Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR
6 lutego 2026
Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.
Nasze badania analizują, jak lokalna synteza białek jest regulowana oraz jakie są jej role w naprawie neuronów, ich rozwoju i degeneracji. Najnowsze osiągnięcia obejmują techniki wykrywania mRNA o wysokiej czułości, takie jak gdPCR, do identyfikacji mRNA aksonalnych o niskiej obfitości oraz do kompartmentalizacji hodowli neuronalnych. Aby zacząć, należy podać 250 mikrolitrów triazolu do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, odpowiadającej każdej wkładce, do jednej dołki lub wkładki z płytki sześciodołkowej.
Odłóż rurki na bok do czasu potrzeby. Dodaj dwa mililitry sterylnego PBS do każdej dołki drugiej płyty sześciodołowej, aby liczba dołków lub płyt odpowiadała liczbie wkładów. Pipetą wyjmij medium hodowlane zarówno od górnego końca dołu, jak wkład i przenieś go do sześciodołowej płyty zawierającej PBS.
Teraz, używając kleszczy, delikatnie włóż wkładkę, a następnie dodaj na nią dwa mililitry PBS. Aspiruj PBS z obu stron i powtarzaj płukanie dwa razy. Następnie zostaw wkładkę w świeżym PBS.
Następnie użyj sterylnego skrobaka komórek, aby zeskrobać całą frakcję neuronu z góry wkładki. Pobierz lizat soma z wkładki. Przelej go do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.
Wiruj probówkę w temperaturze 10 000 do 15 000 G przez dwie minuty. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 250 mikrolitrach tryzolu. Oznacz tę rurkę jako całkowitą frakcję neuronu.
Aby zebrać frakcję neurytową, powoli przesuwaj jeden koniec sterylnego wacika w zygzakowatym wzorze od góry do dołu po całej stronie neuronu wkładki. Obróć wkład o 90 stopni i powtórz powtórzenie, używając drugiego końca wymazu. Następnie wyrzuć wymaz.
Użyj nowego wymazu i poruszaj się koncentrycznymi okręgami, zaczynając od środka wkładu na zewnątrz, dbając o oczyszczenie obwodu. Odwróć wkładkę tak, aby strona neurytowa była skierowana do góry. Przetnij membranę nowym, sterylnym ostrzem skalpela.
Przeciętą błonę umieść w sześciodołowej płycie zawierającej trizol, tak że strona neurytowa jest skierowana w dół. Upewnij się, że membrana jest zanurzona. Teraz zbierz trizol zawierający lizat neurytu ze studni.
Przelej go do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Kontynuuj izolację RNA lub przechowuj lizaty soma i neurity w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego przetwarzania. Przygotuj reakcje cyfrowego PCR z kroplami transkrypcji odwrotnej, wykorzystując Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix i celuj w specyficzne primery odpowiednim DNA.
Pipetować mieszaninę reakcyjną do wkładu generującego krople. Następnie dodaj olej generacyjny do wyznaczonych dołków wkładu. Teraz uszczelnij wkład uszczelką.
Wygeneruj krople za pomocą generatora kropel. Po wygenerowaniu kropelek należy je przenieść na płytę PCR z 96 dołkami i zamknąć folią, zanim płytę umieścimy w termocyklerze. Otwórz oprogramowanie QX Manager, aby rozpocząć analizę.
Kliknij opcję Przeglądaj i otwórz plik do analizy. Po załadowaniu pliku widok dashboardu pojawia się na lewym panelu. Wybierz interesujące się zagłębienia, przytrzymując klawisz Control i klikając dalej.
Kliknij na 1D Amplitude, aby zwizualizować wykres kropkowy. Wybierz Threshold Multiple Wells, aby zastosować ten sam próg do więcej niż jednej studni. Wprowadź wartość progową opartą na tym, gdzie widoczna jest wyraźna separacja między kropelkami dodatnimi a ujemnymi.
Teraz dobrze obejrzyj sekcję danych, pokazującą opis próbki, wartości stężeń, liczbę akceptowanych kropelek oraz dodatnie i ujemne liczby kropel. Kliknij Zapisz, aby zarejestrować wyniki progowania. Ilościowa analiza RNA za pomocą testu ribogreen wykazała, że całe frakcje neuronów dają 212,85 nanogramów RNA na inserwację, podczas gdy frakcje neurytowe dają 42,75 nanograma.
Walidacja PCR wskazała, że zestaw pierwszy pierwszy jest najbardziej specyficzny dla transkrypcji Gap43, pokazując wyraźny pojedynczy pasmo. Niejednoznaczne wyniki PCR dla Gamma-aktyny skłoniły do przeprowadzenia testu gradientu temperatury z użyciem zestawu primerów drugiego, który wykazał najsilniejsze wzmocnienie w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Wykresy amplitudy RT-ddPCR wykazały wyraźne rozdzielenie kropelek dla Gamma-aktyny zarówno w próbkach całego neuronu, jak i neurytu, potwierdzając wiarygodne wykrywanie transkryptów.
W przypadku Gap43 prawie 23% puli mRNA znajduje się w neuritach, w porównaniu do Gamma-aktyny, gdzie w neuritach występuje tylko 5% puli mRNA, a w całej frakcji neuronów. Wykazaliśmy obecność struktur ziarnistych stresu w aksonach w warunkach fizjologicznych, które hamują lokalną syntezę białek. Nasz protokół oferuje niezawodną i spójną metodę izolowania przedziałów neuronalnych oraz wykrywania mRNA o niskim poziomie środowiskowym.
Przyszłe analizy skupią się na izolowaniu i charakteryzowaniu odrębnych poddomen aksonalnych, takich jak czopki wzrostu i trzony aksonalne, poza analizą objętościową.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę izolacji aksonalnych mRNA z wykorzystaniem wkładów z porowatych membran, umożliwiającą całkowite oddzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. Podejście to pozwala na absolutną kwantyfikację transkryptów o niskiej liczbie kopii, co ułatwia badanie transportu mRNA i lokalnej translacji z wysoką czułością i powtarzalnością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- ekspresja genów
- techniki izolacji RNA
Wprowadzenie
- Lokalna synteza białek odgrywa kluczową rolę w naprawie i rozwoju neuronów.
- Techniki detekcji mRNA o wysokiej czułości są niezbędne do badania rzadkich transkryptów mRNA w aksonach.
- Zrozumienie transportu mRNA i lokalnej translacji jest kluczowe dla badań w dziedzinie neuronauk.
- Izolacja przedziałów neuronalnych może usprawnić badanie ekspresji genów w specyficznych kontekstach komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie metody izolacji mRNA aksonalnego z neuronów i neurytów.
- Umożliwienie kwantyfikacji transkryptów o niskiej liczbie kopii przy użyciu RT-ddPCR.
- Ułatwienie badań nad transportem mRNA i lokalną translacją w neuronach.
Zastosowane metody
- Izolacja frakcji całych neuronów oraz neurytów przy użyciu wkładów z membran porowatych.
- Oczyszczanie RNA za pomocą trizolu i następująca po nim kwantyfikacja.
- Kropelkowa cyfrowa PCR z odwrotną transkrypcją (RT-ddPCR) do analizy transkryptów.
- Walidacja swoistości starterów oraz warunków amplifikacji dla transkryptów docelowych.
Główne wyniki
- Frakcje całych neuronów dostarczyły 212,85 nanogramów RNA na wkładkę, natomiast frakcje neurytów 42,75 nanogramów.
- Analiza RT-ddPCR wykazała wyraźną separację kropelek dla transkryptów docelowych, co potwierdziło wiarygodność detekcji.
- W neurytach znajduje się około 23% puli mRNA dla Gap43, w porównaniu do 5% dla Gamma-actin.
- Zaobserwowano obecność struktur ziarnistości stresowych w aksonach, co hamowało lokalną syntezę białek.
Wnioski
- Opracowany protokół oferuje niezawodną metodę izolacji przedziałów neuronalnych.
- Umożliwia on detekcję rzadko występujących mRNA z wysoką czułością.
- Przyszłe badania skoncentrują się na charakterystyce odrębnych poddomen aksonalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa izolacja aksonalnych mRNA przy użyciu wkładów z membran porowatych oraz techniki RT-ddPCR umożliwia precyzyjne mapowanie lokalizacji transkryptów, co jest kluczowym czynnikiem w zrozumieniu funkcji neuronów oraz mechanizmów chorobowych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez zapewnienie bezwzględnego ilościowania transkryptów o niskiej liczbie kopii w oddzielnych przedziałach neuronalnych. Metoda ta wspiera ciągłość translacyjną od wczesnego etapu odkryć po badania przedkliniczne, umożliwiając powtarzalną analizę RNA specyficzną dla poszczególnych przedziałów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie lokalizacji transkryptów w konkretnych przedziałach komórkowych w celu mechanistycznej oceny ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe oznaczanie mRNA zaangażowanego w wzrost i regenerację aksonów.
- Zwiększa pewność predykcyjną w analizie szlaków neuronalnych i selekcji projektów badawczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane systemy neuronalne do późniejszego przesiewania związków modulujących RNA.
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i ilościowe pomiary mRNA w różnych przedziałach komórkowych.
- Umożliwia wysokoczułą detekcję rzadkich transkryptów w celu wiarygodnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób, umożliwiając analizę zmian mRNA w aksonach w odpowiedzi na uraz lub stres.
- Wspiera ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez bezwzględną kwantyfikację zlokalizowanych transkryptów.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy naprawy i degeneracji neuronów, co pozwala na podejmowanie decyzji o rozwoju projektów w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, od wczesnego etapu testowania hipotez po walidację w modelach przedklinicznych, wspierając zarówno identyfikację celu, jak i badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących lokalnej translacji oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych w neuronach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne i ilościowe wyniki dla porównań między różnymi warunkami.
- Analityka: Dostarcza bezwzględne pomiary liczby kopii mRNA oraz wiarygodne wyniki statystyczne.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z modelami chorób i dopasowaniem biomarkerów.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje elastyczną, adaptowalną platformę dla różnorodnych podtypów neuronów i warunków eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w zakresie izolacji i kwantyfikacji RNA specyficznego dla poszczególnych przedziałów komórkowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie detekcji kluczowych transkryptyów z wysoką czułością.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój celów neurobiologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli neuronów, izolacji RNA oraz analizy metodą cyfrowego PCR.
- Wymagany jest dostęp do wkładów z porowatą membraną, aparatury do droplet digital PCR oraz oprogramowania analitycznego.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zminimalizowania kontaminacji krzyżowej i zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest dostosowalna do różnych podtypów neuronów, stadiów rozwojowych i modeli urazów, zgodnie z zakresem protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne związane z izolacją rzadkich mRNA aksonalnych oraz konieczność stosowania zwalidowanych starterów.
