Protokoły zakażania larw motyli (Lepidoptera) baculowirusami przy użyciu mikroaplikatora
23 sierpnia 2008
W niniejszym filmie prezentujemy dwie techniki z użyciem mikroaplikatora do zakażania larw motyli z rzędu Lepidoptera baculowirusem w celu określenia efektywności owadobójczej.
Podczas gdy specyficzny dla stawonogów wirus baculovirus jest wykorzystywany jako standardowe narzędzie badawcze w systemach ekspresji białek eukariotycznych, jest on również rozwijany jako bezpieczny dla środowiska środek owadobójczy, który może zwalczać owady roślinożerne, takie jak lepidoptera, w naturze. Larwy lepidoptera zostają zainfekowane przez wirusy baculovirus podczas spożywania zainfekowanych liści. Larwy lub gąsienice przyjmują wirusa baculovirus w formie znanej jako wielościen, który stanowi kompleks cząsteczek wirusa zamkniętych w dużej krystalicznej strukturze białkowej chroniącej wirusa przed wysychaniem.
Po zainfekowaniu larwy, wirus rozprzestrzenia infekcję w obrębie owada. Wirus przejmuje mechanizmy syntezy kwasów nukleinowych i białek gospodarza, aby produkować więcej wirionów i poliedrów. W końcu larwy zostają tak silnie zainfekowane wirusem, że rozkładają się w gęstą masę poliedrów, która ścieka na powierzchnie roślin zjadane przez owady, a następnie cykl rozpoczyna się od nowa, aby określić skuteczność owadobójczą konkretnego Baca.
Techniki mikroaplikacji szczepów Avir oraz bioanalizy mogą być stosowane łącznie. Larwy Leid dorin można zakażać poprzez wstrzyknięcie wirusa bezpośrednio do HemosIL lub jamy ciała, a następnie ocenić wskaźniki śmiertelności. Ponadto larwy mogą być zakażane polihedrami za pomocą wstrzykiwania wspomaganego mikroaplikatorem doustnym, co pozwala na badanie czasu zakażenia jelit oraz innych tkanek.
Witam, jestem Wendy Sparks z laboratorium Briana E. Boninga na Wydziale Entomologii Uniwersytetu Stanowego Iowa oraz z Boning Snap. Dzisiaj zaprezentujemy dwie procedury zakażania laboratoryjnych osobników *Drosophila melanogaster* wirusem 백락 (backlog virus). Obie metody wykorzystują mikroaplikator.
Najpierw pokażę, jak użyć mikroaplikatora do podania wirusa do głowy poprzez przedsionek. Następnie pokażę, jak użyć mikroaplikatora do podania polihidratu do środkowej części gardła poprzez pysk. Zatem zacznijmy.
W przypadku opracowywania wirusów z rodzaju balo w celach owadobójczych, zazwyczaj zawierają one gen poliedru, aby ułatwić infekcję doustną larw szkodników. Niemniej jednak, zdarzają się sytuacje, w których istnieją powody, by przetestować wirusa baccula pozbawionego poliedru pod kątem potencjalnych efektów owadobójczych lub aby ominąć przewód pokarmowy owada. W takim przypadku, przed rozpoczęciem testu, można przeprowadzić wstrzyknięcie wirusa przy użyciu mikroaplikatora w celu zainfekowania larw.
Miano roztworu roboczego wirusa zbuforowanego należy oznaczyć za pomocą metody płytek wirusowych lub testów rozcieńczeń końcowych. W eksperymentach fizjologicznych typowe są iniekcje w dawce 5 × 10⁴ PFU na jeden H VNS piątego stadium larwalnego. Aby rozpocząć ten bioassay, należy nalać każde rozcieńczenie wirusa zbuforowanego do plastikowej strzykawki Herkule o pojemności 1 cc z ostrzem o rozmiarze 28.5 lub 32 G.
Zazwyczaj dla każdej larwy można użyć od 1 do 3 µL roztworu wirusa o mianie od 10⁷ do 10⁸ na ml, tak że pobranie od 300 do 500 µL do strzykawki jest wystarczające w większości przypadków. Następnie należy usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, trzymając ją pionowo, aby powietrze przemieściło się do końcówki igły, i wypuścić je.
Następnie przymocuj strzykawkę do rurki wsporczej strzykawki. Teraz ustaw objętość na 1,0 µl. Przed podaniem każdej kropli należy najpierw skalibrować jednostkę sterującą mikroaplikatora w mikroprocesorowej jednostce sterującej, aby upewnić się, że dozowana jest prawidłowa objętość; prędkość dozowania kropli można ustawić w zakresie od 0 do 9.
Zazwyczaj stosuje się zakres od zera do jednego. Naciśnij przełącznik nożny, aby upewnić się, że roztwór jest dozowany prawidłowo. Pamiętaj, że jeśli dozowany jest zbyt duży объем roztworu lub jeśli aplikacja przebiega zbyt wolno, ustawienia objętości i prędkości można regulować do momentu, aż odpowiednia ilość roztworu będzie aplikowana z właściwą prędkością.
Jestem teraz gotowy do rozpoczęcia iniekcji w celu wywołania infekcji H VNS. Zazwyczaj iniekcje wykonuje się u larw we wczesnym piątym stadium rozwojowym, ponieważ większy rozmiar późniejszych stadiów ułatwia proces wstrzykiwania. Wprowadź końcówkę igły przez stopę jednej z odnóży krocznych do jam ciała.
Należy pamiętać, że podczas wprowadzania końcówki igły do przedsionka, należy zmienić pozycję ciała larwy, aby uniknąć uszkodzenia jelita i ściany ciała. Następnie należy nacisnąć przełącznik nożny cztery razy, aby podać 4 µL roztworu wirusa do hemocelu. Po zakończeniu iniekcji wszystkie larwy należy przenieść z powrotem do inkubatora w temperaturze 28 °C. Należy często sprawdzać, czy nie ma martwych larv oraz upewnić się, że przeżyłe larwy mają dostęp do odpowiedniej diety.
Mimo że późne stadia larwalne nie giną w wyniku uszkodzenia kutykuli powstałego podczas wstrzykiwania, larwy należy mimo to sprawdzić 24 godziny po zabiegu w przypadku uszkodzenia jelita, które mogłoby wynikać z infekcji bakteryjnej. Tę wczesną śmiertelność należy wykluczyć z analizy danych. W przypadku stosowania bioanalizy z pomocą mikroaplikatora z użyciem wirusa w celu wyznaczenia dawki letalnej, bioanalizę należy powtórzyć trzy lub cztery razy w oddzielnych próbach.
Użyj 30 osobników na dawkę dla każdego wirusa lub grupy kontrolnej. Użyj odpowiedniego programu do analizy probitowej, takiego jak polo lub SAS, aby obliczyć wartości lc 50, 95% przedziały ufności oraz odpowiednie statystyki. Ten biotest może być również wykorzystany do wyznaczenia wartości czasu przeżycia ST 50 po inokulacji stałą dawką wirusa.
W tym przypadku śmiertelność larw ocenia się co cztery do ośmiu godzin, przeprowadzając częstsze obserwacje. Jeśli wskaźnik śmiertelności jest wysoki, mediany czasu przeżycia w granicach przedziału ufności 95% oblicza się za pomocą estymatora Kaplana-梅ера, korzystając z programu S-Plus lub SAS. Harran zaprezentował Państwu bioanalizę wspomaganą mikroaplikatorem z użyciem wirusa zbuforowanego.
Przedstawię teraz analizę. W przypadku stosowania poliedrów, doustna inokulacja poliedrów bezpośrednio do jelita owada jest wykorzystywana, gdy kluczowe jest dokładne określenie czasu zakażenia. Na przykład podczas monitorowania rozprzestrzeniania się wirusa w organizmie owada, aby rozpocząć tę analizę, należy zawiesić poliedry w obojętnym wypornościowo roztworze gliceryny i wody w proporcji 3:2 w stężeniu od 10 do 300.
Wielościenne ciało inkluzyjne (polyhedra) można wykorzystać na przykład w przypadku poczwarki czwartego stadium. Następnie należy nabić ten roztwór do plastikowej lub szklanej strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 CC z tępą igłą o rozmiarze 32 G. Pod mikroskopem należy umieścić strzykawkę na rurce wsporczej mikroaplikatora.
Przytrzymaj czwartą lub piątą larvę w stadium gwiazdy, wprowadź igłę przez otwory gębowe do przedniego odcinka jelita środkowego, a następnie podaj poliedra. Technika ta wymaga pewnej wprawy. Po pierwsze, przy założonych rękawiczkach może być trudno utrzymać larwy, nie zgniatając ich.
Po drugie, przeprowadzenie igły obok aparatów gębowych wymaga pewnej wprawy. Zalecamy przećwiczenie inokulacji około 30 larw za pomocą PBS. Jeśli dojdzie do przebicia jelita, będzie to oczywiste, ponieważ larwy ulegną melanizacji i szybko poczernieją.
Ponownie, ponieważ inokulacja doustna wspomagana mikroaplikatorem pozwala na określenie dokładnego czasu zakażenia, metoda ta jest najbardziej przydatna w eksperymentach, w których czas infekcji jest istotny dla ustalenia sposobu rozprzestrzeniania się wirusa w organizmie owada. Na przykład wirusy wykazujące aktywność beta-galaktozydazy mogą być podane doustnie larwom, które następnie poddaje się sekcji w różnych punktach czasowych, aby ustalić, które tkanki zostają zainfekowane. Przedstawimy dwa sposoby zakażenia owadów z użyciem mikroaplikatora. Pierwszym z nich jest bezpośrednia inokulacja poprzez odnoga kroczną, co pozwala pominąć fizjologię jelita i ocenić śmiertelność oraz czas przeżycia po zakażeniu badanym wirusem.
Drugą techniką była bezpośrednia inokulacja do jelita środkowego z wykorzystaniem poliedrów. Pozwala to na dostarczenie bardzo precyzyjnej dawki bezpośrednio do jelita środkowego, a także na ścisłą kontrolę czasu wystąpienia zdarzenia. Następnie można badać śmiertelność oraz inne fenotypy wirusa.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że larwy zabite wirusem baula są zazwyczaj delikatne i mogą łatwo pęknąć, uwalniając wirusa. Należy zatem wysterylizować powierzchnie robocze oraz w odpowiedni sposób zutylizować skażone rękawiczki i materiały jednorazowe, aby zapobiec kontaminacji. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.
Przegląd
W niniejszym filmie zaprezentowano dwie techniki z użyciem mikroaplikatora do zakażania larw motyli z grupy lepidoptera baculowirusami w celu oceny ich skuteczności owadobójczej. Metody te obejmują bezpośrednie wstrzykiwanie wirusa w formie budżetowej oraz inokulację doustną wielościanów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Entomologia
- Wirusologia
- Badania nad insektycydami
Wprowadzenie
- Baculowirusy są wykorzystywane w badaniach do ekspresji białek eukariotycznych.
- Są one rozwijane jako bezpieczne dla środowiska insektycydy.
- Larwy motyli i ciem z rzędu Lepidoptera mogą zostać zainfekowane poprzez spożycie zainfekowanych liści.
- Wirus może spowodować rozkład larw do postaci poliedrycznej mazi, co kontynuuje cykl infekcji.
Cel badania
- Zaprezentowanie metod zakażania larw bakulowirusami.
- Ocena skuteczności owadobójczej różnych szczepów bakulowirusów.
- Przedstawienie protokołów biotestów służących do oceny śmiertelności larw.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie zawiesiny wirusa do hemocoelu larw.
- Inokulacja doustna poliedrów do jelita larw.
- Zastosowanie mikroaplikatorów do precyzyjnego podawania roztworów wirusowych.
- Ocena wskaźników śmiertelności i czasu infekcji.
Główne wyniki
- Obie metody skutecznie zakażają larwy motyli z rzędu Lepidoptera baculowirusem.
- Iniekcja umożliwia kontrolowaną ocenę efektów działania wirusa.
- Inokulacja doustna pozwala na poznanie czasu przebiegu infekcji.
- Testy biologiczne mogą służyć do wyznaczenia stężeń letalnych oraz czasu przeżycia.
Wnioski
- Techniki z użyciem mikroaplikatora są skuteczne w badaniu infekcji bakulowirusowych.
- Metody te mogą pomóc w ocenie potencjału bakulowirusów jako insektycydów.
- Dalsze badania mogą pozwolić na optymalizację tych technik dla różnych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne dostarczanie czynników wirusowych do modeli owadziego pozwala na mechanistyczną minimalizację ryzyka w przypadku biopestycydów opartych na baculowirusach poprzez izolację zmiennych infekcyjnych i kwantyfikację zależności dawka-odpowiedź. Wspiera to walidację celów w ścieżkach entomologicznych oraz zwiększa wiarygodność prognostyczną testów letalności przed wdrożeniem w warunkach polowych. Metoda ta pomaga w przesiewaniu szczepów wirusowych pod kątem potencjału owadobójczego i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac na wczesnym etapie rozwoju preparatów biologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczanie kontrolowanych dawek bakulowirusa z pominięciem fizjologii jelit, co pozwala na ocenę bezpośrednich efektów tkankowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez standaryzowany wstrzyk w mikroaplikator wirusa wypączkowanego do hemocelu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez izolację czasu infekcji i wzorców rozprzestrzeniania się wirusa w celu oceny fenotypu letalnego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów badań, umożliwiając podawanie poliedrów drogą doustną do jelita środkowego z precyzyjną kontrolą czasu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki zastosowaniu skalibrowanego mikroaplikatora do podawania określonych mian wirusa (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Wartość skalowalności: Wykazuje gotowość do prowadzenia badań przesiewowych poprzez powtórzenie bioassayów trzy- lub czterokrotnie z użyciem 30 osobników na dawkę w celu wyznaczenia LC₅₀.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wspiera badania systemów istotnych w kontekście chorób, umożliwiając badanie rozprzestrzeniania się wirusa w tkankach po infekcji ukierunkowanej na jelita lub infekcji systemowej.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez pomiar śmiertelności i czasu przeżycia (ST₅₀) z wykorzystaniem estymatora Kaplana-Meiera.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących wyboru szczepu wirusa w oparciu o wyniki dotyczące stężenia letalnego i czasu przeżycia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności – umożliwiając ilościowe modelowanie infekcji u gospodarzy z rzędu Lepidoptera.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie precyzyjnego dostarczania wirusa do konkretnych tkanek (hemocoel lub jelita środkowego) w celu wyizolowania mechanizmów patogenezy.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość do analizy poprzez standaryzowane protokoły z użyciem mikroaplikatora do dostarczania poliedrów lub wirusów pączkujących z kontrolą objętości (krople 1,0 µL) i ustawieniami prędkości (skala 0–1).
- Analityka: Wskazuje na ilościowe wyniki, takie jak ocena śmiertelności co 4–8 godzin, obliczanie LC₅₀ za pomocą Polo lub SAS oraz szacowanie ST₅₀ przy użyciu analizy Kaplana-Meiera.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając sekcje zainfekowanych larw w określonych odstępach czasowych w celu śledzenia dynamiki infekcji specyficznej dla tkanek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia mikroaplikator jako platformę wielokrotnego użytku do standaryzowanego wyzwania wirusowego w ramach programów badawczo-rozwojowych nad insektycydami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu, ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej dróg infekcji oraz wyjaśnienie kinetyki rozprzestrzeniania się wirusa.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dostarczania wirusa poprzez kalibrację mikroaplikatora oraz dawkowanie za pomocą strzykawki.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa w screeningu szczepów oraz zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach opracowywania biopestycydów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja szczepów baculowirusów skorygowana o ryzyko, oparta na ilościowych danych dotyczących śmiertelności i czasu infekcji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza z zakresu obchodzenia się z owadami, obsługi mikroaplikatora oraz projektowania testów biologicznych.
- Instrumentarium obejmuje mikroaplikator z sterowaniem mikroprocesorowym, rurkę wspierającą strzykawkę, igły o rozmiarze 28,5–32 G oraz inkubatory ustawione na 28°C.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga spójnego oznaczania miana wirusa (metodą plackową lub rozcieńczeń końcowych), kalibracji objętości oraz protokołów oceny śmiertelności.
- Kwestie adaptacyjne obejmują wybór stadium larwalnego (wczesne piąte stadium dla iniekcji, czwarte/piąte dla podania doustnego), monitorowanie integralności jelit oraz unikanie kontaminacji bakteryjnej po iniekcji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują delikatność larw po zakażeniu, konieczność sterylnej utylizacji martwych osobników oraz wykluczenie wczesnej śmiertelności wynikającej z urazu podczas iniekcji.
