową ilościową kopii mRNA opartą na RTddPCR. Metody te mogą być wykorzystywane do określania poziomów specyficznych mRNA, które lokalizują się do aksonów w warunkach podstawowych, oraz do tego, jak zmieniają się podczas aksotomii, stymulacji czynnikiem wzrostu lub sygnałów neurotoksycznych. Łącząc tę metodę z koimmunoprecipitacjami białek, można również ocenić dynamikę kompleksów białek rybojądrowych (RNP) w aksonach. Na przykład szeroko stosowaliśmy tę metodę do badania mRNA, które występują w aksonalnych granulkach białka wiążącego białko 1 (G3BP1) aktywującego Ras, aktywującego GTPazę. G3BP1 jest podstawowym składnikiem granulacji stresu44, a nasze wcześniejsze badania wykazały, że hamuje syntezę białek aksonalnych, a tym samym blokuje regenerację aksonów zarówno PNS, jak i OUN5. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do badania roli zaburzenia translacji aksonów w różnych schorzeniach patofizjologicznych, w tym ALS, SMA i AD.
Celem tego badania jest stworzenie i przetestowanie metody pomiaru mRNA aksonalnego, która jest czuła, powtarzalna i skalowalna. Łącząc kultury oparte na przedziałach opartych na inserwacji z kwantyfikacją opartą na RTddPCR, dostarczamy tej dziedzinie rozwiązanie trwałych problemów transkryptomiki aksonalnej. Ta metodologia nie tylko umożliwi kluczowe odkrycia dotyczące lokalnej translacji, ale także stworzy podstawy badań translacyjnych skoncentrowanych na interwencjach terapeutycznych w naprawie nerwowej i neurodegeneracji.

<table><tbody><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych dla płytek 6-dołkowy, 1,0&nbsp; &mu; m Rozmiar porów, sterylność</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych dla płytek 6-dołkowe, 3,0&nbsp; &mu; m Rozmiar porów, sterylność</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>Podnośnik komórek z wąskim ostrzem</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6-dołkowa płytki do hodowli tkanek</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>ddPCR płyty 96-odwiertowe&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Wkłady DG8 do generatora kropli QX200/QX100</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Mikropłytki dla fluorescencyjnych, 96-dołkowe, czarne</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>Płyta PCR Heat Seal, folia, przebijalna</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Materiały jednorazowe</td></tr><tr><td>Polilizyna</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Termiczny Cykler</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Wyposażenie</td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych PCR</td></tr><tr><td>Odczynnik Quant-it RiboGreen i zestaw do testowania RNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Olej do generacji kropli QX200 dla EvaGreen</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Generator kropelek QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Wyposażenie</td></tr><tr><td>Czytnik kropel QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Wyposażenie</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Odczynniki</td></tr></tbody></table>

izolacja i ilościowa ilościowość mrna aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

Przestrzenna dynamika lokalizacji i translacji mRNA w neuronach jest kluczowa dla różnych mechanizmów funkcjonowania neuronów, w tym łączności neuronalnej, plastyczności synaptycznej oraz reakcji na uraz. Ze względu na skrajną polaryzację neuronów, wiele z tych funkcji opiera się na zdolności aksonów do lokalnego tłumaczenia konkretnych transkrypcji. Jednak ilościowe określenie tych populacji podkomórkowego RNA pozostaje technicznie trudne. Tutaj opisujemy powtarzalne podejście do pozyskiwania oddzielnych przedziałów somatycznych i aksonalnie wzbogaconych z hodowanych neuronów gryzoni oraz do ilościowego określania ekspresji mRNA specyficznej dla przedziałów. Pierwotne neurony embrionalne lub dorosłe gryzoni były hodowane na wkładkach z porowatą błoną o rozmiarze 1-3 μm. Błony te są dopuszczalne wyłącznie dla aksonów, co pozwala na fizyczne rozdzielenie przedziałów somatycznych i aksonalnych. Następnie RNA zostało wyizolowane z całego neuronu i frakcji wzbogaconych w akson osobno, które następnie wykorzystano do cyfrowego PCR odwrotnego transkryptazy dropletowej (RTddPCR) z przykładami specyficznymi dla genów. System ten oferuje absolutne porównanie ilościowe między przedziałami subkomórkowymi, umożliwiając wysokoczułe wykrywanie lokalnych transkrypcji. Takie podejście mierzy liczebność RNA w stanie stacjonarnym i ułatwia badanie zmian RNA aksonalnych w czasie w odpowiedzi na czynniki neurotroficzne, stres lub modele urazu. Połączenie fizycznej kompartmentalizacji i analizy RTddPCR zmniejsza zanieczyszczenia krzyżowe i zapewnia dokładne liczby kopii rzadkich transkrypcji, oferując wysoką czułość, powtarzalność i wykrywanie mRNA o niskiej liczbie kopii, które kontrolują wzrost i regenerację aksonów. Metoda ta współpracuje również z testami końcowymi, takimi jak pomiar syntezy białek, badanie stabilności RNA oraz przeprowadzanie eksperymentów perturbacyjnych z użyciem siRNA lub leków blokujących określone białka. Co ważne, technika ta może być dostosowana do różnych podtypów neuronów, etapów rozwojowych lub modeli urazów. Ogólnie rzecz biorąc, to podejście jest elastycznym, wrażliwym i powtarzalnym sposobem badania molekularnej podstawy lokalizacji aksonalnego mRNA oraz jej wpływu na funkcjonowanie neuronów i mechanizmy chorobowe.

Pierwotne neurony korowe embrionalnych gryzoni, neurony hipokampa oraz BFCN pokryte wkładkami 1 μm pokrytymi PLL solidnie przyczepiają się i rozszerzają neurity przez błonę o 5-7 dni in vitro (DIV). Do 11 DIV kultury wykazują gęste sieci. W przypadku dorosłych szczurów DRG dodanie warstwy lamininy do wkładek 3 μm pokrytych PLL pomaga osiągnąć porównywalne rozszerzenie aksonów o 5 DIV. Obserwacje te potwierdzają zdolność insertów do wspierania długoterminowego wzrostu neuronów oraz dostarczania wystarczającej ilości materiału aksonalnego do dalszej ekstrakcji RNA. W razie potrzeby skalowania łączymy wiele wkładek, aby zapewnić odpowiednią ilość materiału.
Ekstrakcja TRIzol z pojedynczych inserwecji daje wystarczającą ilość RNA do transkrypcji odwrotnej i późniejszej ddPCR. Ilościowa analiza RiboGreen potwierdza stałe wyniki RNA z całych frakcji neuronów (212,85 ng/insert) oraz niższe wyniki z frakcji neurytów (42,75 ng/insert) (Rysunek 2). Zazwyczaj otrzymujemy ~5-7 razy więcej RNA z całej frakcji neuronu niż z frakcji wzbogaconej o neuryt.
Wszystkie spłonki są walidowane przed eksperymentami RTddPCR. Dla każdego docelowego transkryptu zamawia się co najmniej dwa zestawy primerów i testuje je za pomocą konwencjonalnego PCR na cDNA generowanym z tych samych próbek neuronalnych. Para zapalników generująca najsilniejsze i najbardziej specyficzne pasmo jest wybierana dla RTddPCR (rysunek 3A). Na przykład wybraliśmy zestaw podstawowy 1 dla Gap43. W przypadku niejednoznacznych wyników, takich jak uzyskane dla Actγ, wykonujemy gradientowy PCR, aby zoptymalizować temperatury wyżarzania (Rysunek 3B). Zapewnia to, że do ilościowego ilościowania używa się tylko dobrze zweryfikowanych starterów, co zmniejsza prawdopodobieństwo powstania artefaktów przy rozdzielaniu kropel.
Procedura skrobania i wymazu niezawodnie rozdziela komory somatyczne i neurityczne. RNA wyizolowane z całych frakcji neuronów wykazuje wzbogacenie transkrypcji, takich jak Actγ 46,47,48,49 (Rysunek 4). Natomiast frakcje aksonu/neurytu dają znacznie niższe całkowite RNA, co jest zgodne z ich ograniczoną objętością, ale wykazują wzbogacenie transkrypcji znanych z lokalizacji w wyrostkach dystalnych, takich jak Gap43 (Rysunek 4). Minimalne wykrywanie krzyżowe transkrypcji ograniczonych do soma wskazuje na wysoką czystość przedziałową, gdy inserwacja jest traktowana ostrożnie i nakładana z optymalną gęstością.
Pozytywne wyniki charakteryzują się: (1) nienaruszoną morfologią neuronów z wyraźnym rozszerzeniem aksonalnym, (2) czystym rozdzieleniem przedziałów bez pęknięcia błony, (3) zweryfikowanymi primerami powodującymi wyraźne rozdzielenie kropelek dodatnich i ujemnych oraz (4) silnymi sygnałami RTddPCR dla transkrypcji aksonalnych. Eksperymenty nieoptymalne skutkują niską wydajnością RNA, zanieczyszczeniem krzyżowym widocznym przez markery soma w frakcjach neurytów lub artefaktami RTddPCR, takimi jak zwiększone "deszcze" kropel spowodowane dymerizacją primerem. Problemy te najczęściej wiążą się z uszkodzeniem membrany wstawionej, nadmiernym ciśnieniem skrobania lub niewystarczającą optymalizacją temperatury wyżarzania podkładów.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Przegląd izolacji RNA specyficznej dla przedziałów z wykorzystaniem wkładek błonowych. Neurony gryzoni hodowano na półprzepuszczalnych wkładkach o porze 1-3 μm, co umożliwia rozszerzanie neurytów przy jednoczesnym ograniczaniu somy. Do przygotowania całego neuronu komórki z górnej komory były zeskrobywane za pomocą sterylnego skrobacza komórek, granulowane, a następnie lizowane w TRIzol w celu izolacji RNA, syntezy cDNA oraz RTddPCR. Pozostałości komórkowe usuwano z błony wkładkowej sterylnym patyczkiem watowym. Do przygotowania neurytów membrana wkładkowa, która obecnie zawiera wyłącznie neurity, została odwrócona i przecięta skalpelem, a następnie zanurzona bezpośrednio w TRIzolu, po czym przeprowadzono izolację RNA, syntezę cDNA i RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Standardowa krzywa stężenia RNA z użyciem testu RiboGreen. (A) Intensywność fluorescencji zmierzono za pomocą testu ilościowego RNA RiboGreen na serii rozcieńczeń standardów RNA. Analiza regresji liniowej wykazała silną korelację między stężeniem RNA a sygnałem fluorescencji (R² = 0,9956). Wartość R² zbliżona do jednego świadczy o doskonałej liniowości i niezawodności testu RiboGreen do dokładnej ilościowej identyfikacji RNA. (B) Korzystając z równania (y=19,738x + 14,905) dla nachylenia uzyskanego w A, dla każdej frakcji obliczono całkowite RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Walidacja primerów za pomocą PCR i elektroforezy żelu agarozowego. (A) Produkty amplifikacyjne PCR z wykorzystaniem cDNA dla Actγ i Gap43 zostały rozwiązane na żelu agarozowym 2% w celu oceny specyficzności sprężystości sprężystów. Dla każdego genu testowano dwa niezależne zestawy primerów (zestaw 1 i zestaw 2). Markery wielkości DNA (drabiny) są pokazane w sąsiednich torach o zaznaczonych masach cząsteczkowych (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Wyraźne pojedyncze pasma o oczekiwanym rozmiarze potwierdzają pomyślne wzmocnienie i specyficzność wybranych zestawów starterów. (B) Amplifikacja PCR została wykonana za pomocą zestawu Actγ primeru 2 na poziomie temperaturowym (55-65 °C) w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania. Produkty amplifikowane były rozwiązywane na żelu agarozowym o stężeniu 2% wraz z drabiną DNA (ścieżka 2, podane rozmiary). Obserwowano spójne pojedyncze pasma o oczekiwanym rozmiarze w całym badanym zakresie, z najsilniejszym wzmocnieniem wykrytym w temperaturze 55 °C, co sugeruje, że jest to optymalna temperatura dla tego zestawu starterów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Analiza RTddPCR wybranych transkrypcji oraz ilościowa identyfikacja kopii mRNA. (A,B) Reprezentatywne jednowymiarowe wykresy amplitudy pokazujące rozdzielenie kropelek dla (A) Actγ oraz (B) Gap43. Każda kropla oznacza pojedynczą kroplę, przy czym niebieskie krople oznaczają dodatnie wzmocnienie, a szare krople ujemne wzmocnienie. Oś Y oznacza amplitudę, a oś X wskazuje pozycję studni w płycie ddPCR. Wyraźne rozdzielenie kropelek dodatnich (niebieskich) i ujemnych (szarych) potwierdza solidne wykrywanie docelowych transkrypcji przy użyciu wskazanych zestawów starterów. (C) Tabela podsumowująca liczbę kopii/μL oraz kopii na ng całkowitego RNA dla transkrypcji Actγ i Gap43 w całych ułamkach neuronów i neurytów. Szacunki liczby kopii uzyskano na podstawie bezwzględnej ilościowości przy użyciu liczby kropli ddPCR (pokazanych w panelach A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

Nasze badania analizują, jak lokalna synteza białek jest regulowana oraz jakie są jej role w naprawie neuronów, ich rozwoju i degeneracji. Najnowsze osiągnięcia obejmują techniki wykrywania mRNA o wysokiej czułości, takie jak gdPCR, do identyfikacji mRNA aksonalnych o niskiej obfitości oraz do kompartmentalizacji hodowli neuronalnych. Aby zacząć, należy podać 250 mikrolitrów triazolu do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, odpowiadającej każdej wkładce, do jednej dołki lub wkładki z płytki sześciodołkowej.Odłóż rurki na bok do czasu potrzeby. Dodaj dwa mililitry sterylnego PBS do każdej dołki drugiej płyty sześciodołowej, aby liczba dołków lub płyt odpowiadała liczbie wkładów. Pipetą wyjmij medium hodowlane zarówno od górnego końca dołu, jak wkład i przenieś go do sześciodołowej płyty zawierającej PBS.Teraz, używając kleszczy, delikatnie włóż wkładkę, a następnie dodaj na nią dwa mililitry PBS. Aspiruj PBS z obu stron i powtarzaj płukanie dwa razy. Następnie zostaw wkładkę w świeżym PBS.Następnie użyj sterylnego skrobaka komórek, aby zeskrobać całą frakcję neuronu z góry wkładki. Pobierz lizat soma z wkładki. Przelej go do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Wiruj probówkę w temperaturze 10 000 do 15 000 G przez dwie minuty. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 250 mikrolitrach tryzolu. Oznacz tę rurkę jako całkowitą frakcję neuronu.Aby zebrać frakcję neurytową, powoli przesuwaj jeden koniec sterylnego wacika w zygzakowatym wzorze od góry do dołu po całej stronie neuronu wkładki. Obróć wkład o 90 stopni i powtórz powtórzenie, używając drugiego końca wymazu. Następnie wyrzuć wymaz.Użyj nowego wymazu i poruszaj się koncentrycznymi okręgami, zaczynając od środka wkładu na zewnątrz, dbając o oczyszczenie obwodu. Odwróć wkładkę tak, aby strona neurytowa była skierowana do góry. Przetnij membranę nowym, sterylnym ostrzem skalpela.Przeciętą błonę umieść w sześciodołowej płycie zawierającej trizol, tak że strona neurytowa jest skierowana w dół. Upewnij się, że membrana jest zanurzona. Teraz zbierz trizol zawierający lizat neurytu ze studni.Przelej go do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Kontynuuj izolację RNA lub przechowuj lizaty soma i neurity w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego przetwarzania. Przygotuj reakcje cyfrowego PCR z kroplami transkrypcji odwrotnej, wykorzystując Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix i celuj w specyficzne primery odpowiednim DNA.Pipetować mieszaninę reakcyjną do wkładu generującego krople. Następnie dodaj olej generacyjny do wyznaczonych dołków wkładu. Teraz uszczelnij wkład uszczelką.Wygeneruj krople za pomocą generatora kropel. Po wygenerowaniu kropelek należy je przenieść na płytę PCR z 96 dołkami i zamknąć folią, zanim płytę umieścimy w termocyklerze. Otwórz oprogramowanie QX Manager, aby rozpocząć analizę.Kliknij opcję Przeglądaj i otwórz plik do analizy. Po załadowaniu pliku widok dashboardu pojawia się na lewym panelu. Wybierz interesujące się zagłębienia, przytrzymując klawisz Control i klikając dalej.Kliknij na 1D Amplitude, aby zwizualizować wykres kropkowy. Wybierz Threshold Multiple Wells, aby zastosować ten sam próg do więcej niż jednej studni. Wprowadź wartość progową opartą na tym, gdzie widoczna jest wyraźna separacja między kropelkami dodatnimi a ujemnymi.Teraz dobrze obejrzyj sekcję danych, pokazującą opis próbki, wartości stężeń, liczbę akceptowanych kropelek oraz dodatnie i ujemne liczby kropel. Kliknij Zapisz, aby zarejestrować wyniki progowania. Ilościowa analiza RNA za pomocą testu ribogreen wykazała, że całe frakcje neuronów dają 212,85 nanogramów RNA na inserwację, podczas gdy frakcje neurytowe dają 42,75 nanograma.Walidacja PCR wskazała, że zestaw pierwszy pierwszy jest najbardziej specyficzny dla transkrypcji Gap43, pokazując wyraźny pojedynczy pasmo. Niejednoznaczne wyniki PCR dla Gamma-aktyny skłoniły do przeprowadzenia testu gradientu temperatury z użyciem zestawu primerów drugiego, który wykazał najsilniejsze wzmocnienie w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Wykresy amplitudy RT-ddPCR wykazały wyraźne rozdzielenie kropelek dla Gamma-aktyny zarówno w próbkach całego neuronu, jak i neurytu, potwierdzając wiarygodne wykrywanie transkryptów.W przypadku Gap43 prawie 23% puli mRNA znajduje się w neuritach, w porównaniu do Gamma-aktyny, gdzie w neuritach występuje tylko 5% puli mRNA, a w całej frakcji neuronów. Wykazaliśmy obecność struktur ziarnistych stresu w aksonach w warunkach fizjologicznych, które hamują lokalną syntezę białek. Nasz protokół oferuje niezawodną i spójną metodę izolowania przedziałów neuronalnych oraz wykrywania mRNA o niskim poziomie środowiskowym.Przyszłe analizy skupią się na izolowaniu i charakteryzowaniu odrębnych poddomen aksonalnych, takich jak czopki wzrostu i trzony aksonalne, poza analizą objętościową.

isolation-quantification-axonal-mrnas-using-porous-membrane-inserts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten artykuł opisuje system hodowli neuronów, który może być używany do uzyskiwania dużych ilości czystych próbek aksonalnych do analiz biochemicznych i immunocytochemicznych. Technika ta pozwoli na lepsze zrozumienie prawidłowej fizjologii aksonów i szlaków sygnałowych prowadzących do neurodegeneracji.

Produkcja i izolacja aksonów z neuronów czuciowych do analizy biochemicznej przy użyciu filtrów porowatych

W tym badaniu opracowano i zweryfikowano nową platformę do badania wewnątrzneuronalnych sygnatur molekularnych odpowiedzi na leczenie w chorobie afektywnej dwubiegunowej (ChAD). Nabłonek węchowy od pacjentów z ChAD uzyskano za pomocą biopsji nosa. Następnie mikrodysekcję laserową połączono z Real Time RT PCR w celu zbadania sygnatury molekularnej odpowiedzi litu w ChAD.

Neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Poznaj izolację i ilościową analizę mRNA aksonalnego z wykorzystaniem wkładek z błony porowatej oraz RT-ddPCR. Ta metoda umożliwia wykrywanie niskopoziomowych transkryptów w neuronach z wysoką czułością.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Przeglądaj więcej filmów