Mikroskopia kontrastu fazowego i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC)

Mikroskopia świetlna jest jednym z najbardziej pomocnych narzędzi w dziedzinie badań biomedycznych. W zależności od zastosowania, do oglądania próbek pożądane są różne tryby oświetlenia. Ten film zademonstruje dwa tryby optyczne oświetlenia światłem przechodzącym, kontrast fazowy i DIC lub różnicową mikroskopię kontrastową interferencyjną.

Cześć, nazywam się Victoria San Frolic i pracuję w głównym ośrodku obrazowania optycznego w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio. Dzisiaj pokażę Ci, jak prawidłowo oglądać preparaty za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową. Więc zacznijmy.

Standardowa mikroskopia jasnego pola nie jest odpowiednia do oglądania przezroczystych i bezbarwnych próbek. Mikroskopia z kontrastem fazowym jest często stosowana do wytwarzania kontrastu dla przezroczystych, nieabsorbujących światła próbek biologicznych. Technika ta została odkryta przez Zurycha w 1942 roku, który otrzymał za swoje osiągnięcie Nagrodę Nobla.

Mikroskop z kontrastem fazowym to mikroskop światła jasnego pola z dodatkiem specjalnych obiektywów z kontrastem fazowym, które zawierają płytkę fazową lub pierścień oraz pierścień kondensatora zamiast membrany. Pierścień jest zwykle umieszczony w wieżyczce skraplacza, a rozmiar pierścienia należy dobrać do różnych celów. Po ustawieniu oświetlenia Kohlera należy wybrać odpowiedni obiektyw fazowy, a następnie obrócić odpowiedni pierścień fazowy na miejsce w kondensatorze.

Gdy pierścień fazowy obiektywu i pierścień kondensatora zostaną odpowiednio ustawione tak, aby były koncentryczne i nakładały się na siebie, możemy obejrzeć próbkę i odpowiednio wyregulować ostrość. Pokażmy więc, jak wygląda kontrast fazowy pod mikroskopem. Oto spojrzenie na plasterek wątroby szczura.

Pod kontrastem fazowym. Metoda ta poprawia wygląd materiału biologicznego poprzez zmianę kontrastu z różnych odcieni szarości na odcienie z czarnego na biały. Zauważysz jednak, że okazy są otoczone aureolą, która zasłania delikatną strukturę.

Ta aureola jest artefaktem oświetlenia przez pierścień fazowy. Teraz zauważysz, że kiedy przełączymy się na jasne pole, ten okaz jest bardzo trudny do oglądania. Przełączając się z powrotem na kontrast fazowy, możemy wyraźnie zobaczyć strukturę i kształt komórek w tkance wątroby szczura od czasu jej wprowadzenia pod koniec lat 1960.

Różnicowy kontrast interferencyjny lub mikroskopia DIC jest popularna w badaniach biomedycznych, ponieważ tworzy obrazy o wysokiej rozdzielczości drobnych struktur poprzez uwydatnienie kontrastowych interfejsów, wytwarzany obraz ma bardzo cienki przekrój optyczny. W rzeczywistości zdolność DIC do wytwarzania przekrojów optycznych sprawiła, że jest to użyteczny sposób oświetlenia światłem przechodzącym dla firmowej mikroskopii konfokalnej. Mikroskop DIC to mikroskop światła jasnego pola z dodatkiem następujących elementów, polaryzatora między źródłem światła a kondensatorem.

Pryzmat rozdzielający wiązkę DIC w tarcie kondensatora, pryzmat łączący wiązkę DIC znajdujący się tuż za obiektywem i analizator w przestrzeni nieskończoności, zanim te dwa się złączą. Aby uzyskać najlepszą wydajność optyki DIC, ważne jest, aby najpierw ustawić mikroskop świetlny do oświetlenia Kohlera, a następnie umieścić elementy DIC w ścieżce optycznej. Światło ze źródła przechodzi przez polaryzator, a następnie jest rozdzielane przez pierwszy pryzmat.

Te sparowane wiązki poruszają się blisko siebie. Jeśli obie pary przeszły przez ten sam materiał w próbce, to gdy są ponownie łączone przez drugi pryzmat, nie przeszkadzają sobie nawzajem i dlatego wydają się szare. Jednak na krawędzi konstrukcji jedna belka gruszki przechodzi przez inny materiał niż jej partner i ulega zmianie.

Kiedy te wiązki zostaną ponownie połączone przez drugi pryzmat, będą interferować, tworząc konstruktywną jasną plamę lub niszcząco wytwarzając ciemną plamę. Oto spojrzenie na okrzemki w kontraście DIC. Zauważysz, że drobne szczegóły struktury okrzemki są łatwo widoczne.

Jeśli jednak optyka DIC zostanie usunięta, szczegóły te znikną. Kontrast w poprzek próbki jest jasny z jednej strony i ciemniejszy z drugiej. Sprawia to wrażenie topografii, ale w rzeczywistości jest to złudzenie.

Kierunek efektu rzucania cienia można odwrócić, obracając polaryzator przez punkt przecięcia do przeciwnego kontrastu. Właśnie sprawdziliśmy tryby optyczne kontrastu fazowego i DIC. Dla przypomnienia, eliminacja kontrastu fazowego uwydatnia kontrastowe próbki od czarnych do białych i jest przydatna do oglądania próbek, które są zarówno bezbarwne, jak i przezroczyste.

DIC generuje również kontrast z próbką. Odbywa się to poprzez tworzenie obrazu o wysokiej rozdzielczości cienkiego przekroju optycznego. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w mikroskopii.