Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

Summary

Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

Abstract

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקה של microinjection לאחד תאים בשלב עוברי medaka. Medaka הוא דג קטן ההטלה מים מתוקים המאפשר ניתוח הן גנטיות העוברית הוא אחד היצורים מודל חוליות שבו הגנום כולו פנוטיפ מונחה מסכי מוטציה בוצעו ^1, כמו דג הזברה והעכבר. החפיפה סטייה תפקודית של גנים הקשורים בין medaka ו דג הזברה מאפשר זיהוי של פנוטיפים רומן כי הם ניתנים לזיהוי ב זן יחיד ^2, ובכך medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

כדי לנצל את הדגים medaka אשר עוברים הם שקופים ולפתח חיצונית, microinjection היא טכניקה חיונית להזריק תא קליעים נותבים עבור תאים, mRNAs תיוג או תחושה אנטי oligonucleotides במשך-לבטא ו דפיקות מטה הגנים של עניין, DNAs להכנת מהונדס הקווים.

Protocol

1. הזדווגות איסוף ביצים

1. Medaka נקבה וזכר יכולים בקלות להיות מכובדת על ידי גודל וצורה של סנפיר אנאלי הגבי. סנפירי האנאלי של הזכרים גדולים בצורת מקבילית בהשוואה לזו של הנקבות. סנפיר אנאלי הנשי הוא קטן בצורת משולש. סנפיר הגב זכר יש חריץ עמוק לעין בין שתי הקרניים האחרונות.
2. Medaka שכבו עד 40 ביצים כל יום ונקבות medaka לשאת ביצים התקבצו ליד הבטן שלהם על ידי חוטים מצורף במשך כמה שעות לפני שהם פשט על הצמחים באקווריום.
3. נקבות יכול להיות לכוד ברשת וקבע בתוך בעדינות משני הצדדים על ידי יד אחת. ביצים אז יכול להיות התגרו בעדינות מהבטן עם האצבע המורה של היד השנייה. הנקבה אז יכול להיות שב הטנק. ביצים יש להעביר צלחת פטרי 6 ס"מ מלאים התקשורת העובר על ידי מלקחיים קהה או אצבע.
4. זוגות Medaka נדירות להילחם כאשר הם מוחזקים בתוך קופסה קטנה ההזדווגות. לכן, הם יכולים להישמר טנק אחד קטן עם זרימת המים, כך שהם יכולים להיות מוזן וביצים ניתן לאסוף מזוג אותו כל יום במשך כמה חודשים.
5. חשוב דג נקבה לא צריך להישמר ללא זכרים, שכן הביוץ מתרחש היומיום medaka נקבות. אחרת, הנקבות לא יכול לספק ביצים להיות ברע.

2. עוברים ניקוי

1. העברת unclustered ביצים עם טפטפת זכוכית נייר זכוכית (p2000 בגודל חצץ, עמיד למים) להציב מכסה של צלחת פטרי 9cm. הסר בינוני עודף אלא להבטיח נפח מספיק נשאר כדי למנוע ייבוש של עוברים.
2. לגלגל בעדינות עוברים על נייר זכוכית בעזרת האצבע המורה, הפעלת לחץ מינימלי ושמירה במקביל אצבע על פני השטח של הנייר בחול כ 45-60 שניות כדי להסיר כמה שערות פני השטח החיצוני של סיסית. אין לגלגל יותר מ 5-7 עוברים מיד זהירות זו תצמצם את הסיכון של ריסוק עוברים מתחת לזה.
3. העברת עוברים ניקוי לצלחת טרי בינוני העובר.

3. ביצוע צלחות agarose לקיום עוברים במהלך microinjection

עוברים מוחזקים שקתות במהלך ההזרקה עשה עם עובש פרספקס agarose ב -1.5% (איור 1). ריכוז agarose חשוב להחזיק עוברים כראוי.

1. ראשית, ליצור מסגרת של agarose להחזיק את התבנית פרספקס. יוצקים agarose 1.5% במים עד לעומק 0.5cm בצלחת פטרי 9cm ולחכות עד שהוא מתקשה לחלוטין. לגזור על שטח של agarose רק גדול יותר בגודל של התבנית.
2. יוצקים 1.5% agarose כדי למלא את שטח חתך מקום עובש כך שאין בועות לכודים ולהמתין עד agarose מתמצק. צלחת זו agarose ניתן לאחסן במקרר כדי לזרז solidifaction.
3. מוציאים את התבנית כדי ליצור שקתות להחזיק את הביצים. הוסף בינוני העובר מספיק כדי לטבול את התבנית, מכסים ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
   
   
   באיור 1. סכמטי של עובש מחוייט המשמשים להכנת שקתות בצלחות agarose עבור microinjection.

4. Microinjection עוברים medaka

ב medaka, DNA, RNA, oligonucleotides morpholino וצבעים נותב הם microinjected דרך סיסית לתוך הציטופלסמה של 1 עד 64 תאים בעובר בשלב במקום חלמון כמו דג הזברה. מאז הציטופלסמה קטנה יותר לעין ופחות medaka, בפועל על ידי הזרקת צבעים כגון rhodamine-dextran מומלץ לפתח את המיומנות הזאת. תוספת של פנול אדום כמו נותב הוא מעודד גם כדי לאפשר אישור של זריקות.

ככל סיסית שמסביב עוברים medaka קשה, מחט קצרה, הזרקה חזקה רחב נדרשת (איור 2). הכן זה מחט חזקה הזרקת רחב של כוס חוט המכילים נימי.

1. הכן פתרון זריקה עם פנול אדום כמו נותב ו לטעון אותו לתוך המחט מאחור עם microloader Eppendorf. חבר את המחט על משאבת אוויר מזרק.
2. ביצים יש לאסוף unclustered בהקדם האפשרי לאחר ההפריה להזריק בשלב אחד התא. עוברים עוד ניתן להזריק ידי אחסונם על הקרח (לא יותר מ 30 דקות) כדי למנוע חלוקת התא.
   
   
   איור 2. השוואה בין מחטים medaka ו דג הזברה. הערה קצה המחט MF (למעלה) הוא קצר יותר ולכן חזקה ניקוב סיסית קשה שמסביב עוברים medaka.
3. העברת ביצים לתוך הצלחת agarose וליישר אותם שקתות עם מלקחיים. ממש לפני ההזרקה, חמש ביצים יש לסובב כך קרום התא הציטופלסמה של תא אחד יכול להיות נפגע על ידי הדואר המחט בניצב. הציטופלסמה של תא אחד לא ניתן למצוא על ידי מחפש שטח נטולי טיפות שמן קטן שנמצא מול הצד של הביצה עם טיפות שמן הצפופים. האזור זיהו ניתן לאשר להיות בציטופלסמה ידי הצגת מהצד.
4. מקמו את המחט קרוב את הביצים. פתח את קצה המחט על ידי נוגע בעדינות את קצה המחט אל סיסית או באמצעות microforceps (איור 3). כמות קטנה של חומר הזרקה יש לראות לזרום החוצה.
5. לנקב דרך סיסית למקום קצה של מחט בתוך סיסית. התאם את הלחץ החזקה של מזרק להיות גבוה יחסית, כדי להבטיח ריפלוקס לא מתרחשת עקב הלחץ הגבוה על לנקב דרך סיסית הקשה (הגדרות של 80 100hPA ללחץ החזקת 500-700hPA ללחץ הזרקה).
6. הכנס את קצה המחט לתוך הציטופלסמה באמצעות חדה תוקע הקרום שלה.
   
   הימנע החדרת קצה המחט בחלמון. שלא כמו דג הזברה, החומר מוזרק לתוך החלמון לא יועברו לתוך הציטופלסמה. נוזלים מוזרקים יש גבול ברור כאשר הוא מוזרק לתוך החלמון ואילו הגבול מטושטש כאשר בציטופלסמה (איור 4).
   
   מדי פעם המחט עשוי להיחסם על ידי agarose / פסולת. מלקחיים ניתן להשתמש לגעת / rebreak סוף המחט ולהסיר את החסימה. אם המחט שוברת בכל נקודה במהלך ההזרקה, מבעבע יהיה לראות את העובר בינוני לבין חומר שאתה הזרקת יאבדו. זריקות צריך להתבצע באופן שיטתי מלמעלה למטה לאורך תעלות agarose ו משמאל לימין על פני התבנית.
7. עוברים מוזרק יש להעביר צלחת נקייה המכילה בינוני העובר ופיתח בטמפרטורה המתאימה.
   
   
   איור 3. שוברים את קצה המחט לפני ההזרקה. 1: העבר קצה המחט קרוב סיסית של העובר; 2: גע סיסית ולהעביר מחט בעדינות קדימה ואחורה כדי לשבור קצה; 3: כאשר כמות קטנה של חומר הזרקה זורם מתוך בסופו של המחט זו מאשרת שבירה של קצה.

5. נציג תוצאות

איור 4. תמונות נציג מוזרק עוברים medaka. לוח מראה תמונה מייצגת של הזרקה נכונה של rhodamine-dextran לתוך הציטופלסמה של תא אחד עובר שלב medaka. לוח ב 'מציג תמונה מייצגת של הזרקה שגויה של rhodamine-dextran לתוך שק החלמון של העובר חד תא הבמה medaka. לוחות C ו-D להראות את העוברים מקולטי A ו-B בהתאמה על כ 30 שעות לאחר ההזרקה. א.מ.: העובר, הקדמי הוא כלפי מעלה לוחות C ו-D ולהציג היא הגב. הערה על הגוף של העובר בלוח D הוא לא אדום כמו צבע היה מוזרק בצורה לא נכונה לתוך שק החלמון. חצים ב B ו-D עולה rhodamine-dextran מוזרק בצורה לא נכונה לתוך שק החלמון לציין את הגבול מעגלי מובהק. קווים מקווקווים ב A ו-B עולה קווי המתאר של הציטופלסמה של תא אחד, הוא להציג לרוחב.

Discussion

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה נותב התא, ה-mRNA, ה-DNA או oligonucleotide אנטי תחושה זריקה לתוך אחד התאים בשלב עוברי medaka. טכניקה זו אפשרה לנו לבחון תהליכים התפתחותיים שונים ב-vivo בזמן אמת. תהליך זה לבין ניתוח מפורט בהמשך היא מספקת יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את הבנתנו organogenesis החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי. ידע כזה עשוי להיות חשוב, ואת התשואה יישומים טיפולית רפואה רגנרטיבית.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
4" fine net	Tools	J K Aquatics Ltd.	MD001	Used to capture fish during egg harvesting.
Embryo medium	Reagent	Home made		200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.		Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10F	For making microinjection needles.
Micropipette puller	Equipment	Narishige International	Model PP-830	For making microinjection needles.
Eppendorf microloader	Tool	Eppendorf	5242956.003	For loading microinjection needles.
Microinjector apparatus	Equipment	Eppendorf		Model 5242.
Micromanipulator	Equipment	Narishige International		Model MN151.
Agarose injection plate	Tools	Home made		For holding embryos during injection.