Wizualizacja i ilościowa parowanie baz międzycząsteczkowych RNA w klastrach in vitro z wykorzystaniem raporterów RNA brokułów podzielonych
29 maja 2026
Protokół ten opisuje wizualny test z wykorzystaniem rozdzielonych reporterów RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro.
Stosujemy test raportowy z rozdzielonym RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro. Badania chemiczne i symulacje sugerują interakcje RNA, ale nie mogą ich bezpośrednio zmierzyć. Protokół ten umożliwia bezpośrednią, dokładną ocenę w klastrze RNA.
Po przygotowaniu szablonów DNA do transkrypcji RNA in vitro, przetrzyj powierzchnię roboczą, stojaki na rurki i pipety roztworem dekontaminacyjnym rybonukleazą. Stosuj filtrowane końcówki bez rybonukleazy do wszystkich etapów pipetowania. Rozmroź bufor reakcji i roztwory nukleotydów dostarczone w zestawie transkrypcyjnym wraz z urydynowym trifosforanem cyjaniny 5, czyli UTP-Cy5, na lodzie.
Wiruj wszystkie probówki z 2 000g przez dwie sekundy przed użyciem. Następnie oblicz liczbę zasad tyminy w DNA. Określ wymagane objętości UTP i UTP-Cy5 dla reakcji transkrypcyjnej 20 mikrolitrów, przy jednoczesnym zachowaniu stałej gęstości znakowania dla wszystkich gatunków RNA.
Następnie przygotuj reakcję transkrypcyjną o pojemności 20 mikrolitrów, łącząc prezentowane odczynniki. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i wiruj w 2 000g przez dwie sekundy. Po inkubacji reakcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin dodaj jeden mikrolitr deoksyrybonukleazy dołączonej do zestawu, dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i ponownie wirulej.
Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 15 minut. Przenieś reakcję do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 115 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy oraz 15 mikrolitrów roztworu stopowego octanowego amonu dołączonego do zestawu.
Po wymieszaniu wiruj roztwór w stężeniu 2 000g przez dwie sekundy. Następnie dodaj do probówki 150 mikrolitrów chloroformu fenolowego i delikatnie wymieszaj, aby połączyć fazy. Wirówka w 16 000g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przenieś górną fazę wodną do nowej rurki. Dodaj równą ilość chloroformu do przelanego roztworu i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić prawidłową interakcję fazową. Teraz wiruj w 16 000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powtórz proces rozdzielania fazowego jeszcze raz.
Następnie przenosi się warstwę wodną o objętości około 100 do 150 mikrolitrów do nowej rurki. Dodaj 900 mikrolitrów izopropanolu i dokładnie wymieszaj. Po alicytacie roztworu w osobnych probówkach przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc lub do miesiąca.
Wiruj próbkę RNA w izopropanolu w dawce 16 000g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń izopropanol, nie naruszając granulki RNA. Następnie do pelletu dodaj jeden mililitr etanolu 70% przygotowanego w wodzie wolnej od nukleazy.
Wirówka w temperaturze 16 000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu etanolu dodaj do rurki jeden mililitr etanolu 70% przygotowanego w wodzie wolnej od nukleazy i powtórz wirowanie. Podczas końcowego mycia etanolem usuń większość etanolu pipetą o pojemności 1 000 mikrolitrów.
Krótko wiruj w 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej i usuń resztki etanolu pipetą o pojemności 20 mikrolitrów. Po wyschnięciu pelletu RNA ponownie zawies go w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy. Trzymaj próbkę na lodzie i chroń ją przed światłem.
Za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego mierz stężenie i czystość RNA. Upewnij się, że współczynnik absorpcji 260 na 280 nanometrów wynosi około 2,0, a współczynnik 260 na 230 nanometrów jest większy niż 2,0. Rozmroź probówkę z roztworem sperminy 100 milimolowych i 50% glikolu polietylenowym 8 000 na lodzie.
Świeżo przygotuj bufor składania 10X RNA, łącząc pokazane składniki. Po dokładnym wymieszaniu składników przez pipetowanie, wiruj w 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej. W przypadku współskładania, w 200-mikrolitrowej probówce PCR połączyć in vitro transkrybowane RNA niosące sekwencję górną lub dolną, bufor RNA refoldujący oraz wodę wolną od nukleazy.
Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, oraz wirując, jak pokazano wcześniej. Podgrzej próbkę w 90 stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Natychmiast przełóż próbkę do temperatury pokojowej.
Chroń przed światłem i inkubuj przez godzinę. W przypadku oddzielnego składania podgrzej próbkę RNA w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie natychmiast umieści ją w lodzie na co najmniej 15 minut. W 200-mikrolitrowej probówce PCR połączyć in vitro transkrybowane RNA niosące sekwencję górną lub dolną, bufor składania RNA 10 razy oraz wodę wolną od nukleazy.
Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chronioną przed światłem. Następnie połącz próbki RNA zawierające górną i dolną sekwencję w jedną probówkę PCR i dokładnie wymieszaj przez pipetowanie w górę i w dół. Wirówka z 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej.
Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dla obu schorzeń należy dodać sześć mikrolitrów premixu 100 milimolarnych sperminy i 50% glikolu polietylenowego 8 000. Po wymieszaniu zawartości wiruj w 2 000g przez dwie sekundy w mini wirówce stołowej.
Teraz wymieszaj dwa mikrolitry jednego milimolowego DFHBI-1T do reakcji i ponownie wirulec. Załaduj reakcję do szklanej szklanej pokrywy. Inkubuj komorę w temperaturze pokojowej przez cztery godziny w ciemności, z pokrywą, aby zminimalizować parowanie.
Załaduj szklaną osłonę pokrywową na podium mikroskopu. Włącz laser, a następnie użyj okularów, aby zlokalizować i skupić się na próbce. Konfiguruj mikroskop tak, aby obrazował każdy obszar zainteresowania z kanałem 5 cyjaniny najpierw na każdej płaszczyźnie Z.
Następnie obrazuj ten sam obszar zainteresowania za pomocą zielonego kanału fluorescencyjnego. Ustaw czas naświetlania na 500 milisekund dla wszystkich kanałów. Następnie ustaw moc lasera na 80% dla zielonego kanału fluorescencyjnego białka i 40% dla kanału 5 cyjaniny.
Przy kroku Z wynoszącym 150 nanometrów można sfotografować obszar pokrycia na zewnątrz kropli reakcji w temperaturze pokojowej. Następnie zmierz liczbę parowań zasad międzycząsteczkowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Po indukcji klastrowania RNA oba RNA tworzyły klastry indywidualnie lub razem.
Fluorescencja DFHBI-1T w klastrzach RNA była znacznie niższa dla samych górnych lub dolnych RNA w porównaniu do warunków współskładania. W warunkach oddzielnego składania znormalizowany sygnał DFHBI-1T wynosił 0,031, co jest porównywalne z poziomami bazowymi obserwowanymi tylko na górze lub dole. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top i shu-anti-bottom wykazywały minimalną fluorescencję DFHBI-1T.
Współskładanie shu-top z shu-bottom lub shu-anti-top z shu-anty-bottom dawało silniejszy sygnał DFHBI-1T niż oddzielne składanie. Współskładanie shu-top i shu-bottom skutkowało 5,63-krotnym wzrostem znormalizowanej fluorescencji DFHBI-1T. Oddzielne fałdowanie shu-top i shu-bottom wykazało jedynie wzrost o 1,04 razy w porównaniu do poziomów wyjściowych.
Shu-top zmieszany z shu-anti-bottom i shu-anti-top zmieszany z shu-bottom wykazał wyższą fluorescencję DFHBI-1T niż pary o tej samej orientacji w obu warunkach składania. Współskładanie shu-top z shu-anti-bottom oraz shu-anti-top z shu-bottom skutkowało odpowiednio 61,86 i 82,60-krotnym wzrostem fluorescencji DFHBI-1T. Oddzielne składanie tych mieszanych par przyniosło mniejsze wzrosty odpowiednio o 2,69 i 4,94 razy.
Najważniejsze jest to, że silne generowanie sygnału może wymagać stłoczenia odczynników, podczas gdy czułość zależy od efektywnej dymeryzacji i składania rozszczepionych RNA brokułów. Test ten uzupełnia metody RNA pull down i elektroforezy żelowej do badania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA. Test ten może badać wpływ sekwencji RNA, helikaz i jonów na parowanie zasad międzycząsteczkowych w klastrze RNA.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół bezpośredniego wykrywania i ilościowego oznaczania międzycząsteczkowego parowania zasad w klastrach RNA in vitro z wykorzystaniem testu z reporterem split Broccoli RNA. Metoda ta wykorzystuje RNA znakowane fluorescencyjnie oraz system podzielonego aptameru do wizualizacji i pomiaru oddziaływań RNA–RNA, stanowiąc ilościową alternatywę dla sondowania chemicznego i przewidywań obliczeniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia molekularna
- Biochemia RNA
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Klasteryzacja RNA jest napędzana wielowartościowymi międzycząsteczkowymi oddziaływaniami RNA–RNA.
- Tradycyjne metody, takie jak sondowanie chemiczne i symulacje komputerowe, pozwalają wnioskować o tych oddziaływaniach, lecz nie mierzą ich bezpośrednio.
- Bezpośrednia ocena międzycząsteczkowego parowania zasad wewnątrz klastrów RNA była dotychczas ograniczona.
- System rozdzielonego aptameru RNA Broccoli umożliwia detekcję dimeryzacji RNA w oparciu o fluorescencję.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie metody wizualnej do bezpośredniej detekcji międzycząsteczkowego parowania zasad w klastrach RNA.
- Ilościowe określenie, w jaki sposób warunki klastrowania in vitro wpływają na oddziaływania RNA–RNA.
- Zapewnienie uzupełniającego podejścia do istniejących testów oddziaływań RNA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie matryc DNA i transkrypcja in vitro RNA znakowanych Cy5.
- Oczyszczanie transkrybowanych RNA za pomocą ekstrakcji fenolo-chloroformowej i precypitacji etanolem.
- Fałdowanie RNA w warunkach współfałdowania oraz oddzielnego fałdowania z dodatkiem reagentów zagęszczających (spermina, PEG 8000).
- Montaż rozdzielonych reporterów RNA Broccoli i dodanie fluoroforu DFHBI-1T.
- Obrazowanie fluorescencyjne z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i ilościowa analiza obrazu.
Główne wyniki
- Fluorescencja DFHBI-1T była znacznie wyższa w próbkach RNA poddanych wspólnemu fałdowaniu w porównaniu z kontrolami RNA fałdowanego oddzielnie lub pojedynczego RNA.
- Wspólne fałdowanie komplementarnych, podzielonych cząsteczek RNA Broccoli doprowadziło do wzrostu fluorescencji nawet 82,6-krotnie, co wskazuje na silne międzycząsteczkowe parowanie zasad.
- Pary o mieszanej orientacji (shu-top z shu-anti-bottom itd.) wykazały najwyższe wzrosty fluorescencji po wspólnym fałdowaniu.
- Generowanie silnego sygnału było zależne od odczynników zagęszczających oraz wydajnej dimeryzacji RNA.
Wnioski
- Test z podzielonym reporterem RNA Broccoli umożliwia bezpośrednią, ilościową ocenę międzycząsteczkowego parowania zasad w klastrach RNA.
- Metoda ta uzupełnia tradycyjne testy oddziaływań RNA, takie jak pull-downy oraz elektroforeza w żelu.
- Test może być wykorzystany do badania wpływu sekwencji RNA, helikaz oraz jonów na oddziaływania RNA–RNA in vitro.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia kwantyfikacja międzycząsteczkowego parowania zasad RNA in vitro wypełnia krytyczną lukę we wczesnej fazie odkryć, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do zjawisk klastrowania indukowanego przez RNA. Test z wykorzystaniem rozszczepionego reportera RNA Broccoli zapewnia ilościowy odczyt oparty na fluorescencji dla oddziaływań RNA–RNA, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz opracowywaniu testów. Możliwość ta usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez wyjaśnienie molekularnych podstaw klastrowania RNA w określonych warunkach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań RNA–RNA w obrębie zgrupowanych kompleksów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie specyficznego międzycząsteczkowego parowania zasad od asocjacji niespecyficznej.
- Dostarcza danych ilościowych służących do walidacji celu oraz podejmowania decyzji w początkowej fazie rozwoju portfolio.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów klastrów RNA do dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki fluorescencji do benchmarkingu testów.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu sekwencji, helikaz lub jonów na oddziaływania RNA–RNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami klastrowania RNA istotnymi dla przebiegu choroby w sytuacjach, gdy wymagana jest ciągłość mechanistyczna.
- Wspiera postępy skorygowane o ryzyko, dostarczając ilościowych, porównawczych wyników w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Zapewnia predykcyjną redukcję ryzyka dla strategii terapeutycznych celowanych w RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test włącza się w kontinuum procesu odkrywania, od walidacji celu opartej na hipotezie, poprzez opracowanie testu, aż po przedkliniczne badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie bezpośredniego międzycząsteczkowego parowania zasad, wyjaśniające mechanizmy klastrowania RNA.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki fluorescencji do analizy porównawczej.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie warunków fałdowania i wariantów sekwencji z wykorzystaniem znormalizowanych pomiarów fluorescencji.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań poprzez modelowanie oddziaływań RNA–RNA istotnych w kontekście chorób lub terapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma do zróżnicowanych badań nad oddziaływaniami RNA w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad klastrowaniem RNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje detekcję i kwantyfikację oddziaływań RNA–RNA dla skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach dla aktywów celowanych w RNA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o bezpośrednie, ilościowe dane mechanistyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biochemii RNA oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do obrazowania konfokalnego oraz infrastruktury do ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów przygotowania i zwijania RNA pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych sekwencji RNA lub modeli klastrowania.
- Czułość zależy od wydajnej dimeryzacji i zwijania rozszczepionych RNA Broccoli oraz zastosowania reagentów zagęszczających.
