Wizualizacja i ilościowa parowanie baz międzycząsteczkowych RNA w klastrach in vitro z wykorzystaniem raporterów RNA brokułów podzielonych
29 maja 2026
Protokół ten opisuje wizualny test z wykorzystaniem rozdzielonych reporterów RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro.
Stosujemy test raportowy z rozdzielonym RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro. Badania chemiczne i symulacje sugerują interakcje RNA, ale nie mogą ich bezpośrednio zmierzyć. Protokół ten umożliwia bezpośrednią, dokładną ocenę w klastrze RNA.
Po przygotowaniu szablonów DNA do transkrypcji RNA in vitro, przetrzyj powierzchnię roboczą, stojaki na rurki i pipety roztworem dekontaminacyjnym rybonukleazą. Stosuj filtrowane końcówki bez rybonukleazy do wszystkich etapów pipetowania. Rozmroź bufor reakcji i roztwory nukleotydów dostarczone w zestawie transkrypcyjnym wraz z urydynowym trifosforanem cyjaniny 5, czyli UTP-Cy5, na lodzie.
Wiruj wszystkie probówki z 2 000g przez dwie sekundy przed użyciem. Następnie oblicz liczbę zasad tyminy w DNA. Określ wymagane objętości UTP i UTP-Cy5 dla reakcji transkrypcyjnej 20 mikrolitrów, przy jednoczesnym zachowaniu stałej gęstości znakowania dla wszystkich gatunków RNA.
Następnie przygotuj reakcję transkrypcyjną o pojemności 20 mikrolitrów, łącząc prezentowane odczynniki. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i wiruj w 2 000g przez dwie sekundy. Po inkubacji reakcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin dodaj jeden mikrolitr deoksyrybonukleazy dołączonej do zestawu, dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i ponownie wirulej.
Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 15 minut. Przenieś reakcję do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 115 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy oraz 15 mikrolitrów roztworu stopowego octanowego amonu dołączonego do zestawu.
Po wymieszaniu wiruj roztwór w stężeniu 2 000g przez dwie sekundy. Następnie dodaj do probówki 150 mikrolitrów chloroformu fenolowego i delikatnie wymieszaj, aby połączyć fazy. Wirówka w 16 000g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przenieś górną fazę wodną do nowej rurki. Dodaj równą ilość chloroformu do przelanego roztworu i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić prawidłową interakcję fazową. Teraz wiruj w 16 000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powtórz proces rozdzielania fazowego jeszcze raz.
Następnie przenosi się warstwę wodną o objętości około 100 do 150 mikrolitrów do nowej rurki. Dodaj 900 mikrolitrów izopropanolu i dokładnie wymieszaj. Po alicytacie roztworu w osobnych probówkach przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc lub do miesiąca.
Wiruj próbkę RNA w izopropanolu w dawce 16 000g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń izopropanol, nie naruszając granulki RNA. Następnie do pelletu dodaj jeden mililitr etanolu 70% przygotowanego w wodzie wolnej od nukleazy.
Wirówka w temperaturze 16 000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu etanolu dodaj do rurki jeden mililitr etanolu 70% przygotowanego w wodzie wolnej od nukleazy i powtórz wirowanie. Podczas końcowego mycia etanolem usuń większość etanolu pipetą o pojemności 1 000 mikrolitrów.
Krótko wiruj w 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej i usuń resztki etanolu pipetą o pojemności 20 mikrolitrów. Po wyschnięciu pelletu RNA ponownie zawies go w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy. Trzymaj próbkę na lodzie i chroń ją przed światłem.
Za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego mierz stężenie i czystość RNA. Upewnij się, że współczynnik absorpcji 260 na 280 nanometrów wynosi około 2,0, a współczynnik 260 na 230 nanometrów jest większy niż 2,0. Rozmroź probówkę z roztworem sperminy 100 milimolowych i 50% glikolu polietylenowym 8 000 na lodzie.
Świeżo przygotuj bufor składania 10X RNA, łącząc pokazane składniki. Po dokładnym wymieszaniu składników przez pipetowanie, wiruj w 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej. W przypadku współskładania, w 200-mikrolitrowej probówce PCR połączyć in vitro transkrybowane RNA niosące sekwencję górną lub dolną, bufor RNA refoldujący oraz wodę wolną od nukleazy.
Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, oraz wirując, jak pokazano wcześniej. Podgrzej próbkę w 90 stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Natychmiast przełóż próbkę do temperatury pokojowej.
Chroń przed światłem i inkubuj przez godzinę. W przypadku oddzielnego składania podgrzej próbkę RNA w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie natychmiast umieści ją w lodzie na co najmniej 15 minut. W 200-mikrolitrowej probówce PCR połączyć in vitro transkrybowane RNA niosące sekwencję górną lub dolną, bufor składania RNA 10 razy oraz wodę wolną od nukleazy.
Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chronioną przed światłem. Następnie połącz próbki RNA zawierające górną i dolną sekwencję w jedną probówkę PCR i dokładnie wymieszaj przez pipetowanie w górę i w dół. Wirówka z 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej.
Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dla obu schorzeń należy dodać sześć mikrolitrów premixu 100 milimolarnych sperminy i 50% glikolu polietylenowego 8 000. Po wymieszaniu zawartości wiruj w 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej.
Teraz wymieszaj dwa mikrolitry jednego milimolowego DFHBI-1T do reakcji i ponownie wirulec. Załaduj reakcję do szklanej szklanej pokrywy. Inkubuj komorę w temperaturze pokojowej przez cztery godziny w ciemności, z pokrywą, aby zminimalizować parowanie.
Załaduj szklaną osłonę pokrywową na podium mikroskopu. Włącz laser, a następnie użyj okularów, aby zlokalizować i skupić się na próbce. Konfiguruj mikroskop tak, aby obrazował każdy obszar zainteresowania z kanałem 5 cyjaniny najpierw na każdej płaszczyźnie Z.
Następnie obrazuj ten sam obszar zainteresowania za pomocą zielonego kanału fluorescencyjnego. Ustaw czas naświetlania na 500 milisekund dla wszystkich kanałów. Następnie ustaw moc lasera na 80% dla zielonego kanału fluorescencyjnego białka i 40% dla kanału 5 cyjaniny.
Przy kroku Z wynoszącym 150 nanometrów można sfotografować obszar pokrycia na zewnątrz kropli reakcji w temperaturze pokojowej. Następnie zmierz liczbę parowań zasad międzycząsteczkowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Po indukcji klastrowania RNA oba RNA tworzyły klastry indywidualnie lub razem.
Fluorescencja DFHBI-1T w klastrzach RNA była znacznie niższa dla samych górnych lub dolnych RNA w porównaniu do warunków współskładania. W warunkach oddzielnego składania znormalizowany sygnał DFHBI-1T wynosił 0,031, co jest porównywalne z poziomami bazowymi obserwowanymi tylko na górze lub dole. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top i shu-anti-bottom wykazywały minimalną fluorescencję DFHBI-1T.
Współskładanie shu-top z shu-bottom lub shu-anti-top z shu-anty-bottom dawało silniejszy sygnał DFHBI-1T niż oddzielne składanie. Współskładanie shu-top i shu-bottom skutkowało 5,63-krotnym wzrostem znormalizowanej fluorescencji DFHBI-1T. Oddzielne fałdowanie shu-top i shu-bottom wykazało jedynie wzrost o 1,04 razy w porównaniu do poziomów wyjściowych.
Shu-top zmieszany z shu-anti-bottom i shu-anti-top zmieszany z shu-bottom wykazał wyższą fluorescencję DFHBI-1T niż pary o tej samej orientacji w obu warunkach składania. Współskładanie shu-top z shu-anti-bottom oraz shu-anti-top z shu-bottom skutkowało odpowiednio 61,86 i 82,60-krotnym wzrostem fluorescencji DFHBI-1T. Oddzielne składanie tych mieszanych par przyniosło mniejsze wzrosty odpowiednio o 2,69 i 4,94 razy.
Najważniejsze jest to, że silne generowanie sygnału może wymagać stłoczenia odczynników, podczas gdy czułość zależy od efektywnej dymeryzacji i składania rozszczepionych RNA brokułów. Test ten uzupełnia metody RNA pull down i elektroforezy żelowej do badania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA. Test ten może badać wpływ sekwencji RNA, helikaz i jonów na parowanie zasad międzycząsteczkowych w klastrze RNA.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
