Summary
We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.
Abstract
Twee-foton microscopie (TPM) biedt beeld acquisitie in de diepe gebieden binnen weefsels en organen. In combinatie met de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en stereotactische chirurgische procedures, TPM een krachtige techniek om "niches" binnen organen identificeren en cellulaire "gedrag" in levende dieren documenteren. Terwijl intravitale beeldvorming geeft informatie die het beste lijkt op de echte cellulair gedrag in het orgel, het is zowel meer bewerkelijke en technisch veeleisende in termen van benodigde apparatuur / procedures dan alternatieve ex vivo beeldvorming acquisitie. Zo beschrijven we een chirurgische ingreep en nieuwe "stereotactische" orgel houder die ons in staat stelt om de bewegingen van Foxp3 + cellen te volgen in de thymus.
Foxp3 is de meester regulator voor het genereren van regulerende T-cellen (Tregs). Bovendien kunnen deze cellen worden ingedeeld naar hun oorsprong: dat wil zeggen. thymus gedifferentieerde Tregs worden "natuurlijk voorkomende Tregs" (nTregs) en opposed naar perifeer omgezette Tregs (pTregs). Hoewel veel onderzoek is beschreven in de literatuur over het fenotype en fysiologie van deze T-cellen weinig bekend over hun in vivo interactie met andere cellen. Deze deficiëntie kan door het ontbreken van technieken die het mogelijk maken deze opmerkingen. Het protocol beschreven in dit document biedt een oplossing voor deze situatie.
Het protocol bestaat uit het gebruik naakt muizen die een endogeen thymus ontbreekt omdat ze een punctuele mutatie in de DNA sequentie die de differentiatie van sommige epitheliale cellen, waaronder epitheelcellen thymus compromitteert. Naakt muizen waren gamma-bestraalde en gereconstitueerd met bot pompoenen (BM) van Foxp3-KI GFP / GFP muizen. Na herstel BM (6 weken), elk dier kreeg embryonale thymus transplantatie in de nier capsule. Na acceptatie thymus (6 weken), werden de dieren verdoofd, de nieren met hetgetransplanteerde thymus werd blootgesteld, vastgesteld in onze orgaan houder en bewaard onder fysiologische omstandigheden in vivo beeldvorming door TPM. We gebruiken deze benadering de invloed van drugs in het genereren van regulatoire T cellen te bestuderen.
Protocol
1. Animal voorbereiding
Belangrijke informatie: BM celsuspensies en thymus-transplantaties werden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. De BM suspensies werden bereid in de kappen van onze celkweek kamer, terwijl de thymus transplantatie werd uitgevoerd in de operatiekamer zich in ons dierenverblijf. Met het oog op te houden en garanderen dat deze aseptische omstandigheden, waren we niet toegestaan om onze video op te nemen in deze plaatsen. Echter zijn alle chirurgische materialen geautoclaveerd en chirurgische bank is eerder gereinigd met Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc) en 70% ethanol. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en ze waren in overeenstemming met de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) richtlijnen. De goedkeuring ID-nummer is AO10/2010. Alle beeld experimenten waren terminal procedures en de dieren werden onmiddellijk gedood na het einde van het beeldovername.
De gedetailleerde procedure is als volgt:
- Bestralen (met een γ-bestraler) 8 weken oude muizen Naakt met 900 rads de endogene hematopoietische precursors vernietigen in het beenmerg (BM). Na bestraling, de terugkeer van de dieren naar hun kooien totdat u de voorbereiding van de donor BM cellen voor intraveneuze injectie en verder BM reconstitutie. Deze BM overdracht werd uitgevoerd 1 uur na bestraling.
- Scheid de BM donordieren. Dij-en bovenbenen van de achterste ledematen van een dier zijn over het algemeen voldoende te reconstrueren tot 3 ontvanger dieren. Na euthanasie met CO 2, verwijder de achterste ledematen en verwijder de huid en spieren van de botten.
- Snij het gesloten eind van elk bot en spoelen met PBS (of RPMI) of fijnmaken allemaal in een mortier met stamper met 2 ml PBS (of RPMI) de BM verwijderen.
- Breek de BM structuur in een single-celsuspensie door herhalingen van krachtige aspiratie using een P1000 pipet. Als alternatief kunt u ook langs de BM gedurende een 21G naald meerdere malen. Centrifuge (400g, 5 min, RT), opnieuw te schorten cellen in PBS, en injecteer intraveneus in uw naakt-bestraalde ontvangers. In onze experimenten gebruikten we BM van Foxp3-KI GFP / GFP muizen waar alle regulerende T-cellen (Tregs) zal uiten GFP 1.
- Acceptatie van de donor BM gebeurt in de eerste dagen na de overdracht, omdat niet-BM-gereconstitueerde dieren kunnen niet overleven meer dan 14 dagen. Echter, men moet wachten tot 4 tot 6 weken volledig herstel van BM compartimenten maken. Bactrim (Roche) werd toegevoegd aan het water (2 mg / ml) gedurende de eerste week na bestraling om het risico van bacteriële infecties verminderen.
- Embryonale thymus transplantatie werd reeds beschreven 2. In het kort, start broedparen van isogene muizen en controleer voor het aansluiten (bewijs van coïtus) elke dag. Aparte aangesloten vrouwen en CO 2-euthanaseren hen op dag 15 van pregnancy (observatie van de stekker is dag 1 van de zwangerschap). Verwijder de embryo's en de zwezeriken. Plaats de embryonale zwezeriken in koude PBS tot overdracht.
- De thymus transplantatie Anesthetize BM-ontvanger Naakt muizen met ketamine (120 ug / g van muis gewicht) / xylazine (16 ug / g van muis gewicht) te voeren en deze op een verwarmingskussen te houden bij 37 ° C tot ze onbewuste.
- Operatief bloot de nier naar de transplantatie van de zwezeriken uit te voeren. Eerst scrub de huid met ChloraPrep (Carefusion Inc) en 70% ethanol. Dan een 1 cm gesneden op de huid van de rug-laterale lichaamsdeel van het dier, 2 mm balg de laatste thoracale rib.
- Snijd de peritoneale holte en trek de nier van deze holte. Maak een kleine oppervlakkige snede in de nier capsule met een scalpel. Met behulp van een tang met een zeer dunne tip een zakje onder de nier capsule van de ontvanger muis en voeg tot 4 thymus lobben in dit zakje.
- Zet de nier b ack op zijn plaats, hechten de peritoneale holte met een of twee steken en sluit de muis huid met behulp van dezelfde hechtdraad methode. Als alternatief kan hechtingen worden gedaan met behulp van chirurgische lijm.
- Injecteer pijnstillende (Butorfanol bij 5 mg / kg) subcutaan direct na het beëindigen van de operatie om dieren pijn te vermijden en de dieren te houden in een verwarmings-pad tot ze beginnen te herstellen van anesthesie. Muizen individueel gekooid de eerste 3 dagen na transplantatie kooi mates voorkomen verwijderen van de steken. Verwijder steken na 1 week.
- Naakt muizen geen T-cellen. Daarom kunt u de thymus transplantaat acceptatie te evalueren door het volgen van het percentage van CD4 + of CD8 + T-cellen in het bloed. Eenmaal per week, 2 weken na transplantatie thymus, bloeden en vlekken de dieren het bloed met anti-CD4 en anti-CD8 monoklonale antilichamen (MAbs). Wanneer de CD4: CD8 ratio ongeveer 2:1, de getransplanteerde thymus volledig functioneel (figuur 1).
Bereid alle materialen die u nodig hebt van te voren en leg ze opzij.
- Verdoven dieren met ketamine / xylazine (dezelfde doses beschreven in punt 1.5) en ze op een verwarmingskussen te plaatsen bij 37 ° C. Injecteer 100 ui Rhodamine B-isothiocyanaat-Dextran (20 mg / ml in PBS) intraveneus toekomstige visualisatie van de bloedstroom mogelijk.
- Bloot de nier die de getransplanteerde thymus volgens het protocol eerder beschreven in punt 1.6.
- De nier te voorkomen terugkeren naar zijn oorspronkelijke positie, sluit de zijkanten van de incisie met hechtingen.
- Plaats een stuk PBS doordrenkt katoen op de top van het orgaan om het vochtig te houden.
- Plaats het verwarmingselement bovenop het dier houder fase (figuur 2A).
- Zet het dier bovenop het verwarmingselement in het dier houder orgaan tot (Figuur 2B).
- Knijp het orgel aan beide zijden met een klem made van dunne aluminiumfolie (figuur 2C).
- Sluit het dier houder en plaats het verwarmingselement bovenaan probe zo dicht mogelijk om weefsel (Figuur 2D). Deze verwarming probe meet continu de temperatuur orgaan en stuurt deze informatie naar de verwarmer de elektrische stroom aan te passen, hem bij 37 ° C.
- Verwijder de PBS doordrenkte katoen en voeg laagsmeltende agarose (2% in PBS) bij 30 ° C bovenop de voorbereiding.
- Bedek de hele voorbereiding met de bovenste verwarmingselement (figuur 2E). In de opening aan deze kachel is een dekglaasje isoleren van de agarose uit het doel (figuur 2F). Toezicht houden op de muis anesthesie en injecteer een halve dosis te verhogen om de 40 minuten. Nadat het beeld acquisitie, euthanaseren het dier met CO 2.
OPMERKING: Foto's van de aluminiumfolie clip en boven verwarmingselement weergegeven in figuur 3.
3. Twee-foton beeldvorming acquisitie
We gebruikten een rechtopstaande "Prairie Ultima XY" twee-foton microscoop. Ons systeem is voorzien van een Ti: saffier laser, vier top PMTs voor gelijktijdig tot 4 kanalen acquisities en 20x water immersie objectief.
- Zet de Ti: saffier laser en het hele systeem microscoop.
- Voeg dichroïsche spiegels en filter sets afhankelijk van het gewenste golflengten. In ons geval gebruikten we een Olympus-BX2 Chroma houder met een 565 nm dichroïsche spiegel, een 525/50 nm filter (Foxp3-GFP signaal) en een 595/50 nm filter (Dextran-Rhodamine B-signaal in bloedvaten ). De gebruikte laser was golflengtegebied tussen 880 en 900 nm.
- Voeg het dier houder aan de microscoop, sluit aan en schakel alle kachels, voeg water toe aan de bovenkant kachel diafragma, kantel de doelstelling in het water, en zich richten op een schip of een GFP-Tregs.
- Met de microscoop x, y, z externe controle snel overzicht het weefsel naar een gebied lokaliseren van belang.
- Stel de gain van de PMTs kleurscheiding optimaliseren en minimaliseren de hoeveelheid laser moet voldoende signaal over achtergrond te bereiken. Probeer de minimale hoeveelheid van de laser te gebruiken om foto-schade aan uw weefsel te voorkomen.
- Zodra het gebied van belangen is gelegen, te beginnen time-lapse imaging. In ons geval een typische 5D (x, y, z, t, en kleur) verwerving protocol bestaat uit het verwerven opeenvolgende beelden van een 50 urn diepte weefselvolume, verdeeld in 4,0 urn z-stappen, x en y lengte van 140 urn elk. Elk volume duurt ongeveer 30 seconden aan te schaffen. Daarom wordt 60 acquisities uit te voeren ongeveer 30 min van het beeld overname.
- Breng de gegevens naar de institutionele server en gebruiken ImageJ, Imaris of Volocity software om multi-dimensionale weergave en cell tracking uit te voeren.
4. Representatieve resultaten
g1.jpg "/>
Figuur 1. . Embryonale thymus aanvaarding en functie Na BM recover werden embryonale thymussen getransplanteerd BM gereconstitueerde dieren twee weken na transplantatie thymus, deze muizen werden eenmaal per week bloedde de percentages van T cel subtypes controleren door kleuring met anti-CD4 of anti-CD8 MAbs. We beschouwden de thymus succesvol aanvaard dieren met een CD4: CD8 in verhouding 1.5-2.0:1 (A). Om de functionaliteit te bevestigen, wat we opgeofferd thymus-en getransplanteerde dieren vergeleken percentage van verschillende subpopulaties thymocyt met WT-muizen (B). De percentages van dubbel negatieve (DN; CD4 - CD8 - thymocyten) subpopulaties (door kleuring met anti-CD25 en anti-CD44 MAbs), dubbel positieve (DP; CD4 + CD8 + thymocyten) en single-positieve (SP) CD4 + of CD8 + thymocyten waren vergelijkbaar tussen deze dieren.
ig2.jpg "/>
Figuur 2. Animal houdermontage. Na diep verdoofd het dier bovenop een verwarmingselement, eerder boven op het dier houder fase (A). De nier met de getransplanteerde thymus naar boven (B). Een aluminium folie klem knijpt zachtjes de hele nier (C) te houden op zijn plaats. Fig. 1C inzet toont in detail de klem. Het bovenste deel van het dier houder wordt opgezet (D). De PBS gedrenkte katoen uit de top van het orgaan, vervangen door warme laag-smeltende agarose en de bovenste verwarmer toegevoegd (E). Tenslotte wordt het geheel naar de microscoop, hier vertegenwoordigd door de doelstelling (F).
Figuur 3. Details van de houder onderdelen. Deze foto's laten de aluminium folie klem (A) die de nier (B). Let ook op de regio waar de getransplanteerde thymus bevindt. Dit geeft ongeveer regionaar de thymus capsule snijden en maken de zak om de embryonale thymus te zetten. De bovenste verwarmer dekglaasje (C) werd gefixeerd met siliconenlijm naar zijn onderste deel (D).
Film 1. Intravitale beeldvorming van Foxp3-GFP + thymocyten in de thymus waar de fysiologische niveaus van zuurstof en temperatuur (37 ° C) zijn tijdens het gehele proces. Let op de doorbloeding en de beweging van Tregs. Deze snelheden kunnen worden gemeten en vergeleken met gepubliceerde gegevens. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 2. Intravitale beeldvorming van Tregs in een thymus waar de beelden werden verkregen bij 30 ° C. Let op de afwezigheid van beweging en de ronde vorm van de cellen, ondanks het onderhoud van de bloedstroom. Klik hier om de film te bekijken.
Discussion
In dit artikel blijkt de procedures voor twee-foton beeldvorming van thymocyten in een levend dier. Ook beschreven sommige parameters dat men zorgvuldig controleren, zoals de voortzetting van de bloedstroom en het onderhoud van orgaan gedurende de beeldvorming. Toch, ondanks zorgvuldige inspanningen om het orgel stabiel, kan bewegingsartefacten zoals "orgel drifting" optreden. Posterior beeldcorrectie kan worden uitgevoerd door de ontwikkeling van algoritmen die speciaal voor dit doel. Verdere beeldanalyse kan ook de bron van nieuwe protocollen ontwikkeling die streeft naar minimalisering van fouten.
De thymus is het orgaan waar alle T-cellen geproduceerd en derhalve is het orgaan waar immunologen geïnteresseerd in het begrijpen van de generatie γδ zal CD4 of CD8 T-cellen hun aandacht. De meeste studies op T-cellen zijn gebaseerd op verschillen in aantallen en / of stabiliteit van deze cel na verschillende in vitro / in vivo manipulaties. Echter, nadat de in vivo visualisatie We konden de interactie tussen cellen van het immuunsysteem betrokken bij het handhaven van homeostase 3-7. Daarom is de in vivo waarneming van thymocyten is waarschijnlijk een van de belangrijkste ontbrekende informatie een beter inzicht T cell biology. Intravitale TPM geeft een gedetailleerd beeld van T-cel interacties en bewegingen en we zien hier hoe het gebruikt kan worden voor gedetailleerde studies thymocyten. Echter, elke techniek heeft zijn beperkingen. Terwijl intravitale imaging overname is de meest accurate systeem voor het reflecteren van cellen gedrag in het lichaam, het is ook waar dat geëxplanteerd beeldacquisitie van organen is minder arbeidsintensief en is gebruikt om belangrijke informatie over het immuunsysteem 8,9 verzamelen. Bovendien kan men niet ontkennen intravitale imaging methoden een operatie nodig om weefsels en bloedvaten bloot in verdoofde dieren,die per se kunnen een verandering in het geheel orgaanfysiologie 10. Toch zijn er niet-invasief methoden die de artefacten veroorzaakt door de chirurgische procedure 11 en nieuwe methoden heffen ontwikkeld die beter voorbereiden vooraf de dieren gaan 12. Daarom zal nieuwe chirurgische procedures en tol te minimaliseren of te omzeilen feitelijke beperkingen van intravitale beeldvorming acquisitie en meer en meer toegankelijk voor de wetenschappelijke gemeenschap.
We hebben aangetoond dat de methode die wij beschreven haalbaar is en rapporteert alle in vivo systemische manipulaties, zoals toediening, die we hebben gebruikt. Zo, raden we het gebruik van deze methode, samen met ex vivo technieken al beschikbaar om aan te vullen en te versterken verdere studies met betrekking tot thymocyten ontwikkeling.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Dr David Olivieri bedanken voor kritische evaluatie van dit manuscript, Dr Nuno Moreno voor de logistieke hulp aan onze dierlijke houder en verwarming pads en Dr Vijay K. Kuchroo te bouwen voor de donatie van Foxp3-KI GFP / GFP muizen. Dit werk wordt ondersteund door "Fundação para Ciência e Tecnologia" (FCT, Portugal), subsidie # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
