Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym
May 26th, 2026
Protokół ten określa uproszczoną metodę generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania leczenia farmakologicznego oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu w celu scharakteryzowania zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem.
Skupiamy się na tym, jak organoidy HCC reagują na leczenie farmakologiczne oraz jak ich badania translacyjne zmieniają się w praktyce. Protokół ten jest przydatny dla organoidów HCC i może być również dostosowany do innych układów organoidów nowotworowych. Na początek należy ustalić raka wątrobowokomórkowego lub organoidy pochodzące od pacjentów z HCC i przygotować je do terapeutycznej perturbacji.
Przygotuj roztwór zapasowy lenvatinibu w dimetylosiarku, czyli DMSO, zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńcz roztwór wywarowy w podgrzewczym medium kulturowym tuż przed użyciem do określonej koncentracji roboczej. Przygotuj wystarczający roztwór, aby osiągnąć równe końcowe objętości we wszystkich odwiertach, zapewniając takie samo stężenie DMSO w każdym odwiercie.
Następnie dodaj podłoże zawierające lenwatyn w odległości 20 mikrotrzonowych wzdłuż ściany każdego dołka, aby nie zakłócać kopuł matrycy. Uwzględnij kontrolę pojazdu z tym samym końcowym stężeniem DMSO. Inkubuj organoidy w standardowych warunkach hodowli przez określony czas leczenia.
W przypadku zabiegów przekraczających 72 godziny wymieniać medium zawierające lek co 48 do 72 godzin, zapewniając spójny harmonogram wymiany we wszystkich dołkach. Przed zabiegiem nagraj zdjęcia w jasnym polu bazowym. Wykonuj zdjęcia w stałych odstępach czasu podczas zabiegu, używając identycznych ustawień mikroskopu, powiększenia i pozycji pola.
Do oceny odpowiedzi na zabieg opartej na morfologii stosuj identyczne ustawienia ekspozycji, powiększenie i progi analizy dla wszystkich obrazów. Zmierz krzywą wzrostu powierzchni organoidów, obliczając całkowitą powierzchnię organoidów na dołkę lub pole w każdym punkcie czasowym i normalizując wartości do poziomu wyjściowego. Aby zmierzyć średnią średnicę organoidu, określ średnicę pojedynczych nienaruszonych organoidów i oblicz średnią wartość na odwiert.
Następnie określ liczbę zachowanych organoidów, licząc morfologicznie rozpoznawalne nienaruszone organoidy, wykluczając wszelkie szczątki i zapadające się fragmenty. Wykonaj trójwymiarowy test żywotności luminescencji w miejscu końcowym, jeśli potrzebna jest dodatkowa masowa ocena żywotności zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wykreśl krzywe wzrostu powierzchni organoidów w czasie.
Porównaj średnią średnicę organoidów między grupami leczonymi subewancjonistą a leczonymi lenwatibem. Porównaj także liczbę ocalałych organoidów w różnych grupach leczenia. Dbaj o stosowanie regularnych harmonogramów obrazowania, kryteriów włączenia i parametrów analizy, aby zapewnić powtarzalność.
Wybierane studnie organoidalne o zachowanej morfologii 3D, wystarczającej ilości materiału do wychwytywania pojedynczych komórek i bez widocznego skażenia. Nagrywaj obrazy jasnego pola każdego wybranego na długo przed dysocjacją, używając identycznych ustawień mikroskopu, powiększenia i wyboru pola. Zbierać organoidy w dopasowanych punktach czasowych w grupach kontrolnych i leczonych, zachowując identyczną gęstość płyt, harmonogram leczenia i warunki wymiany medium we wszystkich próbkach.
Całkowicie aspiruj medium hodowlane z każdego dołku. Przepłucz każdą studnię dwukrotnie lodowatym PBS, aby usunąć pozostałości i zanieczyszczenia. Dodaj do każdego dołku jeden mililitr roztworu do odzyskiwania lodowatych komórek i inkubuj na lodzie przez 20 do 30 minut.
Delikatnie pipetuj co pięć do siedmiu minut podczas inkubacji, aby ułatwić rozpuszczanie matrycy. Przenieś rozpuszczony materiał do wcześniej schłodzonych rurek za pomocą szerokiego otworu lub ciętej końcówki pipety, aby zminimalizować naprężenia ścinające. Przechodzimy do dysocjacji enzymatycznej dopiero po dużym rozpuszczeniu matrycy i minimalnym widocznym pozostałościami żelu.
Wiruj odzyskaną zawiesinę organoidów przy 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant ostrożnie, nie ruszając granulki. Ponownie zawiesić pellet w jednym mililitrze enzymu rekombinowanego do dysocjacji komórki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do dziesięciu minut.
Delikatnie pipetuj osiem do dziesięciu razy co dwie-trzy minuty, używając szerokiego końcówki P1000, aby sprzyjać dysocjacjacjom. Zatrzymaj trawienie, gdy większość fragmentów organoidów rozproszy się do pojedynczych komórek, a pozostaną tylko małe resztkowe skupiska. Następnie dodaj cztery mililitry lodowatego PBS zawierającego 2% surowicy bydła płodowego, aby zatrzymać trawienie.
Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa o średnicy 40 mikrometrów. Raz umyj PBS, aby usunąć resztki enzymów, kruszywa i zanieczyszczenia. Policz komórki za pomocą wykluczenia trypana niebieskiego.
Po upewnieniu się żywotności komórek na poziomie 85% lub wyższej, dostosuj końcowe stężenie komórek do 700 do 1 200 komórek na mikrolitr. Wyklucz próbki z nadmiarem zanieczyszczeń, obfitością martwych komórek, dużymi widocznymi agregatami lub niepełną dysocjacją. Powtórz filtrację przed załadowaniem, jeśli obecne są kruszywa.
Kontrolowanie procesu i obróbka próbek w identycznych warunkach, w tym enzym dysocjacyjny, czas trawienia, częstotliwość pipetowania, metoda filtracji, stężenie komórek oraz strategia ładowania. Na koniec, po amplifikacji biblioteki pojedynczej komórki, wykonaj sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Organoid przetrwał i rozprzestrzenił się w standardowych warunkach trójwymiarowej hodowli od pierwszego do szóstego dnia po odzyskaniu.
Pierwszego dnia organoidy pojawiały się jako małe, zwarte struktury, podczas gdy szóstego dnia wykazywały większy rozmiar i wyraźnie zdefiniowaną morfologię. Organoidy leczone lenvatinibem były mniejsze i wykazywały zmienioną morfologię w porównaniu do kontrolnych osób leczonych DMSO. Analiza ilościowa wykazała zmniejszenie średniej średnicy organoidów po leczeniu lenvatinibem w porównaniu do kontroli stosowanych przez DMSO.
Protokół ten pozwala nam badać zmiany stanu komórek, skład komórkowy oraz ekspresję genów po leczeniu. Największym wyzwaniem jest zachowanie żywotności komórek, utrzymanie prostego przetwarzania spójnego we wszystkich grupach. Analizę komórkową można przeprowadzić zgodnie z tą procedurą, w tym klasteryzację, analizę eksperymentów genów różnicowych, analizę wzbogacenia szlaków oraz wnioskowanie o skarbie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a standardized workflow for generating hepatocellular carcinoma (HCC) organoids, applying drug treatment, and performing single-cell RNA sequencing to analyze transcriptional changes before and after treatment. The protocol is robust, scalable, and adaptable to other tumor organoid systems, enabling detailed characterization of cellular composition and gene expression changes associated with drug exposure.
Key Study Components
Area of Science
- Cancer biology
- Organoid technology
- Single-cell transcriptomics
Background
- Hepatocellular carcinoma is a leading cause of cancer-related deaths worldwide.
- Marked intratumoral heterogeneity in HCC contributes to variable treatment responses and disease progression.
- Understanding transcriptional changes in tumor cells before and after drug treatment is critical for improving therapies.
- Existing workflows connecting organoid-based drug treatment with single-cell transcriptomic profiling are limited.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for drug treatment and single-cell RNA sequencing of HCC organoids.
- To enable side-by-side comparison of cellular and transcriptional changes in response to therapy.
- To provide technical guidance for improving reproducibility and sample quality in organoid studies.
Methods Used
- Establishment and expansion of HCC patient-derived organoids.
- Drug treatment with lenvatinib and vehicle control under standardized conditions.
- Imaging and quantitative assessment of organoid morphology, area, diameter, and viability.
- Single-cell dissociation, viability assessment, and preparation for single-cell RNA sequencing.
- Comparative analysis of single-cell transcriptomic data, including clustering and pathway enrichment.
Main Results
- Lenvatinib-treated organoids showed reduced size and altered morphology compared to controls.
- Quantitative analysis revealed a decrease in mean organoid diameter after drug treatment.
- The protocol preserved high cell viability and reproducibility across samples.
- Single-cell RNA sequencing enabled detailed analysis of cell state, composition, and gene expression changes post-treatment.
Conclusions
- The workflow provides a practical and scalable approach for studying drug responses in HCC organoids at single-cell resolution.
- It facilitates robust comparative analysis of transcriptional changes associated with therapy.
- The protocol is adaptable to other organoid systems and supports downstream cellular analyses.
