Summary
Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.
Abstract
Het langdurig gebruik van Drosophila als model voor cel-en ontwikkelingsbiologie heeft een scala aan instrumenten opgeleverd. Samen hebben deze technieken analyse van cel en ontwikkelingsbiologie vanuit verschillende methodologische invalshoeken mogelijk. Live-Imaging is een nieuwe methode voor het observeren van dynamische cellulaire processen zoals celdeling en cel beweeglijkheid. Na geïsoleerd mutaties in ongekarakteriseerde vermeende celcycluseiwitten werd het essentieel om mitose observeren in situ met behulp van live beeldvorming. De meeste levende imaging studies in Drosophila hebben geconcentreerd op de embryonale stadia die toegankelijk is voor manipulatie en observatie zijn vanwege hun kleine formaat en optische helderheid. In deze fasen de celcyclus ongebruikelijk, dat geen een van de spleet fasen of beide. Daarentegen cellen van het popstadium vleugel van Drosophila hebben een typische celcyclus ondergaan een periode van snelle mitose uitstrekt over ongeveer 20 hr popstadium ontwikkeling. Het is gemakkelijk om identify en isoleren poppen van de juiste fase om mitose te vangen in situ. Montage intact poppen voorwaarde dat de beste combinatie van volgzaamheid en duurzaamheid tijdens de beeldvorming, waardoor experimenten uit te voeren voor een aantal uren met een minimale impact op de cel en dierlijke levensvatbaarheid. De methode maakt observatie van functies zo klein als of kleiner dan, vliegen chromosomen. Aanpassing microscoop instellingen en de bevestiging, toegestane verlenging van het preparaat membraan dynamica van aangrenzende cellen en fluorescent gelabelde eiwitten zoals tubuline visualiseren. Deze methode werkt voor alle geteste fluorescerende eiwitten en kan submicron schaal functies over een verscheidenheid van tijdschalen vangen. Terwijl beperkt tot de buitenste 20 urn van de pop met een conventionele confocale microscoop kan deze benadering observeren eiwitten en cellulaire dynamiek pupal weefsels in vivo algemeen bruikbaar in de studie van cel en ontwikkelingsbiologie in deze weefsels.
Introduction
De azijn Drosophila melanogaster, is een goed uitgewerkt model voor het bestuderen van vele aspecten van de biologie. Drosophila onderzoek heeft een rijke geschiedenis van genetische experimenten die verfijnde vormen van genetische manipulatie, waaronder expressie, knock-down en mutatie maakt. Met de komst van fluorescente proteïne labels, heeft dit repertoire uitgebreid onderzoek van cellen en eiwitten omvatten in levende dieren. De vlieg embryo is een uitstekend systeem voor dergelijke studies zoals het is klein en optisch helder waardoor diepe, hoge-resolutie imaging in vivo 1-3. Andere stadia van vliegen ontwikkeling hebben bewezen minder handelbaar te zijn, die voor pijn 4, dissectie en korte termijn cultuur 5,6, of de creatie van de ramen in de cuticula voor de beeldvorming 7,8. Deze manipulaties meestal compromis dierlijke ontwikkeling op lange termijn, noch de dieren op een manier die beeldvorming beperken tot korte perioden.
ent "> Om nieuwe mutaties te bestuderen in genen die de celcyclus regulatoren lijken, was het essentieel om een passende voorbereiding op de timing en de trouw van de celcyclus te bestuderen vinden. Aangezien de meeste embryonale cel cycli worden afgekapt (SM of S-G2-M) en mutanten onderzochte geen afwijkingen vertonen pas later stadium, was het belangrijk om de celcyclus in acht popstadium weefsels. epitheelcellen in de pop een meer typische G1-S-G2-M celcyclus en poppen van deze fase zijn niet in staat spierbewegingen 9 De eerste uitgangspunt manipulaties opgenomen intacte hele poppen expressie Histone2AV-GFP. Ondanks de schijnbare dichtheid van het popstadium. Deze intacte preparaat bleek uitstekende lange termijn in vivo beeldvorming zijn. Deze techniek is eenvoudig genoeg dat undergraduate onderzoekers gebruiken routinematig om aspecten van cel-en ontwikkelingsbiologie in Drosophila studeren en toch de resolutie is fijn genoeg om discriminatie van micrometer schaal functies kunt. Met deze methode, observaties van gebeurtenissen dan uren, minuten of seconden zijn mogelijk gewoon door het aanpassen van tijdreeksen parameters. Video behulp van blauw, groen, geel, oranje en rood fluorescerende eiwitten, of combinaties daarvan, zijn gemaakt. Belangrijk is wanneer getracht het laserintensiteit minimaliseren, zelfs op lange termijn beeldvorming heeft geen effect op de ontwikkeling of de levensvatbaarheid van de dieren.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vliegen Work
- Handhaaf vliegen op standaard maïsmeel-agar-melasse-gist medium bij kamertemperatuur 10.
- Voor kruisen, isoleren maagden binnen 6 uur van verpopping. Na de kruising met mannen van het gewenste genotype, verandering vliegt naar nieuwe flesjes om de 3-4 dagen.
Opmerking: Voor deze experimenten werd Gal4 lijn A9 toegepast om expressie van transgenen te rijden in de vleugel. Vliegen voorraden kan worden verkregen uit de voorraad centrum in Bloomington. Aandelen gebruikt in deze experimenten omvatten A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CYO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Selectie en montage van Poppen
- Stage poppen hetzij door het verzamelen van hen als witte prepupae (WPP) en houden ze bij 25 ° C totdat ze de juiste leeftijd hebben bereikt of met behulp van morfologische criteria 12.
- Om celdelingen, selecteert pop die onlangs hebben ondergaan hoofd eversie observeren.Vanaf deze tijd tot vlak voor eclosion (bij> 96 uur), poppen zijn immobiel waardoor langere time-lapse observatie.
- Verwijder poppen uit de vaatjes door ze eerst aan te raken met een penseel bevochtigd met water, wachtend op een minuut om het water om de lijm los te maken en vervolgens voorzichtig porren ze op het penseel.
- Voorzichtig wassen geselecteerde poppen door porren ze met een penseel in het water om de speekselklier lijm en etensresten te verwijderen.
- Transfer schoon poppen aan een 25 mm petrischaal met een dekglaasje bodem (nummer 1 ½ dekglaasjes).
- Met dunne stroken of klei of tandheelkundige was als drager, zet poppen zodat het weefsel van belang het dichtst bij het dekglaasje.
Opmerking: In de hier beschreven studies, hebben pupal vleugels, benen, buik histoblasts of dorsale notum waargenomen. In de praktijk elk weefsel in 20 urn van het oppervlak van het popstadium waarneembaar. - Orient poppen zorgvuldig, zodat de tissue plaats evenwijdig aan de glazen dekglaasje oppervlak.
- Zodra poppen zijn gemonteerd, gebruikt een penseel een dun laagje thiodiethyleenglycol (TDG) overbrengen naar de ruimte tussen de pop en het dekglaasje.
Opmerking: TDG vermindert oppervlakte verstrooiing, overeenkomt met de brekingsindex van de olie, en kan zuurstof naar het weefsel 13 doordringen. Het gebruik van oliën wordt niet aanbevolen, omdat ze de neiging om de weefsels te beroven van zuurstof, waardoor een snelle beëindiging van de cel gedrag.
3. Imaging
Opmerking: Voor grafische, van een confocale microscoop is waarschijnlijk essentieel om zo de confocaliteit verwijdert de meeste van de verduisterende achtergrond veroorzaakt door intense verlichting van het popstadium.
- Instellingen van de confocale Stel het effect van verlichting op popstadium ontwikkeling en levensvatbaarheid minimaliseren. Om dit te doen, een evenwicht tussen de intensiteit van excitatie en de gevoeligheid van de collectie. Een typische configuratie voor beeldvorming with de Leica SP5 gebruikt de resonantie scanner (8000 Hz), laservermogen te stellen op 2% (10% doorlaatbaarheid van 20% vermogen), pinhole set tot 120 micrometer, en lijn middeling ingesteld op 8. Instellingen zijn afhankelijk van experimentele omstandigheden.
Opmerking: Om te lossen fijnschalige beschikt 40X en 63X Olievulling lenzen (0,1 mm werkafstand) zijn ook met succes gebruikt in deze methode, hoewel ze beperken de scherptediepte.
4. Analyse
Om frames te analyseren, z-stacks of films de data bestanden te importeren naar Fiji, die effectieve tools voor het bekijken, meten, en het wijzigen van bestanden voor de presentatie 14 heeft. Bijvoorbeeld tijd om mitose voltooid werd gemeten met de sampling interval en multidimensionale image browser om door frames tijdens het kijken naar een cel van profase tot telofase. x-, y-is, en z-dimensies gemeten met het meetinstrument. Voor gedetailleerde instructies over de software en het gebruik ervanzie: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellen in pseudo-epitheel, zoals de ontwikkeling van Drosophila oog of de ventriculaire laag van de zich ontwikkelende gewervelde centrale zenuwstelsel ondergaan nucleaire bewegingen genoemd interkinetic nucleaire migratie in de tijd met de celcyclus. DNA replicatie als kernen in of nabij het basale oppervlak en cellen binnen mitose wanneer de kernen zo het apicale oppervlak 15,16. De pupal vleugel cellen vormen een snel delende monolaag epitheel gedurende de eerste paar uur na kop eversie. De gegevens werden verzameld in xyzt modus van een vroege pupal vleugel, waarbij secties om de 2 micrometer per 1 min. intervallen. In het resulterende 3D-films mitose werd alleen gezien bij het apicale oppervlak (Figuur 1A). Secties die op meer basale plaatsen vertoonden geen tekenen van mitose (figuur 1B) maar nucleaire bewegingen ontstaan als de nieuw gedeelde kernen terug van het apicale oppervlak.
Figuur 1. Kernen naar de bovenkant van het epitheel te verdelen. Representatieve secties een xyzt confocale beeld van wild-type Drosophila popstadium vleugel uiten His2AvGFP uit. Op de bovenste delen (A) kernen te zien in verschillende fasen van de celcyclus. Kernen in metafase (pijlen) zijn er in overvloed in deze microscoop net als kernen in telofase (pijlpunten). Bij lagere gebieden van deel (B) geen bewijs van mitose blijkt al is er variatie in nucleaire diameter, die indicatief is voor de toestand van DNA replicatie. Schaal Bar 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visualiseren, meten en kwantificeren kenmerken van delende cellen, vereist de ontwikkeling van een eenvoudige voorbereiding voor het observeren van mitose in de levende pupal vleugel van Drosophila door middel van confocale analyse van His2AvGFP expressie cellen. Deze methode werd gebruikt om te documenteren dat de celcyclus in het popstadium vleugel draagt sterke gelijkenissen met cycli cel in pseudostratified epitheel in die kernen verhuizing naar de apicale oppervlak van het epitheel waar ze mitose voeren. Na telofase, kernen vallen terug in de epitheliale laag. Vandaar dat de cellen van deze monolaag, blijkbaar ongelaagde epitheel, tonen beperkt interkinetic nucleaire migratie.
Beeldvorming van openbare voorraden en lijnen gemaakt voor Brainbow 17 Type levend beeldvorming in Drosophila 11, aangetoond dat deze techniek is generaliseerbaar naar de studie van andere biologische fenomenen. De hier beschreven techniek werd gebruikt voor de productie van videos op tijden variërend van minuten tot 10 uur. Tot op zekere hoogte, de microscoop parameters variëren met het experiment. Zo moet de sampling rate van time-lapse imaging voldoen aan de aard van het biologisch fenomeen onder observatie: voor het observeren van celdelingen, die meestal duurt ongeveer 12 min van profase tot telofase, het verzamelen van een stapel afbeeldingen per minuut geschikt is. Om het gedrag van filopodia in dezelfde cellen waarnemen, moet delen of stapels worden verzameld op fijnere (3 seconden) intervallen.
Onder de beschreven omstandigheden, werd geen effect op de overleving of de morfologie van eclosing volwassenen waargenomen, ongeacht de periode van waarneming. Wanneer de fluorescerende marker is van lage overvloed, werd laservermogen meestal verhoogd. In deze situaties is het verkorten van de duur van de film of het verminderen van het aantal secties of z-stacks, geminimaliseerd blootstelling. Knoppen voor andere experimenten, waardoor de weefsel maximale intensiteit 5 minuten had geen effectieft op morfologie of overleving van de volwassen. Visualisatie werd verlengd rood, groen, geel, oranje en blauw fluorescerende eiwitten gelabeld met een verscheidenheid van verschillende eiwitten, gelokaliseerd in het membraan en / of het vullen van het cytoplasma te nemen. Functies in de sub-micron range werden waargenomen over tijdschalen van seconden tot uren. Deze werkwijze is uitgebreid gebruikt te observeren en meten van de timing en betrouwbaarheid van mitose in wildtype en mutanten (in voorbereiding).
Het popstadium van Drosophila ontwikkeling is een periode van opmerkelijke plasticiteit waarin het larvale vorm in hoofdzaak geëlimineerd terwijl de volwassen vorm ontwikkelt zich op het schavot van het larvale lichaam. Ondanks een rijke historie, heeft de studie van de metamorfose is methodologisch belemmerd. Zo is het gebruik van directe observatie processen onderliggende metamorfose bestuderen beperkt door het gebrek aan betrouwbare in vivo toegang tot de cellen en weefsels tijdens verbouwing. De verrassendeenvoudige benadering hier gepresenteerde biedt toegang tot deze cryptische periode van ontwikkeling in Drosophila. De aanpak is eenvoudig genoeg dat studenten gemakkelijk kunnen leren en gebruiken en robuust genoeg is om observaties van weefsels, cellen en subcellulaire organisatie mogelijk te maken. De microscoop gebruikt voor deze experimenten is niet geoptimaliseerd voor deep tissue beeldvorming en dus onze observaties grotendeels beperkt tot de buitenste 20 urn van de pop. Het is waarschijnlijk dat technieken die diepere penetratie, zoals multi-foton microscopie mogelijk, zou een veel grotere diepte van beeldvorming toe en laat studie van de interne structurele herschikkingen onderliggende metamorfose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Akira Chiba erkennen voor intellectuele steun, materiële steun, en de voorraden. Met dank aan Julia Dallman voor commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
