Protokoły wspomaganego mikroaplikatorem zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem

W tym filmie demonstrujemy dwie techniki mikroaplikatora używane do infekowania larw lepidoptera bakulowirusem w celu określenia skuteczności insektycydów.

Podczas gdy wirus bakali specyficzny dla stawonogów jest używany jako standardowe narzędzie badawcze dla systemów ekspresji białek eukariotycznych, jest on również opracowywany jako bezpieczny dla środowiska środek owadobójczy, który może zabijać w naturze owady roślinożerne, takie jak Lepidoptera. Larwy Lepidoptera są zarażone wirusami Baccala podczas jedzenia zainfekowanych liści. Larwy lub gąsienice połykają wirusa Baccala w postaci znanej jako wielościan, który jest kompleksem cząsteczek wirusa upakowanych w dużą krystaliczną strukturę białkową, która chroni wirusa przed wysuszeniem.

Gdy larwa zostanie zainfekowana, zatkany wirus rozprzestrzenia infekcję w owadzie. Wirus przejmuje kontrolę nad maszynerią syntezy kwasów nukleinowych i białek gospodarza, aby wytworzyć więcej wirusa i wielościanów. W końcu larwy zostają tak dokładnie zainfekowane wirusem, że rozpuszczają się w niechlujny szlam wielościanów, który kapie na powierzchnie roślin zjedzonych przez owada, a następnie cykl zaczyna się od nowa, aby określić skuteczność owadobójczą danego Baca.

Można łączyć techniki mikroaplikatora szczepu Avir i testy biologiczne. Larwy Leid dorin mogą zostać zakażone przez wstrzyknięcie cieniowanego wirusa bezpośrednio do HemosIL lub jamy ciała, a wskaźniki śmiertelności można ocenić. Ponadto larwy można zarazić wielościanami za pomocą doustnego wstrzyknięcia wspomaganego mikroaplikatorem i można określić czas infekcji jelit i innych tkanek.

Cześć, jestem Wendy Sparks i pracuję w laboratorium Briana e trybowania na Wydziale Entomologii na Uniwersytecie Stanowym Iowa. Dzisiaj pokażemy Państwu dwie procedury infekowania przewodu laboratoryjnego DI wirusem zaległości. W obu metodach wykorzystuje się mikro aplikator.

Po pierwsze, pokażę, że używasz mikro aplikatora, aby dostarczyć wirusa ciała do heni do heni przez prole. Następnie, gdy pokażesz, użyj mikroaplikatora, aby dostarczyć nagłówek polietylenowy do środkowej osłony za pomocą myszy. Więc zacznijmy.

Wirusy balo, opracowane do celów owadobójczych, zwykle zawierają gen wielościanu, który ułatwia doustną infekcję larw szkodników. Czasami jednak istnieją powody, aby przetestować wielościennego ujemnego wirusa Baccala pod kątem potencjalnych skutków owadobójczych lub ominąć jelita owada. W takim przypadku można wykonać wstrzyknięcie cieniowanego wirusa za pomocą mikroaplikatora w celu zakażenia larw przed rozpoczęciem testu.

Miano zapasu roboczego cieniowanego wirusa należy określić za pomocą testu płytki nazębnej lub testu rozcieńczenia w punkcie końcowym. W przypadku eksperymentów fizjologicznych typowe byłyby zastrzyki pięć razy 10 do czwartego PFU na piąty stopień rozwojowy H VNS. Aby rozpocząć ten test biologiczny, załaduj każde cieniowane rozcieńczenie wirusa do plastikowej strzykawki o pojemności jednego cm3 do herkulesa z ostrą końcówką igły o rozmiarze 28,5 lub 32.

Zwykle od jednego do trzech mikrolitrów cieniowanego roztworu wirusa. Przy mianie od 10 do siódmego, minus 10 do ósmego na mililitr można zastosować dla każdej larwy, tak że załadowanie od 300 do 500 mikrolitrów do strzykawki jest wystarczające do większości celów. Następnie wypchnąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, trzymając strzykawkę pionowo, aby doprowadzić powietrze do końcówki igły i dozować.

Następnie przymocować strzykawkę do rurki podtrzymującej strzykawkę. Teraz ustaw głośność na 1,0 mikrolitra. Dla każdej kropli w mikroprocesorowej jednostce sterującej mikroaplikatora należy najpierw skalibrować jednostkę sterującą, aby zapewnić dozowanie właściwej objętości, prędkość, z jaką dozowana jest kropla, można ustawić w skali od zera do dziewięciu.

Powszechnie stosowany jest zakres od zera do jednego. Naciśnij przełącznik nożny, aby upewnić się, że roztwór jest odpowiednio dozowany. Należy pamiętać, że w przypadku dozowania zbyt dużej ilości roztworu lub zbyt wolnej aplikacji, ustawienia objętości i prędkości można regulować, aż do nałożenia odpowiedniej objętości roztworu w odpowiedniej dawce.

Jestem teraz gotowy do rozpoczęcia wstrzykiwania w przypadku infekcji H VNS. Wczesne, piąte, larwy w stadium rozwojowym są zwykle wstrzykiwane, większy rozmiar późniejszych stadium rozwojowych ułatwia proces wstrzykiwania. Włóż końcówkę igły przez płaszczyznę jednej z nóg pro i do jamy ciała.

Uwaga, gdy końcówka igły wbije się w prole, zmień pozycję ciała larwy Aby uniknąć uszkodzenia jelita i ściany ciała, teraz naciśnij przełącznik nożny cztery razy, aby dostarczyć cztery mikrolitry roztworu wirusa do uszczelki hemo. Po zakończeniu wstrzykiwań wszystkie larwy należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Często sprawdzaj, czy nie ma martwych larw i upewnij się, że dostępna jest odpowiednia dieta dla larw, które przeżyły.

Mimo że późne stadium rozwoju nie umiera z powodu uszkodzenia naskórka w wyniku wstrzyknięcia, larwy powinny być nadal badane 24 godziny po wstrzyknięciu w przypadku uszkodzenia jelita, które może wynikać z infekcji bakteryjnej. Ta wczesna śmiertelność powinna być wyłączona z analizy danych. W przypadku stosowania testu biologicznego wspomaganego mikroaplikatorem z cieniowanym wirusem do testów biologicznych o śmiertelnym stężeniu, test biologiczny należy powtórzyć trzy lub cztery razy przy różnych okazjach.

Stosować 30 osób na dawkę dla każdego wirusa lub leczenia kontrolnego. Użyj odpowiedniego programu do analizy spadkowej, takiego jak polo lub SAS, aby obliczyć wartości lc 50, 95% przedziały ufności i odpowiednie statystyki. Ten test biologiczny może być również wykorzystany do określenia wartości czasu przeżycia ST 50 po inokulacji ustaloną dawką wirusa.

W tym przypadku śmiertelność larw jest oceniana co cztery do ośmiu godzin z częstszymi obserwacjami. Jeśli współczynnik śmiertelności jest wysoki, mediana czasów przeżycia w granicach ufności 95% jest obliczana przy użyciu estymatora Kaplana, Meyera przy użyciu programu s plus lub SAS. Teraz, gdy Harran pokazał Ci test biologiczny wspomagany mikroaplikatorem przy użyciu cieniowanego wirusa.

Pokażę ci test. Stosowanie wielościanów Doustne inokulowanie wielościanów bezpośrednio do jelita owada stosuje się, gdy dokładny czas infekcji jest krytyczny. Na przykład, podczas monitorowania, w jaki sposób wirus rozprzestrzenia się w owadzie, aby rozpocząć ten test, zawiesić wielościany w neutralnie pływającym roztworze gliceryny i wody trzy do dwóch od 10 do 300.

Wielościan może być używany na przykład dla czwartego stadium rozwoju. Następnie załaduj ten roztwór do plastikowej lub szklanej strzykawki tuberkulinowej CC z igłą o końcówce 32 rozmiarów. Umieść strzykawkę na rurce podtrzymującej mikroaplikatora, patrząc w dół mikroskopu.

Przytrzymaj czwartą lub piątą larwę gwiazdy, włóż igłę przez usta do przedniej części jelita środkowego, a następnie dostarcz wielościany. Ta technika wymaga pewnej praktyki. Po pierwsze, trzymanie larw w rękawiczkach bez ich zgniatania może być trudne.

Po drugie, potrzeba trochę praktyki, aby przesunąć igłę obok części ustnych. Zalecamy przećwiczenie inokulacji około 30 larw PBS. Jeśli zdarzy ci się przebić jelito, będzie to oczywiste, ponieważ larwy melanizują i dość szybko stają się czarne.

Ponownie, ponieważ inokulacja doustna wspomagana mikroaplikatorem zapewnia dokładny czas infekcji, metoda ta jest najbardziej przydatna w eksperymentach, w których czas infekcji jest ważny dla określenia, w jaki sposób wirus rozprzestrzenia się w owadzie. Na przykład wirusy wykazujące ekspresję beta galaktoz mogą być doustnie inokulowane do larw, które są następnie preparowane w różnych punktach czasowych w celu określenia, które tkanki zostaną zainfekowane, kiedy Pokażemy Ci tylko dwa naczynia wspomagane mikroaplikatorem do infekcji. Miłość owadów z vir, z których pierwszym była bezpośrednia inokulacja za pomocą pro Legg cieniowanego wirusa, a to pozwala ominąć fizjologię jelit i ocenić śmiertelność i czas śmiertelności wirusa, który Cię interesuje.

Drugą techniką była bezpośrednia inokulacja do jelita środkowego za pomocą wielościanów. Pozwala to na dostarczenie bardzo precyzyjnej dawki bezpośrednio do jelita środkowego, a także kontrolę w celu bardzo precyzyjnego wyczucia czasu zdarzenia. Następnie można również badać śmiertelność i inne fenotypy wirusa.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że larwy zabite przez wirusa baula są zazwyczaj delikatne i mogą łatwo pęknąć, uwalniając wirusa. Dlatego sterylizuj powierzchnie robocze i pozbywaj się zanieczyszczonych rękawic i materiałów jednorazowego użytku w odpowiedni sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w eksperymencie.