Abstract
Två-foton mikroskopi (TPM) ger bilden förvärv i djupa områden i vävnader och organ. I kombination med utveckling av nya stereotaktisk verktyg och kirurgiska ingrepp, blir TPM en kraftfull teknik för att identifiera "nischer" inuti organ och att dokumentera cellulära "beteenden" med levande djur. Medan intravital bildbehandling ger information som bäst liknar den verkliga cellulära beteende i orgeln, det är både mer tidskrävande och tekniskt krävande i form av nödvändig utrustning / rutiner än alternativa ex vivo imaging förvärvet. Därför beskriver vi ett kirurgiskt ingrepp och romanen "stereotaktisk" organ hållare som tillåter oss att följa rörelser Foxp3 + celler i brässen.
Foxp3 är master regulator för generering av regulatoriska T-celler (Tregs). Dessutom kan dessa celler delas in efter deras ursprung, dvs. bräss differentierade Tregs kallas "naturligt förekommande Tregs" (nTregs), som opposed till perifert-konverterade Tregs (pTregs). Även om betydande mängd forskning har rapporterats i litteraturen om fenotypen och fysiologi av dessa T-celler, mycket lite är känt om deras in vivo interaktioner med andra celler. Denna brist kan bero på avsaknaden av tekniker som skulle tillåta sådana observationer. Protokollet beskrivs i detta dokument innehåller ett botemedel mot denna situation.
Vårt protokoll består av att använda nakna möss som saknar en endogen bräss eftersom de har en punktlig mutation i DNA-sekvens som äventyrar differentiering av vissa epitelceller, inklusive thymic epitelceller. Nakna möss gamma-bestrålade och beredning med ben squash (BM) från Foxp3-KI GFP / GFP möss. Efter BM återhämtning (6 veckor), fick varje djur embryonala bräss transplantation inne i njuren kapsel. Efter bräss acceptans (6 veckor) var djuren bedövas, njuren som innehållertransplanterade bräss var utsatt, fast i vår orgel hållare och hålls under fysiologiska förhållanden för in vivo imaging av TPM. Vi har använt denna metod för att studera påverkan av narkotika i uppkomsten av regulatoriska T-celler.
Protocol
1. Animal förberedelse
Viktigt: BM cellsuspensioner och thymic transplantationerna kunde genomföras under aseptiska förhållanden. BM upphängningar var beredda innanför kåpor i vår cellodling rummet, medan thymic transplantation utfördes i kirurgiska rum inom våra djur anläggning. För att hålla och garantera dessa aseptiska förhållanden, var vi inte tillåtna att spela in vår video på dessa platser. Däremot var alla kirurgiska material autoklaveras och den kirurgiska bänken tidigare rengöras med Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) och 70% etanol. Alla förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och de var överens med Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) direktiv. Godkännandet ID-nummer är AO10/2010. Alla bilden experimenten terminalen förfaranden och djuren avlivas omedelbart efter utgången av bildenförvärvet.
Närmare bestämmelser om förfarandet är följande:
- Bestråla (med en γ-irradiator) 8 veckor gamla nakna möss med 900 rads att förstöra den endogena hematopoetiska förstadier inuti benet squash (BM). Efter bestrålning, tillbaka djuren till deras burar tills du förbereda givaren BM celler för intravenös injektion och ytterligare BM beredning. Detta BM överföringen utfördes 1 h efter bestrålning.
- Separera BM donatordjuren. Skenben och lårben i bakbenen ett djur är i allmänhet tillräckligt för att rekonstruera upp till 3 mottagare djur. Efter avlivning med CO 2, ta bort bakbenen och sedan ta bort hud och muskler från benen.
- Skär den slutna slutet av varje ben och spola den med PBS (eller RPMI) eller krossa dem i mortel med en stöt med 2 ml PBS (eller RPMI) för att ta bort BM.
- Störa BM struktur i en enda cellsuspension av upprepningar av kraftig aspiration USIng en P1000 pipett. Alternativt kan du skicka även BM under en 21G nålen flera gånger. Centrifug (400g, 5 min, RT), återsuspendera cellerna i PBS, och injicera intravenöst i din naken-bestrålat mottagare. I våra experiment har vi använt BM från Foxp3-KI GFP / möss GFP där alla regulatoriska T-celler (Tregs) kommer att uttrycka GFP 1.
- Godkännande av givaren BM sker i de första dagarna efter överföringen, eftersom icke-BM-beredning djur inte kan överleva mer än 14 dagar. Man bör dock vänta på 4 till 6 veckor för att möjliggöra fullt indrivning av alla BM fack. Bactrim (Roche) lades till vatten (2 mg / ml) under första veckan efter bestrålning för att minska risken för bakteriella infektioner.
- Embryonala bräss transplantation var redan beskrivits 2. Kortfattat, börja häckande par av isogena möss och kontrollera pluggning (tecken på samlag) varje dag. Separata ansluten honor och CO 2-euthanize dem på dag 15 av pregnANCY (observation av kontakten är dag 1 av graviditeten). Ta bort embryon och thymuses. Placera embryonala thymuses i kallt PBS tills överföringen.
- För att utföra thymuses transplantation, söva BM-mottagare nakna möss med ketamin (120 mikrogram / g mus vikt) / xylazin (16 mikrogram / g mus vikt) och hålla dem på toppen av en värmedyna vid 37 ° C tills de får medvetslös.
- Kirurgiskt utsätta njurarna för att utföra transplantation av thymuses. Först skrubba huden med ChloraPrep (CareFusion Inc.) och 70% etanol. Sedan gör en 1 cm snitt i huden på ryggen-laterala kroppsdel av djuret, 2 mm bälg sista bröstkorg revbenet.
- Skär i bukhålan och dra ut njure av denna hålighet. Gör en liten ytliga snitt i njuren kapsel med en skalpell blad. Använd pincett med en mycket tunn spets gör en påse under njure kapsel mottagaren musen och lägga till upp till 4 thymic lober i denna påse.
- Sätt njure B ACK på sin plats, suturer i bukhålan med en eller två stygn, och stäng sedan musen huden med samma sutur metod. Alternativt kan suturer göras med kirurgiskt klister.
- Injicera analgetikum (Butorfanol vid 5 mg / kg) subkutant direkt efter avslutad operation för att undvika att djuret smärta och hålla djuren i en värmedyna tills de börjar att återhämta sig från anestesi. Möss är bur individuellt för de första 3 dagarna efter transplantation för att förhindra bur kompisar tar bort stygnen. Ta bort stygn efter 1 vecka.
- Nakna möss saknar T-celler. Därför kan du utvärdera bräss transplantat acceptans genom att övervaka andelen CD4 + och CD8 + T-celler i blodet. En gång per vecka, 2 veckor efter bräss transplantation, blöda djuren och fläcken blod med anti-CD4 och anti-CD8 monoklonala antikroppar (MABs). När CD4: CD8 förhållandet är ungefär 2:1, är transplanterade bräss fullt fungerande (Figur 1).
Förbered allt material du behöver i förväg och lägg dem åt sidan.
- Bedöva djur med ketamin / xylazin (samma doser som beskrivs i punkt 1.5) och placera dem ovanpå en värmedyna vid 37 ° C. Injicera 100 ìl Rhodamine B isothiocyanat-Dextran (20 mg / ml i PBS) intravenöst för att möjliggöra framtida visualisering av blodflödet.
- Exponera njuren som innehåller de transplanterade bräss enligt det protokoll som tidigare beskrivits i punkt 1.6.
- För att förhindra att njuren från att återvända till sitt ursprungliga läge, nära de laterala sidorna av huden snittet med stygn.
- Placera en bit av PBS-blöt bomull på toppen av orgeln för att hålla den fuktig.
- Sätt värmedyna på toppen av djuret innehavaren skede (Figur 2A).
- Sätt djuret ovanpå värmedynan i djuret hållaren, orgel upp (Figur 2B).
- Nyp orgeln på båda sidor med en klämma made av tunn aluminiumfolie (Figur 2C).
- Stäng djuret hållaren och placera den övre värmaren sonden så nära som möjligt till din vävnad (figur 2D). Det här aggregatet sond mäter hela tiden orgeln temperaturen och skickar denna information till värmaren för att justera den elektriska ström, hålla den vid 37 ° C.
- Ta bort PBS-blöt bomull och lägga lågsmältande Agar (2% i PBS) vid 30 ° C på toppen av din beredning.
- Täck hela beredningen med den övre värmaren (Figur 2E). I bländare på denna värmare finns en coverglass isolera agarosen från målet (Figur 2F). Övervaka musen anestesi och injicera en halv dos öka varje 40 min. När bilden förvärvet euthanize djuret med CO 2.
Anmärkning: bilder av aluminiumfolie klippet och den övre värmaren som presenteras i figur 3.
3. Två-foton Bildtagning
Vi använde en upprättstående "Prairie Ultima XY" två-photon mikroskop. Vårt system är försett med en Ti: safir laser, fyra topp PMTs för samtidig upp till 4 kanaler förvärv och en 20x nedsänkning i vatten mål.
- Slå på Ti: safir laser och hela mikroskop systemet.
- Lägg dikroiskt speglar och filter ställer enligt den önskade våglängder. I vårt fall använde vi en Olympus-BX2 Chroma hållare som innehåller en 565 nm dikroiska spegel, en 525/50 nm filter (för Foxp3-GFP-signal) och en 595/50 nm filter (för Dextran-Rhodamine-B signal inuti blodkärlen ). Lasern våglängdsområdet användes var mellan 880 till 900 nm.
- Lägg djuret innehavaren till mikroskop, ansluter och slår på alla värmare, tillsätt vatten på toppen värmare bländare, försiktigt sänka målet i vattnet, och fokusera på ett fartyg eller någon GFP-Tregs.
- Med mikroskop x, y, z extern kontroll, undersökning snabbt vävnad för att hitta en region av intresse.
- Justera vinsten på PMTs att optimera färg-separation och minimera mängden av laser för att uppnå tillräcklig signal över bakgrunden. Försök att använda minimalt med laser för att undvika foto-skador av din vävnad.
- När regionen intressen ligger, börjar tidsförlopp avbildning. I vårt fall, en typisk 5D (x, y, z, t, och färg) består förvärv protokollet att förvärva sekventiella bilder av en 50 ìm fördjupad vävnad volym, uppdelat i 4,0 ìm z-steg, x och y längd 140 ìm vardera. Varje volym tar ca 30 sekunder som skall förvärvas. Därför kommer 60 förvärv utför ca 30 min för bildtagning.
- Överför data till institutionella server och använda ImageJ, Imaris eller Volocity programvara för att genomföra flerdimensionella rendering och cell tracking.
4. Representativa resultat
g1.jpg "/>
Figur 1. . Embryonala bräss acceptans och funktion efter BM återhämta var embryonala thymuses transplanteras till BM rekonstituerad djuren, två veckor efter bräss transplantation var dessa möss blödde en gång per vecka för att övervaka de procentandelar av T-cell subtyper genom färgning med anti-CD4 och anti-CD8 MAbs. Vi ansåg bräss framgångsrikt godtogs i djur med ett CD4: CD8 ratio runt 1.5-2.0:1 (A). För att bekräfta dess funktionalitet, offrade vi några bräss-transplanterade djur och jämfört andelen av olika tymocyt subpopulationer med WT möss (B). Andelen dubbla negativa (DN, CD4 - CD8 - tymocyter) delpopulationer (genom färgning med anti-CD25 och anti-CD44 MABs), dubbel-positiva (DP, CD4 + CD8 + tymocyter) och single-positiva (SP) CD4 + och CD8 + tymocyter var likartade mellan dessa djur.
ig2.jpg "/>
Figur 2. Animal innehavaren montering. Efter djupt sövda, är djuret upp på toppen av en värmedyna, tidigare monterad på toppen av djuret innehavaren scenen (A). Njurarna som innehåller de transplanterade bräss är vänd uppåt (B). En aluminiumfolie klämman klämmer försiktigt hela njuren (C) för att hålla den på plats. Fig. 1C sätt visar i detalj klämman. Den övre delen av djuret innehavaren har införts (D). PBS-indränkt bomull tas bort från toppen av orgeln, ersatt av varma lågsmältande agaros, och den övre värmaren till (E). Slutligen är hela församlingen överförs till mikroskop, här representerad av målet (F).
Figur 3. Uppgifter om innehavaren delar. Dessa bilder visar klämman aluminiumfolie (A) som håller njure (B). Notera också den region där de transplanterade thymus ligger. Detta indikerar ungefär regionenatt skära bräss kapseln och göra ficka att sätta embryonala bräss. Den övre värmaren coverglass (C) var fast med silikon lim till dess nedre del (D).
Film 1. Intravital avbildning av Foxp3-GFP + tymocyter inne i brässen där de fysiologiska nivåerna av syresättning och temperatur (37 ° C) hölls under hela processen. Observera blodflödet och rörligheten för Tregs. Dessa hastigheter kan mätas och jämföras med publicerade data. Klicka här för att se filmen.
Film 2. Intravital avbildning av Tregs inne i en tymus där bilderna förvärvades till 30 ° C. Notera avsaknaden av rörelse och den runda formen på cellerna trots att upprätthålla blodflödet. Klicka här för att se filmen.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
