Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Nasze badania analizują, jak lokalna synteza białek jest regulowana oraz jakie są jej role w naprawie neuronów, ich rozwoju i degeneracji. Najnowsze osiągnięcia obejmują techniki wykrywania mRNA o wysokiej czułości, takie jak gdPCR, do identyfikacji mRNA aksonalnych o niskiej obfitości oraz do kompartmentalizacji hodowli neuronalnych. Aby zacząć, należy podać 250 mikrolitrów triazolu do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, odpowiadającej każdej wkładce, do jednej dołki lub wkładki z płytki sześciodołkowej.

Odłóż rurki na bok do czasu potrzeby. Dodaj dwa mililitry sterylnego PBS do każdej dołki drugiej płyty sześciodołowej, aby liczba dołków lub płyt odpowiadała liczbie wkładów. Pipetą wyjmij medium hodowlane zarówno od górnego końca dołu, jak wkład i przenieś go do sześciodołowej płyty zawierającej PBS.

Teraz, używając kleszczy, delikatnie włóż wkładkę, a następnie dodaj na nią dwa mililitry PBS. Aspiruj PBS z obu stron i powtarzaj płukanie dwa razy. Następnie zostaw wkładkę w świeżym PBS.

Następnie użyj sterylnego skrobaka komórek, aby zeskrobać całą frakcję neuronu z góry wkładki. Pobierz lizat soma z wkładki. Przelej go do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Wiruj probówkę w temperaturze 10 000 do 15 000 G przez dwie minuty. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 250 mikrolitrach tryzolu. Oznacz tę rurkę jako całkowitą frakcję neuronu.

Aby zebrać frakcję neurytową, powoli przesuwaj jeden koniec sterylnego wacika w zygzakowatym wzorze od góry do dołu po całej stronie neuronu wkładki. Obróć wkład o 90 stopni i powtórz powtórzenie, używając drugiego końca wymazu. Następnie wyrzuć wymaz.

Użyj nowego wymazu i poruszaj się koncentrycznymi okręgami, zaczynając od środka wkładu na zewnątrz, dbając o oczyszczenie obwodu. Odwróć wkładkę tak, aby strona neurytowa była skierowana do góry. Przetnij membranę nowym, sterylnym ostrzem skalpela.

Przeciętą błonę umieść w sześciodołowej płycie zawierającej trizol, tak że strona neurytowa jest skierowana w dół. Upewnij się, że membrana jest zanurzona. Teraz zbierz trizol zawierający lizat neurytu ze studni.

Przelej go do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Kontynuuj izolację RNA lub przechowuj lizaty soma i neurity w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego przetwarzania. Przygotuj reakcje cyfrowego PCR z kroplami transkrypcji odwrotnej, wykorzystując Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix i celuj w specyficzne primery odpowiednim DNA.

Pipetować mieszaninę reakcyjną do wkładu generującego krople. Następnie dodaj olej generacyjny do wyznaczonych dołków wkładu. Teraz uszczelnij wkład uszczelką.

Wygeneruj krople za pomocą generatora kropel. Po wygenerowaniu kropelek należy je przenieść na płytę PCR z 96 dołkami i zamknąć folią, zanim płytę umieścimy w termocyklerze. Otwórz oprogramowanie QX Manager, aby rozpocząć analizę.

Kliknij opcję Przeglądaj i otwórz plik do analizy. Po załadowaniu pliku widok dashboardu pojawia się na lewym panelu. Wybierz interesujące się zagłębienia, przytrzymując klawisz Control i klikając dalej.

Kliknij na 1D Amplitude, aby zwizualizować wykres kropkowy. Wybierz Threshold Multiple Wells, aby zastosować ten sam próg do więcej niż jednej studni. Wprowadź wartość progową opartą na tym, gdzie widoczna jest wyraźna separacja między kropelkami dodatnimi a ujemnymi.

Teraz dobrze obejrzyj sekcję danych, pokazującą opis próbki, wartości stężeń, liczbę akceptowanych kropelek oraz dodatnie i ujemne liczby kropel. Kliknij Zapisz, aby zarejestrować wyniki progowania. Ilościowa analiza RNA za pomocą testu ribogreen wykazała, że całe frakcje neuronów dają 212,85 nanogramów RNA na inserwację, podczas gdy frakcje neurytowe dają 42,75 nanograma.

Walidacja PCR wskazała, że zestaw pierwszy pierwszy jest najbardziej specyficzny dla transkrypcji Gap43, pokazując wyraźny pojedynczy pasmo. Niejednoznaczne wyniki PCR dla Gamma-aktyny skłoniły do przeprowadzenia testu gradientu temperatury z użyciem zestawu primerów drugiego, który wykazał najsilniejsze wzmocnienie w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Wykresy amplitudy RT-ddPCR wykazały wyraźne rozdzielenie kropelek dla Gamma-aktyny zarówno w próbkach całego neuronu, jak i neurytu, potwierdzając wiarygodne wykrywanie transkryptów.

W przypadku Gap43 prawie 23% puli mRNA znajduje się w neuritach, w porównaniu do Gamma-aktyny, gdzie w neuritach występuje tylko 5% puli mRNA, a w całej frakcji neuronów. Wykazaliśmy obecność struktur ziarnistych stresu w aksonach w warunkach fizjologicznych, które hamują lokalną syntezę białek. Nasz protokół oferuje niezawodną i spójną metodę izolowania przedziałów neuronalnych oraz wykrywania mRNA o niskim poziomie środowiskowym.

Przyszłe analizy skupią się na izolowaniu i charakteryzowaniu odrębnych poddomen aksonalnych, takich jak czopki wzrostu i trzony aksonalne, poza analizą objętościową.