Summary
Un método automatizado para miografía las medidas de fuerza en las arterias mesentéricas aisladas se describe. Se emplea un miografía Auto Mulvany-Halpern alambre doble 510A para determinar las respuestas a la fenilefrina y el calcio extracelular. El método permite la determinación constante de respuestas a los agonistas isométricos en los pequeños vasos de diámetros de 60 a 300 micras, de forma independiente.
Abstract
Vasos proximales de resistencia, como las arterias mesentéricas, contribuyen sustancialmente a la resistencia periférica. Estas pequeñas embarcaciones de entre 100 a 400 micras de diámetro, en función principalmente de dirigir el flujo de sangre a varios órganos de acuerdo a los requisitos generales del cuerpo. La arteria mesentérica de rata tiene un diámetro superior a 100 micras. La técnica miografía, describió por primera vez por Mulvay y Halpern 1, se basó en el método propuesto por Bevan y Osher 2. La técnica proporciona información sobre las embarcaciones pequeñas en condiciones isométricas, donde se evita el acortamiento sustancial de la preparación muscular. Dado que la producción de fuerza y sensibilidad de los buques a diferentes agonistas depende de la magnitud de estiramiento, de acuerdo a la tensión activa de larga duración respecto, es esencial para llevar a cabo estudios de contracción isométrica en condiciones de evitar el cumplimiento de los cables de montaje. Alambres de acero inoxidable son preferibles a los cables de tungsteno debido a la oxidación de este último, que afecta a las respuestas registradas 3. La técnica permite la comparación de las contracciones inducidas por el agonista de los vasos montado en la obtención de pruebas para la función normal de los receptores del músculo liso vascular de la célula.
Hemos demostrado en varios estudios que las arterias mesentéricas aisladas que tienen un contrato con phenylyephrine relajarse con la adición de concentraciones acumuladas de calcio extracelular (Ca 2 + e). Los resultados nos llevaron a concluir que los nervios sensoriales perivasculares, que expresan la proteína G-acoplada Ca 2 +-receptor sensible (CAR), mediar esta respuesta vasodilatación. El uso de un método de transferencia bancaria miografía automatizado, se muestra aquí que las arterias mesentéricas de Wistar, Dahl sensibles a la sal (DS) y Dahl resistentes a la sal (DR) las ratas responden de manera diferente a Ca 2 + e. Los tejidos de ratas Wistar mostraron mayor Ca 2 +-sensibilidad en comparación con los de DR y DS. Reducción de la expresión de coches en las arterias mesentéricas de ratas DS se correlaciona con una reducción de Ca 2 + e inducida por la relajación de los aislados, pre-contratados arterias. Los datos sugieren que el coche es necesario para la relajación de las arterias mesentéricas en tono adrenérgico aumentado, como ocurre en la hipertensión, e indicar un defecto inherente en la vía de señalización del CaR en animales de Dahl, que es mucho más grave en el DS.
El método es útil para determinar in vivo la reactividad vascular ex en arterias de resistencia mesentéricas y similares los pequeños vasos sanguíneos y las comparaciones entre los distintos agonistas y / o antagonistas pueden ser fácil y constantemente evaluado de lado a lado 6,7,8.
Protocol
1. El aislamiento de rata pequeña arteria mesentérica
- Anestesiar a los animales con isoflurano en una cámara cerrada y limpie el abdomen con el alcohol.
- Realizar una laparotomía de la línea media para exponer cama mesentérica.
- Con la tijera, quitar unos 85 cm de intestino con la alimentación de vasos con la arteria mesentérica superior. Corte el extremo proximal de la sección intestinal cerca del píloro y el extremo distal cerca de la unión ileo-coecal. Segmentos del intestino están aislados de ratas que están profundamente anestesiados con isoflurano y sacrificados por tórax abierto punción cardíaca.
- Colocado sección extirpada en un plato de Petri que contiene recubierto PSS y llevar a cabo la disección de la arteria mesentérica a temperatura ambiente.
- Precisar el extremo proximal del intestino en el lado derecho y el pin a cabo el resto de la intestineina las agujas del reloj (al final ieproximal sobre la vasculatura de alimentación a la izquierda en el extremo del intestino).
- Diseccionar la rama II y III segmentos con un pedazo del segmento proximal.
- Diseccionar la vena y aislar la arteria (con punto de ramificación en forma de V) y limpiar, eliminando el tejido adiposo y tejido conectivo. Evite el contacto directo con la arteria tirando suavemente con las pinzas y el corte a través de la membrana del tejido conectivo.
2. De montaje de la embarcación
- Corta dos segmentos cortos (≈ 4 cm) de una de tungsteno libre 40 m de alambre de acero inoxidable y con unas pinzas finas, inserte una en la luz de cada arteria teniendo cuidado de no dañar el endotelio. Use la punta del alambre para abrir la luz si es necesario. La sangre que salían de la nave es una buena señal de la luz se abre.
- Llenar la cámara miografía con solución salina fisiológica (PSS; mM: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO 4 .7 H 2 O, 5 de NaHCO3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl 2, 20 y HEPES 5 de glucosa, pH 7.4) con ácido ascórbico (100 M) a 37 ° C y el uso de fórceps transferir cuidadosamente el segmento del vaso roscado de la placa de Petri en la cámara a temperatura ambiente y la transferencia del segmento extirpado vaso proximal a la cámara de miografía y tire de la finales a lo largo del cable para alimentar el buque. Evitar el estiramiento del buque.
- Asegure el extremo cercano del cable en sentido contrario en el tornillo de fijación cerca de la mandíbula derecha, conectado con el micrómetro. Coger el extremo libre del alambre con pinzas y seguro que las agujas del reloj en el tornillo de fijación hasta en la mandíbula derecha. Asegúrese de que el segmento de la flota a lo largo del cable se encuentra en la brecha entre las mandíbulas sin hacer contacto con la propia mandíbula.
- Tornillo de las fauces de distancia, y alinear el segundo alambre en paralelo con el buque y la inserta en el extremo más alejado de la luz. Suavemente alimentar el alambre a través del lumen del segmento del vaso en un movimiento con el cable ya está montado como una guía. Mantenga el cable alrededor de 1 cm del recipiente para evitar que se extiende durante la maniobra, y evite tocar el endotelio.
- Tornillo de la mandíbula juntos y asegurar que el segundo montaje se mueve por debajo de alambre de la primera protegido en la mandíbula derecha.
- Asegure el extremo más cercano del segundo cable en el sentido de las agujas del reloj en el tornillo de fijación cerca de la mandíbula izquierda conectado al transductor.
- Asegure el otro extremo del cable en el tornillo de fijación en la mandíbula izquierda y apretar para estirar el alambre.
- Una vez que el montaje está completo, reiniciar el motor en el menú "montaje" y comenzar la normalización de la embarcación.
3. Normalización
El miografía Auto de alambre doble sistema-510A tiene una función de normalización automatizado, el cual se evalúa a partir de la "normalización" del menú y permite que el buque que se alarga en una circunferencia interna normalizado por un procedimiento normalizado de acuerdo con el protocolo del fabricante después de equilibrar durante 30 minutos a 37 ° C. Una curva exponencial se ajusta entonces a los datos de la presión interna de la circunferencia. El procedimiento se define el diámetro de la luz (d 100) que la arteria se han tenido en vivo cuando está relajado y bajo una presión transmural de 100 mmHg 1 Los parámetros de normalización de la arteria mesentérica de rata son los siguientes.:
- Objetivo de presión transmural = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Tiempo = 60 segundos, la duración de cada uno de los pasos de normalización.
- IC 1 / 100 IC = 0,9 (IC = 1 circunferencia normalizado interna, IC 100 = circunferencia interna que corresponde a la presión deseada.
- Calibración ocular 2 * Δ (mm / ocular división), 2 delta es por razones de programación.
Medir la longitud de la arteria mesentérica montado usando el microscopio ocular lecturas cuando el nacimiento del pelo más de los extremos y cerca de la segm instalado en el buqueent. En pocas palabras, la longitud del segmento instalado en el buque se mide con un aumento máximo con un ocular calibrado ocular en el microscopio de disección. La lectura ocular con el pelo-line en el otro extremo del segmento (a 1) y el extremo más cercano del segmento (a 2) en las divisiones ocular se miden y registran. Estos valores, con las lecturas del micrómetro, antes y después de estirar el buque se registran y se entró en los menús para el programa para calcular la curva ajustada y el diámetro interior correspondiente a la presión transmural un objetivo de 100 mm Hg
En nuestros estudios, las arterias se establece en el diámetro de la luz del d 1 = 0,9 xd 100, en el desarrollo de la fuerza activa es máximo. Desarrollo de la fuerza activa de ≥ 10 mN en las arterias mesentéricas de rata se considera óptimo para los experimentos de proceder. Los tejidos con menor fuerza activa se descartaron.
4. Medición de las respuestas
Después de la normalización, las propiedades mecánicas y funcionales de los vasos se vuelven a activarse mediante la realización de un "nuevo comienzo estándar", que afecta a vasos de un reto con la aplicación repetida (normalmente 2 ó 3) de fenilefrina M 5 (PE) para obtener las contracciones reproducibles. Un típico "inicio normal" en nuestro laboratorio consta de una serie de estímulos y periodos de limpieza de la siguiente manera:
- Vuelva a colocar la cámara y empezar a cubrir miografía de aireación con un 95% de aire y 5% de CO 2.
- Llene la cámara con PSS fresco (que contiene ácido ascórbico 100 M)
- Contrato recipiente con M PE 5 durante 5 minutos y lavar 4 veces con tampón de PSS.
- Después del último lavado, cámara de recambio con PSS y esperar 3 minutos antes de repetir los pasos (ii) y (iii).
Después de la salida estándar, la arteria está listo para el experimento. Relajaciones de los buques contratados son evaluados por adición acumulativa de aumento de las concentraciones de CaCl 2 (0,5 - 4 mm). Buques, cuando se usan inhibidores se pre-incubaron con los compuestos en la cámara de miografía durante 20 minutos y presente durante los ensayos.
5. Análisis de Datos
La "normalización" de datos para los buques y los trazados de la fuerza, convierte directamente a los datos de texto, fueron analizados con el programa SigmaPlot 11,0 gráficos (Systat Software, Point Richmond, CA) y se representa como se muestra en la Figura 1. Respuesta a la concentración de datos, calculado a partir de los trazados, se analizaron mediante la determinación de la CE 50 valores a partir de datos experimentales instalados en una función logística de cuatro parámetros en el menú de Farmacología del programa. Las comparaciones entre grupos y dentro de los grupos se realizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) y las diferencias con p <0,05 se consideró significativo.
6. Los resultados representativos:
| Parámetros | Wistar | Dahl sensibles a la sal | Dahl resistentes a la sal |
|---|---|---|---|
| L 100 (m) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117.45 ± 8.43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* La diferencia entre los valores de L 100 Wistar y la República Dominicana son estadísticamente significativas. Shapiro-Wilk test de normalidad pasado (p = 0,588), análisis de varianza de Igualdad aprobada (p = 0,237).
L 100 = Diámetro interior del segmento de montaje correspondiente a la presión transmural de destino.
X 1 = El valor de posición micro requerida para estirar el instalado en el buque a su circunferencia normalizado interna (es decir, el valor de la lectura del micrómetro en el que los experimentos se llevaron a cabo).
r 2 = coeficiente de regresión para el ajuste de (X i, Y i) a una curva exponencial.
Nota: El procedimiento detallado se describe en el manual del sistema 510A miografía 6.
Tabla 1. Ejemplo de lectura de los parámetros de normalización para los segmentos de la arteria mesentérica de Wistar, DS y DR de programa básico se muestra en el menú "normalización". Los valores son medias (± SEM) de 5 animales. * Las diferencias entre los valores de L 100 Wistar y DS son estadísticamente significativas (p <0,05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Tabla 2. Tensiones adelantados (MN) en las arterias mesentéricas aisladas de Wistar, DS y ratas DR, después de las aplicaciones de 5 M PE a cada uno. Los valores informados son medias (± SEM) de 6-8 animales. * Significativamente diferente de los controles Wistar (p <0,05).
Figura 1. Ca 2 + e inducida por la relajación de la arteria mesentérica PE-contratados a partir de una rata Wistar montado en un cable miografía en solución salina fisiológica que contiene 1 mM Ca 2 +. La arteria se equilibró durante 30 min a 37 º C con aireación constante y las respuestas a Ca 2 + e determinado. Un grupo de representantes de seguimiento en la adición de 5 M PE seguido por la adición acumulativa de Ca 2 + se muestra.
Figura 2. Ca 2 + e inducida por la relajación de la arteria mesentérica PE-contratados a partir de una rata DS montado en un cable miografía en solución salina fisiológica que contiene 1 mM Ca 2 +. La arteria se equilibró durante 30 min a 37 º C con aireación constante y las respuestas a Ca 2 + e determinado. Un grupo de representantes de seguimiento en la adición de 5 M PE seguido por la adición acumulativa de Ca 2 + se muestra. Ca 2 + de relajación se vio gravemente comprometida en este tejido en comparación con los de ratas Wistar y la República Dominicana.
Figura 3. Ca 2 + e inducida por la relajación de la arteria mesentérica PE-contratados a partir de una rata DR montado en un cable miografía en solución salina fisiológica que contiene 1 mM Ca 2 +. La arteria se equilibró durante 30 min a 37 º C con aireación constante y las respuestas a Ca 2 + e determined.A fuerza representativa de seguimiento en la adición de 5 M PE seguido por la adición acumulativa de Ca 2 + se muestra.
Figura 4. A. [Ca 2 +] e-respuesta de las curvas. Diagrama de barras que muestra B. CE 50 valores para la relajación determinada por ajuste de los datos a una expresión curve.C.CaR cuatro parámetros logísticos en las máquinas recreativas mesentéricos aislados de ratas DR y DS.
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Discussion
La hipertensión es una causa importante de morbilidad cardiovascular, cerebral y renal / mortalidad. La aparición de la hipertensión arterial es alta en la población y la hipertensión sensible a sal es particularmente alta en el envejecimiento de la población, y más frecuente en los negros que los blancos. Se cree que esto se debe a la tendencia de los negros a retener sodio en los riñones 9. Sensibilidad a la sal es un factor importante que contribuye a la enfermedad renal y se asocia con la disfunción endotelial, pero el mecanismo no se entiende completamente. Estudios recientes en nuestro laboratorio han revelado que las dietas altas en sal para reducir el líquido intersticial Ca 2 + de concentración ([Ca 2 +] SI), y el aumento de la presión sistólica en ratas sensibles a la sal 10,11. Estos efectos pueden ser atribuidos a una expresión reducida de vehículos en arterias mesentéricas y kidneys.Finding reducciones similares en los niveles de coches en sensibles a la sal pacientes hipertensos podría proporcionar un objetivo para el desarrollo de nuevas terapias. Hemos estado usando el cable miografía automatizado con aislados arterias mesentéricas de una serie de modelos animales de hipertensión para estudiar la reactividad vascular a Ca 2 + e para comprender el mecanismo de señalización de CaR en la vasculatura.
[Ca 2 +] e se mantiene en un rango estrecho (1,1 - 1,4 mm) en los seres humanos 12, por lo tanto, el coche debe ser capaz de detectar pequeños cambios en la [Ca 2 +] e de la activación del receptor a ser posible. De hecho, el coche se ha mostrado para detectar pequeños cambios en el Ca 2 + e 13, y pequeños incrementos en la [Ca 2 +] SI que están dentro del rango fisiológico 14. En los estudios de microdiálisis in situ la medición de [Ca 2 +] SI en el duodenal submucosa y la corteza renal, dos tejidos que son esenciales para la regulación de la resistencia periférica y la presión arterial (PA), mostró cambios dinámicos en función de la luz intestinal [Ca 2 +]. El aumento de intestino [Ca 2 +] de 0 a 6 mm, el aumento de la [Ca 2 +] SI 1,1 a 1,9 mM 4,5,15, que se encuentra en el rango observado para activar el CaR nerviosas perivasculares 16, y relajarse mesentéricos aislados arterias 17. También hemos demostrado que el coche detecta la disminución de [Ca 2 +] e e incrementar la duración del potencial de acción a través de la activación del canal catiónico no selectivo, que a su vez atenúa el impacto sobre la probabilidad de liberación en las terminales neocortical 18. Esto sugiere que el coche ofrece pre-sináptica de retroalimentación para modificar la excitabilidad del cerebro en respuesta a Ca 2 + e. Por otra parte, la desensibilización del CaR PVN se produce con la estimulación repetida y prolongada 16, lo que sugiere que la comprensión de la regulación de este receptor se aclare su papel tanto en condiciones normales e hipertensos. Bukoski y sus colegas han demostrado que pequeños cambios en la [Ca 2 +] SI son suficientes para activar el tráfico y ayudar a la síntesis de vasodilatadores en condiciones normales 3,4.19,. Basándose en estas observaciones, se postula que esta respuesta también se producirá en las condiciones del tono vascular mayor como se observa en la hipertensión y por lo tanto puede ser explotado para controlar la presión arterial. El estudio de la activación del coche y cómo esto conduce a la fosforilación de los intermediarios de señalización, por lo tanto, necesaria para investigar su papel en la fisiología normal e hipertensos. El coche es la proteína G-receptor acoplado (GPCR) y se regula a través de mecanismos similares a los otros GPCRs, que son comunes dianas terapéuticas. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de su regulación en los vasos sanguíneos que proporcionan datos útiles para determinar su potencial como diana para la terapia antihipertensiva.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El proyecto descrito fue apoyada por números Premio HL064761 R01, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 y P20 MD000175 forma Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
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