Protokoły wspomaganego mikroaplikatorem zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem
August 23rd, 2008
W tym filmie demonstrujemy dwie techniki mikroaplikatora używane do infekowania larw lepidoptera bakulowirusem w celu określenia skuteczności insektycydów.
Podczas gdy wirus bakali specyficzny dla stawonogów jest używany jako standardowe narzędzie badawcze dla systemów ekspresji białek eukariotycznych, jest on również opracowywany jako bezpieczny dla środowiska środek owadobójczy, który może zabijać w naturze owady roślinożerne, takie jak Lepidoptera. Larwy Lepidoptera są zarażone wirusami Baccala podczas jedzenia zainfekowanych liści. Larwy lub gąsienice połykają wirusa Baccala w postaci znanej jako wielościan, który jest kompleksem cząsteczek wirusa upakowanych w dużą krystaliczną strukturę białkową, która chroni wirusa przed wysuszeniem.
Gdy larwa zostanie zainfekowana, zatkany wirus rozprzestrzenia infekcję w owadzie. Wirus przejmuje kontrolę nad maszynerią syntezy kwasów nukleinowych i białek gospodarza, aby wytworzyć więcej wirusa i wielościanów. W końcu larwy zostają tak dokładnie zainfekowane wirusem, że rozpuszczają się w niechlujny szlam wielościanów, który kapie na powierzchnie roślin zjedzonych przez owada, a następnie cykl zaczyna się od nowa, aby określić skuteczność owadobójczą danego Baca.
Można łączyć techniki mikroaplikatora szczepu Avir i testy biologiczne. Larwy Leid dorin mogą zostać zakażone przez wstrzyknięcie cieniowanego wirusa bezpośrednio do HemosIL lub jamy ciała, a wskaźniki śmiertelności można ocenić. Ponadto larwy można zarazić wielościanami za pomocą doustnego wstrzyknięcia wspomaganego mikroaplikatorem i można określić czas infekcji jelit i innych tkanek.
Cześć, jestem Wendy Sparks i pracuję w laboratorium Briana e trybowania na Wydziale Entomologii na Uniwersytecie Stanowym Iowa. Dzisiaj pokażemy Państwu dwie procedury infekowania przewodu laboratoryjnego DI wirusem zaległości. W obu metodach wykorzystuje się mikro aplikator.
Po pierwsze, pokażę, że używasz mikro aplikatora, aby dostarczyć wirusa ciała do heni do heni przez prole. Następnie, gdy pokażesz, użyj mikroaplikatora, aby dostarczyć nagłówek polietylenowy do środkowej osłony za pomocą myszy. Więc zacznijmy.
Wirusy balo, opracowane do celów owadobójczych, zwykle zawierają gen wielościanu, który ułatwia doustną infekcję larw szkodników. Czasami jednak istnieją powody, aby przetestować wielościennego ujemnego wirusa Baccala pod kątem potencjalnych skutków owadobójczych lub ominąć jelita owada. W takim przypadku można wykonać wstrzyknięcie cieniowanego wirusa za pomocą mikroaplikatora w celu zakażenia larw przed rozpoczęciem testu.
Miano zapasu roboczego cieniowanego wirusa należy określić za pomocą testu płytki nazębnej lub testu rozcieńczenia w punkcie końcowym. W przypadku eksperymentów fizjologicznych typowe byłyby zastrzyki pięć razy 10 do czwartego PFU na piąty stopień rozwojowy H VNS. Aby rozpocząć ten test biologiczny, załaduj każde cieniowane rozcieńczenie wirusa do plastikowej strzykawki o pojemności jednego cm3 do herkulesa z ostrą końcówką igły o rozmiarze 28,5 lub 32.
Zwykle od jednego do trzech mikrolitrów cieniowanego roztworu wirusa. Przy mianie od 10 do siódmego, minus 10 do ósmego na mililitr można zastosować dla każdej larwy, tak że załadowanie od 300 do 500 mikrolitrów do strzykawki jest wystarczające do większości celów. Następnie wypchnąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, trzymając strzykawkę pionowo, aby doprowadzić powietrze do końcówki igły i dozować.
Następnie przymocować strzykawkę do rurki podtrzymującej strzykawkę. Teraz ustaw głośność na 1,0 mikrolitra. Dla każdej kropli w mikroprocesorowej jednostce sterującej mikroaplikatora należy najpierw skalibrować jednostkę sterującą, aby zapewnić dozowanie właściwej objętości, prędkość, z jaką dozowana jest kropla, można ustawić w skali od zera do dziewięciu.
Powszechnie stosowany jest zakres od zera do jednego. Naciśnij przełącznik nożny, aby upewnić się, że roztwór jest odpowiednio dozowany. Należy pamiętać, że w przypadku dozowania zbyt dużej ilości roztworu lub zbyt wolnej aplikacji, ustawienia objętości i prędkości można regulować, aż do nałożenia odpowiedniej objętości roztworu w odpowiedniej dawce.
Jestem teraz gotowy do rozpoczęcia wstrzykiwania w przypadku infekcji H VNS. Wczesne, piąte, larwy w stadium rozwojowym są zwykle wstrzykiwane, większy rozmiar późniejszych stadium rozwojowych ułatwia proces wstrzykiwania. Włóż końcówkę igły przez płaszczyznę jednej z nóg pro i do jamy ciała.
Uwaga, gdy końcówka igły wbije się w prole, zmień pozycję ciała larwy Aby uniknąć uszkodzenia jelita i ściany ciała, teraz naciśnij przełącznik nożny cztery razy, aby dostarczyć cztery mikrolitry roztworu wirusa do uszczelki hemo. Po zakończeniu wstrzykiwań wszystkie larwy należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Często sprawdzaj, czy nie ma martwych larw i upewnij się, że dostępna jest odpowiednia dieta dla larw, które przeżyły.
Mimo że późne stadium rozwoju nie umiera z powodu uszkodzenia naskórka w wyniku wstrzyknięcia, larwy powinny być nadal badane 24 godziny po wstrzyknięciu w przypadku uszkodzenia jelita, które może wynikać z infekcji bakteryjnej. Ta wczesna śmiertelność powinna być wyłączona z analizy danych. W przypadku stosowania testu biologicznego wspomaganego mikroaplikatorem z cieniowanym wirusem do testów biologicznych o śmiertelnym stężeniu, test biologiczny należy powtórzyć trzy lub cztery razy przy różnych okazjach.
Stosować 30 osób na dawkę dla każdego wirusa lub leczenia kontrolnego. Użyj odpowiedniego programu do analizy spadkowej, takiego jak polo lub SAS, aby obliczyć wartości lc 50, 95% przedziały ufności i odpowiednie statystyki. Ten test biologiczny może być również wykorzystany do określenia wartości czasu przeżycia ST 50 po inokulacji ustaloną dawką wirusa.
W tym przypadku śmiertelność larw jest oceniana co cztery do ośmiu godzin z częstszymi obserwacjami. Jeśli współczynnik śmiertelności jest wysoki, mediana czasów przeżycia w granicach ufności 95% jest obliczana przy użyciu estymatora Kaplana, Meyera przy użyciu programu s plus lub SAS. Teraz, gdy Harran pokazał Ci test biologiczny wspomagany mikroaplikatorem przy użyciu cieniowanego wirusa.
Pokażę ci test. Stosowanie wielościanów Doustne inokulowanie wielościanów bezpośrednio do jelita owada stosuje się, gdy dokładny czas infekcji jest krytyczny. Na przykład, podczas monitorowania, w jaki sposób wirus rozprzestrzenia się w owadzie, aby rozpocząć ten test, zawiesić wielościany w neutralnie pływającym roztworze gliceryny i wody trzy do dwóch od 10 do 300.
Wielościan może być używany na przykład dla czwartego stadium rozwoju. Następnie załaduj ten roztwór do plastikowej lub szklanej strzykawki tuberkulinowej CC z igłą o końcówce 32 rozmiarów. Umieść strzykawkę na rurce podtrzymującej mikroaplikatora, patrząc w dół mikroskopu.
Przytrzymaj czwartą lub piątą larwę gwiazdy, włóż igłę przez usta do przedniej części jelita środkowego, a następnie dostarcz wielościany. Ta technika wymaga pewnej praktyki. Po pierwsze, trzymanie larw w rękawiczkach bez ich zgniatania może być trudne.
Po drugie, potrzeba trochę praktyki, aby przesunąć igłę obok części ustnych. Zalecamy przećwiczenie inokulacji około 30 larw PBS. Jeśli zdarzy ci się przebić jelito, będzie to oczywiste, ponieważ larwy melanizują i dość szybko stają się czarne.
Ponownie, ponieważ inokulacja doustna wspomagana mikroaplikatorem zapewnia dokładny czas infekcji, metoda ta jest najbardziej przydatna w eksperymentach, w których czas infekcji jest ważny dla określenia, w jaki sposób wirus rozprzestrzenia się w owadzie. Na przykład wirusy wykazujące ekspresję beta galaktoz mogą być doustnie inokulowane do larw, które są następnie preparowane w różnych punktach czasowych w celu określenia, które tkanki zostaną zainfekowane, kiedy Pokażemy Ci tylko dwa naczynia wspomagane mikroaplikatorem do infekcji. Miłość owadów z vir, z których pierwszym była bezpośrednia inokulacja za pomocą pro Legg cieniowanego wirusa, a to pozwala ominąć fizjologię jelit i ocenić śmiertelność i czas śmiertelności wirusa, który Cię interesuje.
Drugą techniką była bezpośrednia inokulacja do jelita środkowego za pomocą wielościanów. Pozwala to na dostarczenie bardzo precyzyjnej dawki bezpośrednio do jelita środkowego, a także kontrolę w celu bardzo precyzyjnego wyczucia czasu zdarzenia. Następnie można również badać śmiertelność i inne fenotypy wirusa.
Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że larwy zabite przez wirusa baula są zazwyczaj delikatne i mogą łatwo pęknąć, uwalniając wirusa. Dlatego sterylizuj powierzchnie robocze i pozbywaj się zanieczyszczonych rękawic i materiałów jednorazowego użytku w odpowiedni sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w eksperymencie.
Przegląd
To wideo demonstruje dwie techniki mikroaplikowania do zakażania larw motyli wirusem bakulovirus w celu oceny efektywności owadobójczej. Metody obejmują bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa do hemocoelu oraz oralne szczepienie polihedrycznymi strukturami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Entomologia
- Wirusologia
- Badania nad owadobójczością
Tło
- Wirusy bakulovirus są wykorzystywane w badaniach do ekspresji białek eukariotycznych.
- Rozwija się je jako środki owadobójcze bezpieczne dla środowiska.
- Larwy motyli mogą zostać zakażone poprzez połknięcie zarażonych liści.
- Wirus może powodować, że larwy stopniowo rozpuszczają się w polihedralnym płynie, kontynuując cykl infekcji.
Cel badania
- Przedstawić metody zakażania larw wirusem bakulovirus.
- Ocenić owadobójczą skuteczność różnych szczepów bakulovirusu.
- Dostarczyć protokołów biotestów oceniających śmiertelność larw.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie wirusa do hemocoelu larw.
- Oralne szczepienie polihedrycznymi strukturami do jelit larw.
- Zastosowanie mikroaplikatorów do precyzyjnego dostarczenia roztworów wirusowych.
- Ocena wskaźników śmiertelności i czasu infekcji.
Główne wyniki
- Obie metody skutecznie zakażają larwy motyli wirusem bakulovirus.
- Wstrzyknięcie pozwala na kontrolowane ocenę efektów wirusa.
- Oralne szczepienie dostarcza informacji o czasie infekcji.
- Biotesty mogą określić śmiertelne stężenia i czas przeżycia.
Wnioski
- Techniki mikroaplikowania są skuteczne w badaniach nad infekcjami wirusem bakulovirus.
- Te metody mogą pomóc w ocenie potencjału wirusów bakulovirus jako środków owadobójczych.
- Dalsze badania mogą optymalizować te techniki do różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise delivery of viral agents to insect models enables mechanistic de-risking of baculovirus-based biopesticides by isolating infection variables and quantifying dose-response relationships. This supports target validation in entomological pathways and predictive confidence in lethality assays prior to field deployment. The method aids in screening viral strains for insecticidal potency and informs go/no-go decisions in early-stage biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering controlled doses of baculovirus to bypass gut physiology and assess direct tissue effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through standardized microapplicator-assisted injection of budded virus into the hemocoel.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by isolating infection timing and dissemination patterns for lethal phenotype assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling oral inoculation of polyhedra into the midgut with precise temporal control.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through calibrated microapplicator delivery of defined virus titers (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Scalability Value: Highlights screening readiness via replication of bioassays three to four times with 30 individuals per dose for LC₅₀ determination.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant systems by enabling study of virus dissemination in tissues following gut-targeted or systemic infection.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by measuring mortality and survival time (ST₅₀) using Kaplan-Meier estimator.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on viral strain selection based on lethal concentration and survival time outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing by enabling quantitative infection modeling in lepidopteran hosts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise delivery of virus to specific tissues (hemocoel or midgut) to isolate mechanisms of pathogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through standardized microapplicator protocols for delivering polyhedra or budded virus with volume control (1.0 µL droplets) and speed settings (0–1 scale).
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as mortality scoring every 4–8 hours, LC₅₀ calculation via Polo or SAS, and ST₅₀ estimation using Kaplan-Meier analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling time-resolved dissection of infected larvae to track tissue-specific infection dynamics.
- Enterprise Reuse: Frames the microapplicator as a reusable platform for standardized viral challenge across insecticidal R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in infection routes, and clarification of viral dissemination kinetics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viral delivery via microapplicator calibration and syringe-based dosing.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in strain screening, and reduced late-stage biological risk in biopesticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of baculovirus strains based on quantified lethality and infection timing data.
Implementation Considerations
- Required expertise in entomological handling, microapplicator operation, and bioassay design.
- Instrumentation includes microapplicator with microprocessor control, syringe support tube, 28.5–32 gauge needles, and incubators at 28°C.
- Cross-team standardization requires consistent virus titer determination (plaque or endpoint dilution), volume calibration, and mortality scoring protocols.
- Adaptation considerations include larval instar selection (early fifth instar for injection, fourth/fifth for oral), gut integrity monitoring, and avoidance of bacterial contamination post-injection.
- Practical limitations include larval fragility post-infection, need for sterile disposal of cadavers, and exclusion of early mortality from injection trauma.
