Name: Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-26T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj protokół leczenia farmakologicznego i analizy transkryptomicznej pojedynczych komórek w organoidach raka wątrobowokomórkowego. Metoda umożliwia szczegółowe badanie odpowiedzi komórek na terapię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Fundację Badań Podstawowych i Stosowanych Guangdong (2023A1515011416) oraz Fundację Badań Podstawowych i Stosowanych w Kantonie (2024A04J6575). Niektóre elementy schematu zostały stworzone przy użyciu Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) i zostały zaadaptowane przez autorów. Schematyczne ilustracje zostały stworzone przy użyciu Figdraw (https://www.figdraw.com) i zaadaptowane przez autorów.

<ol>
	<li>Villanueva, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).</li><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Safri, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+hepatocellular+carcinoma:+from+mechanisms+to+clinical+implications.">Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications.</a> Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).</li><li>Zhang, X. F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cell-state+plasticity+driven+by+FOXM1/CEBPB+axis+disrupts+developmental+heterogeneity+and+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma.">Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).</li><li>Thorel, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+organoids:+a+new+avenue+for+preclinical+research+and+precision+medicine+in+oncology.">Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology.</a> Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+liver+organoids:+advances+in+disease+modeling.">A decade of liver organoids: advances in disease modeling.</a> Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer+organoids+reveal+intratumor+and+interpatient+drug+response+heterogeneity.">Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity.</a> JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenomic+profiling+of+intra-tumor+heterogeneity+using+a+large+organoid+biobank+of+liver+cancer.">Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer.</a> Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+therapies+in+hepatocellular+carcinoma:+state+of+the+art+and+clinical+perspectives.">RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives.</a> Hepatoma Res. 10, 24 (2024).</li><li>Aissa, A. F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptional+changes+associated+with+drug+tolerance+and+response+to+combination+therapies+in+cancer.">Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer.</a> Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).</li><li>Zhang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+optimization+of+a+human+hepatocellular+carcinoma+patient-derived+organoid+model+for+potential+target+identification+and+drug+discovery.">Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery.</a> J Vis Exp. (198), e65785 (2023).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+and+challenges+of+organoid+models+for+assessing+cancer+immunotherapy:+a+cutting-edge+tool+for+advancing+personalised+treatments.">Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments.</a> Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+methods+of+different+tumor+organoids+and+their+application+in+tumor+drug+resistance+research.">Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research.</a> Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Yip, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+them+vasculature+and+immune+cells:+how+to+fill+the+gap+of+organoids.">Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids.</a> Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).</li><li>Zhou, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+organoid+culture+in+cancer+research.">Standardization of organoid culture in cancer research.</a> Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).</li></ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Aby zapewnić powtarzalność, efektywność i wysokiej jakości analizę transkryptomii pojedynczych komórek, kilka technicznych etapów w tym procesie wymaga starannej kontroli. Konsekwencja podczas ożywienia i rozszerzania organoidów HCC pochodzących od pacjenta jest kluczowa, ponieważ różnice gęstości nasiew, składu matrycy błony podstawnej oraz czasu hodowli mogą wpływać na morfologię, wzrost oraz reakcje na leczenie w dalszej fazieleczenia 13,14. Ponadto wysoka żyw...

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym rakiem wątroby u dorosłych i główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie 1,2,3. Słaby wynik kliniczny wynika ze znacznej heterogeniczności wewnątrzguza, co prowadzi do oporności na leczenie i nawrotu4. Najnowsze badania wskazują, że różnorodność rozwojowa i plastyczność stanów komórkowych, napędzana kluczowymi programami transkrypcyjnymi, takimi jak oś FOXM1/CEBPB, przyczyniają się do oporności terapeutycznej w HCC5. Te wyniki podkreślają potrzebę zrozumienia, jak populacje komórek nowotworowych adaptują się i przechodzą między stanami pod długotrwałą presją leczenia. Jednak większość modeli przedklinicznych nie oddaje w pełni dynamicznego, ciągłego charakteru tych przejść stanów związanych z leczeniem, co ogranicza mechanistyczne badania adaptacji guza i niepowodzenia terapeutycznego.
Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) stanowią użyteczną platformę do tego celu, ponieważ zachowują istotne zmiany genomowe oraz heterogeniczność komórek oryginalnego guza6. Organoidy HCC mogą być utrzymywane w hodowli długoterminowej, zachowując jednocześnie kluczowe cechy tkanki7, co czyni je szczególnie odpowiednimi do badań odpowiedzi na leczenie. Ponadto badania oparte na organoidach wykazały wykonalność wykorzystania organoidów raka wątroby do testów lekowych oraz do uchwycenia różnic między pacjentami i wewnątrzguzowymi w wrażliwości terapeutycznej, co potwierdza ich wartość jako modeli przedklinicznych badań nad leczeniem i odpowiedzią 8,9. Jednak większość badań nad lekami opartymi na organoidach nadal opiera się głównie na pomiarach żywotności końcowych lub koncentruje się głównie na masowych odpowiedziach fenotypowych, dostarczając tym samym tylko ograniczone informacje o heterogenicznych odpowiedziach komórkowych i zmianach transkrypcyjnych związanych z leczeniem. Równolegle szybki rozwój strategii terapeutycznych opartych na RNA dla HCC dodatkowo podkreśla potrzebę istnienia systemów przedklinicznych, które potrafią dokładnie przewidywać i mechanistycznie rozkładać odpowiedzi leczenia z rozdzielczością pojedynczych komórek10.
Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) umożliwia wysokorozdzielczą charakterystykę składu komórkowego i stanów transkrypcji w modelach organoidalnych11. Stosowane do organoidów pobranych przed i po leczeniu, scRNA-seq może ujawnić zmiany w ekspresji genów, przesunięcia populacji komórek oraz odpowiedzi heterogeniczne, które nie są uchwycone przez testy masowe. To podejście stanowi zatem praktyczną i skuteczną strategię badania remodelowania transkrypcyjnego związanego z leczeniem w organoidach HCC. Jednak praktyczny, powtarzalny sposób pracy integrujący hodowlę organoidów HCC, leczenie farmakologiczne oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu pozostaje niewystarczający. Taki przepływ pracy jest najskuteczniejszy, gdy podczas ekspozycji na leki zachowana jest integralność organoidów i odzyskiwana jest wystarczająca liczba żywotnych komórek do dalszego profilowania pojedynczych komórek. Podobnie jak w przypadku innych metod narządowych, ważne ograniczenia obejmują niepełną reprezentację stromalnych, naczyniowych i immunologicznych komponentów mikrośrodowiska nowotworowego, a także potencjalne błędy selekcji podczas długotrwałej hodowli in vitro.
Opisany jest zintegrowany eksperymentalny workflow do generowania organoidów HCC, stosowania zdefiniowanego leczenia leków oraz przetwarzania próbek organoidów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu. Ten proces obejmuje przywracanie i rozszerzanie organoidów, ocenę jakości przed leczeniem, kontrolowaną ekspozycję na leki oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek RNA dopasowanych próbek. Podejście to zapewnia praktyczne ramy do porównywania, w rozdzielczości pojedynczej komórki, zmian związanych z leczeniem w składzie komórkowym i programach ekspresji genów w organoidach HCC.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-gastrin I ludzki</td><td>Merck</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki 1,5 mL</td><td>Merck</td><td>AXYMCT150LC</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizy 1X RBC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml fiolki kriogeniczne z nitem wewnętrznym</td><td>Gniazdo</td><td>607001</td><td></td></tr><tr><td>A8301 (inhibitor TGFb)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne AFP</td><td>Proteintech</td><td>14550-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyalbuminowe [ALB/2144]</td><td>abcam</td><td>ab236492</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HNF-4-alfa [EPR16885] - Klasa ChIP</td><td>abcam</td><td>ab181604</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-prealbuminowe [EPR3219]</td><td>abcam</td><td>ab92469</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw SOX9 [EPR14335-78]</td><td>abcam</td><td>ab185966</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27 (503), minus witamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek, 100 mL</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Odczynnik używany do rozpuszczania matrycy błony podstawowej i odzyskiwania organoidów przed ponownym powlekiem lub dalszym przetwarzaniem</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo&reg; &nbsp; Analiza żywotności komórek 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteka & Biblioteka & Zestaw Gel Bead v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>CG000227</td><td></td></tr><tr><td>Sitnik komórek Corning, 40 & mu; m, Niebieski, S, IND, 1/50</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24-dołkowy przezroczysty płaski dno Ultra-niskie mocowanie Wielodołkowe płytki, indywidualnie owinięte, sterylne</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Obniżony Czynnik Wzrostu BME, Typ 2 PathClear (BME)</td><td>Merck</td><td>3533-005-02</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa wykorzystywana do wspierania trójwymiarowej hodowli organoidów i tworzenia kopuły</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>C6164</td><td>Rozpuszczalnik używany do przygotowywania roztworów zapasowych leków i kontroli pojazdów</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco/F-12 Ham</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td></tr><tr><td>E7080 (Lenvatinib)</td><td>Selleck</td><td>S1164</td><td>Inhibitor kinazy tyrozyny stosowany do leczenia organoidów i terapeutycznej perturbacji</td></tr><tr><td>Wartość płodowej surowicy bydłej FBS</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny</td><td>Beyotime</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop zmotoryzowany Leica DM6 B Fluorescencji</td><td>Leica</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2 (1003)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Merck</td><td>A0737-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL stożkowe rurki do wirówki z polipropylenem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym</td><td>BIOGRAFIA GENOMU</td><td>GNM20012</td><td>Bufor używany do płukania organoidów i przygotowania próbek do dalszego przetwarzania</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10°C</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho Y-27632 dichlorek</td><td>Merck</td><td>Y0503</td><td>Inhibitor ROCK stosowany w celu zwiększenia przeżywalności organoidów po rozmrażeniu lub przechodzeniu</td></tr><tr><td>Medium warunkowane R-spodin1</td><td>(Broutier i in.)</td><td>Nie ma</td><td>Wydzielanie linii komórkowych</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain, 0,4% filtrowany błonowo, przygotowany w 0,85% soli fizjologicznej</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express (1x), bez fenolu czerwonego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>Substytut trypsyny</td></tr><tr><td>Medium kondycjonowane Wnt-3a</td><td>(Broutier i in.)</td><td>Nie ma</td><td>Wydzielanie linii komórkowych</td></tr></tbody></table>

generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

Generation and Single-Cell Transcriptomic Analysis of Hepatocellular Carcinoma Organoids following Drug Treatment

Rak wątrobowokomórkowy jest główną przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami na całym świecie i charakteryzuje się wyraźną heterogenicznością wewnątrznową, co przyczynia się do zmiennych odpowiedzi leczenia, nawrotów guza oraz postępu choroby. Głębsze zrozumienie, jak komórki nowotworowe zmieniają się na poziomie transkrypcyjnym przed i po leczeniu farmakologicznym, jest zatem niezbędne dla poprawy strategii terapeutycznych. Jednak praktyczne eksperymentalne procesy łączące leczenie leków na bazie organoidów z profilowaniem transkryptomicznym pojedynczych komórek pozostają ograniczone. W tym badaniu opracowano ustandaryzowany workflow generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania zdefiniowanego leczenia lekowego oraz sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA na próbkach pobranych przed i po leczeniu. Protokół obejmuje ożywienie i rozszerzenie organoidów, ocenę jakości przed leczeniem, ekspozycję na leki, przygotowanie organoidów do dysocjacji pojedynczej komórki, konstrukcję biblioteki oraz podstawową analizę porównawczą danych transkryptomicznych pojedynczych komórek. Wprowadzane są kluczowe środki ostrożności techniczne, aby poprawić powtarzalność i jakość próbki. Ten przepływ umożliwia równoległą charakterystykę składu komórkowego i zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem farmakologicznymi w organoidach raka wątrobowokomórkowego. Protokół jest solidny, skalowalny i adaptowalny w różnych układach organoidalnych, zapewniając praktyczną platformę do badania zmian ekspresji genów związanych z leczeniem w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Rysunek 1 przedstawia proces generowania i charakterystyki organoidów raka hepatokomórkowego (HCC). Na Rysunku 1A pokazano wykorzystanie tkanek nowotworowych pochodzących od pacjentów do utworzenia kultur organoidów do analizy histologicznej oraz badań nad leczeniem. Rysunek 1B przedstawia obrazy organoidów w polu jasnym w 1. i 6. dniu po rekonwalescencji, co demonstruje ich przeżycie i ekspansję w standardowych warunkach hodowli tr...

Protokół ten określa uproszczoną metodę generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania leczenia farmakologicznego oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu w celu scharakteryzowania zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem.

Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

Hepatocellular carcinoma is a major cause of cancer-related mortality worldwide and is characterized by marked intratumoral heterogeneity, which ...

Skupiamy się na tym, jak organoidy HCC reagują na leczenie farmakologiczne oraz jak ich badania translacyjne zmieniają się w praktyce. Protokół ten jest przydatny dla organoidów HCC i może być również dostosowany do innych układów organoidów nowotworowych. Na początek należy ustalić raka wątrobowokomórkowego lub organoidy pochodzące od pacjentów z HCC i przygotować je do terapeutycznej perturbacji.Przygotuj roztwór zapasowy lenvatinibu w dimetylosiarku, czyli DMSO, zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńcz roztwór wywarowy w podgrzewczym medium kulturowym tuż przed użyciem do określonej koncentracji roboczej. Przygotuj wystarczający roztwór, aby osiągnąć równe końcowe objętości we wszystkich odwiertach, zapewniając takie samo stężenie DMSO w każdym odwiercie.Następnie dodaj podłoże zawierające lenwatyn w odległości 20 mikrotrzonowych wzdłuż ściany każdego dołka, aby nie zakłócać kopuł matrycy. Uwzględnij kontrolę pojazdu z tym samym końcowym stężeniem DMSO. Inkubuj organoidy w standardowych warunkach hodowli przez określony czas leczenia.W przypadku zabiegów przekraczających 72 godziny wymieniać medium zawierające lek co 48 do 72 godzin, zapewniając spójny harmonogram wymiany we wszystkich dołkach. Przed zabiegiem nagraj zdjęcia w jasnym polu bazowym. Wykonuj zdjęcia w stałych odstępach czasu podczas zabiegu, używając identycznych ustawień mikroskopu, powiększenia i pozycji pola.Do oceny odpowiedzi na zabieg opartej na morfologii stosuj identyczne ustawienia ekspozycji, powiększenie i progi analizy dla wszystkich obrazów. Zmierz krzywą wzrostu powierzchni organoidów, obliczając całkowitą powierzchnię organoidów na dołkę lub pole w każdym punkcie czasowym i normalizując wartości do poziomu wyjściowego. Aby zmierzyć średnią średnicę organoidu, określ średnicę pojedynczych nienaruszonych organoidów i oblicz średnią wartość na odwiert.Następnie określ liczbę zachowanych organoidów, licząc morfologicznie rozpoznawalne nienaruszone organoidy, wykluczając wszelkie szczątki i zapadające się fragmenty. Wykonaj trójwymiarowy test żywotności luminescencji w miejscu końcowym, jeśli potrzebna jest dodatkowa masowa ocena żywotności zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wykreśl krzywe wzrostu powierzchni organoidów w czasie.Porównaj średnią średnicę organoidów między grupami leczonymi subewancjonistą a leczonymi lenwatibem. Porównaj także liczbę ocalałych organoidów w różnych grupach leczenia. Dbaj o stosowanie regularnych harmonogramów obrazowania, kryteriów włączenia i parametrów analizy, aby zapewnić powtarzalność.Wybierane studnie organoidalne o zachowanej morfologii 3D, wystarczającej ilości materiału do wychwytywania pojedynczych komórek i bez widocznego skażenia. Nagrywaj obrazy jasnego pola każdego wybranego na długo przed dysocjacją, używając identycznych ustawień mikroskopu, powiększenia i wyboru pola. Zbierać organoidy w dopasowanych punktach czasowych w grupach kontrolnych i leczonych, zachowując identyczną gęstość płyt, harmonogram leczenia i warunki wymiany medium we wszystkich próbkach.Całkowicie aspiruj medium hodowlane z każdego dołku. Przepłucz każdą studnię dwukrotnie lodowatym PBS, aby usunąć pozostałości i zanieczyszczenia. Dodaj do każdego dołku jeden mililitr roztworu do odzyskiwania lodowatych komórek i inkubuj na lodzie przez 20 do 30 minut.Delikatnie pipetuj co pięć do siedmiu minut podczas inkubacji, aby ułatwić rozpuszczanie matrycy. Przenieś rozpuszczony materiał do wcześniej schłodzonych rurek za pomocą szerokiego otworu lub ciętej końcówki pipety, aby zminimalizować naprężenia ścinające. Przechodzimy do dysocjacji enzymatycznej dopiero po dużym rozpuszczeniu matrycy i minimalnym widocznym pozostałościami żelu.Wiruj odzyskaną zawiesinę organoidów przy 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant ostrożnie, nie ruszając granulki. Ponownie zawiesić pellet w jednym mililitrze enzymu rekombinowanego do dysocjacji komórki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do dziesięciu minut.Delikatnie pipetuj osiem do dziesięciu razy co dwie-trzy minuty, używając szerokiego końcówki P1000, aby sprzyjać dysocjacjacjom. Zatrzymaj trawienie, gdy większość fragmentów organoidów rozproszy się do pojedynczych komórek, a pozostaną tylko małe resztkowe skupiska. Następnie dodaj cztery mililitry lodowatego PBS zawierającego 2% surowicy bydła płodowego, aby zatrzymać trawienie.Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa o średnicy 40 mikrometrów. Raz umyj PBS, aby usunąć resztki enzymów, kruszywa i zanieczyszczenia. Policz komórki za pomocą wykluczenia trypana niebieskiego.Po upewnieniu się żywotności komórek na poziomie 85% lub wyższej, dostosuj końcowe stężenie komórek do 700 do 1 200 komórek na mikrolitr. Wyklucz próbki z nadmiarem zanieczyszczeń, obfitością martwych komórek, dużymi widocznymi agregatami lub niepełną dysocjacją. Powtórz filtrację przed załadowaniem, jeśli obecne są kruszywa.Kontrolowanie procesu i obróbka próbek w identycznych warunkach, w tym enzym dysocjacyjny, czas trawienia, częstotliwość pipetowania, metoda filtracji, stężenie komórek oraz strategia ładowania. Na koniec, po amplifikacji biblioteki pojedynczej komórki, wykonaj sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Organoid przetrwał i rozprzestrzenił się w standardowych warunkach trójwymiarowej hodowli od pierwszego do szóstego dnia po odzyskaniu.Pierwszego dnia organoidy pojawiały się jako małe, zwarte struktury, podczas gdy szóstego dnia wykazywały większy rozmiar i wyraźnie zdefiniowaną morfologię. Organoidy leczone lenvatinibem były mniejsze i wykazywały zmienioną morfologię w porównaniu do kontrolnych osób leczonych DMSO. Analiza ilościowa wykazała zmniejszenie średniej średnicy organoidów po leczeniu lenvatinibem w porównaniu do kontroli stosowanych przez DMSO.Protokół ten pozwala nam badać zmiany stanu komórek, skład komórkowy oraz ekspresję genów po leczeniu. Największym wyzwaniem jest zachowanie żywotności komórek, utrzymanie prostego przetwarzania spójnego we wszystkich grupach. Analizę komórkową można przeprowadzić zgodnie z tą procedurą, w tym klasteryzację, analizę eksperymentów genów różnicowych, analizę wzbogacenia szlaków oraz wnioskowanie o skarbie.

generation-single-cell-transcriptomic-analysis-hepatocellular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Generowanie i analiza transkryptomowa pojedynczych komórek organoidalnych raka wątrobowokomórkowego po leczeniu lekami

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Zapewniamy kompleksowy przegląd i udoskonalenie istniejących protokołów tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), obejmując wszystkie etapy hodowli organoidów. System ten służy jako cenny model do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i oceny skuteczności kandydatów na leki.

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Chemoembolizacja przeztętnicza (TACE) jest standardową terapią dla pacjentów w pośrednim stadium raka wątrobowokomórkowego i zazwyczaj jest wykonywana przez dostęp do tętnicy udowej. W porównaniu z dostępem przezudowym, dostęp przezpromieniowy (TRA) może zmniejszyć częstość powikłań krwotocznych i poprawić tolerancję pacjenta. Przedstawiono tutaj metodę wykonywania chemoembolizacji przeztętniczej przez dostęp do tętnicy promieniowej.

Chemoembolizacja dostępu transradialnego u pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Poznaj protokół leczenia farmakologicznego i analizy transkryptomicznej pojedynczych komórek w organoidach raka wątrobowokomórkowego. Metoda umożliwia szczegółowe badanie odpowiedzi komórek na terapię.

Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

Przeglądaj więcej filmów