Summary
Ce document illustre l'utilisation d'un balayage rapide microscope confocal à un comportement cellulaire de l'image directement à travers la pupe. En laissant la coque de nymphose intacte, cette méthode permet l'observation et la mesure des processus dynamiques de cellule à un stade de développement de la drosophile qui est difficile à étudier directement.
Abstract
L'utilisation de longue date de la drosophile comme modèle pour la biologie cellulaire et de développement a donné une gamme d'outils. Ensemble, ces techniques ont permis l'analyse de cellules et de la biologie du développement à partir d'une variété d'angles méthodologiques. Imagerie en temps réel est une nouvelle méthode pour l'observation des processus dynamiques de cellule, telles que la division cellulaire ou de la motilité cellulaire. Après avoir isolé des mutations dans les protéines du cycle cellulaire putatifs non caractérisés, il est devenu essentiel d'observer la mitose in situ en utilisant l'imagerie en direct. La plupart des études d'imagerie en direct chez la drosophile ont porté sur les stades embryonnaires qui sont accessibles à la manipulation et l'observation en raison de leur petite taille et de clarté optique. Toutefois, dans ces phases du cycle cellulaire est inhabituel en ce qu'il manque une ou deux des phases de l'écart. En revanche, les cellules de l'aile des pupes de la drosophile ont un cycle cellulaire typique et subissent une période de mitose rapide couvrant environ 20 h de développement des pupes. Il est facile d'identify et isoler les nymphes de la scène appropriée pour attraper la mitose in situ. Montage pupes intact offrait la meilleure combinaison de traçabilité et de durabilité lors de l'imagerie, permettant des expériences de courir pendant plusieurs heures avec un impact minimal sur la cellule animale et la viabilité. La méthode permet l'observation de caractéristiques aussi petites ou plus petites que, voler chromosomes. Ajustement des réglages du microscope et les détails de montage, a permis l'extension de la préparation de visualiser la dynamique des membranes des cellules adjacentes et les protéines marquées par fluorescence tels que la tubuline. Cette méthode fonctionne pour toutes les protéines fluorescentes testé et peut capturer submicroniques caractéristiques d'échelle sur une variété d'échelles de temps. Bien que limitée à l'extérieur de 20 um de la nymphe avec un microscope confocal classique, cette approche à l'observation de protéines et dynamique cellulaires dans les tissus des pupes in vivo peut être généralement utile dans l'étude de la biologie cellulaire et de développement dans ces tissus.
Introduction
La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un modèle bien établi pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Recherche Drosophila a une riche histoire de l'expérimentation génétique qui permet des formes plus sophistiquées de manipulation de gènes dont l'expression, démontable et mutation. Avec l'avènement des étiquettes de protéines fluorescentes, ce répertoire a été élargi pour inclure des études sur des cellules et des protéines chez les animaux vivants. L'embryon de mouche est un excellent système pour les études qu'elle est petite et optiquement clair permettant profonde, haute résolution imagerie in vivo 1-3. D'autres étapes du développement de la mouche se sont avérées moins docile, nécessitant anesthésie 4, la dissection et de la culture à court terme de 5,6, ou la création de fenêtres de la cuticule pour l'imagerie 7,8. Ces manipulations compromettent généralement le développement animal à long terme ou affectent l'animal de manière à limiter l'imagerie pour de courtes périodes.
ent "> Pour étudier de nouvelles mutations dans les gènes qui ressemblent à des régulateurs du cycle cellulaire, il est essentiel de trouver une préparation appropriée pour étudier le calendrier et la fidélité du cycle cellulaire. Comme la plupart des cycles de cellules embryonnaires sont tronqués (SM ou S-G2-M) et les mutants étudiés ne présentent pas de défauts jusqu'à ce que les étapes ultérieures, il est important d'observer le cycle cellulaire dans les tissus stade de pupe. cellules épithéliales de la pupe ont un cycle cellulaire G1-S-G2-M plus typiques et les nymphes de cette étape sont pas capable de mouvements musculaires 9. Le point de départ initial pour les manipulations inclus toute pupes intact exprimer Histone2AV-GFP. Malgré l'apparente opacité de la pupe, cette préparation intacte s'est avérée excellente à long terme dans l'imagerie in vivo. Cette technique est simple assez que les chercheurs de premier cycle utilisent régulièrement pour étudier les aspects de la biologie cellulaire et de développement chez la drosophile et pourtant la résolution est assez fine pour permettre la discrimination des fonctionnalités à l'échelle du micromètre. Avec cette méthode, l'observation des événements au cours des heures, minutes ou secondes sont possibles simplement en ajustant les paramètres de séries chronologiques. Vidéos en utilisant bleu, des protéines fluorescentes vertes, jaunes, oranges, rouges et, ou des combinaisons de ceux-ci, ont été réalisés. Surtout, si les soins sont prises pour minimiser l'intensité du laser, même imagerie à long terme n'a pas d'effet sur le développement ou la viabilité des animaux.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Fly travail
- Maintenir les mouches sur le milieu de semoule de maïs-agar-mélasse-levure standard à température ambiante 10.
- Pour croix, isoler vierges dans les 6 h de l'éclosion. Après avoir traversé les mâles du génotype désiré, changement vole vers de nouveaux flacons tous les 3-4 jours.
Remarque: Pour ces expériences, ligne Gal4 A9 a été utilisé pour diriger l'expression de transgènes dans l'aile. Fly stocks peuvent être obtenues auprès du centre de langue à Bloomington. Stocks utilisés dans ces expériences comprennent A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CYO HsCre (Bl # 1092), SAMU-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Sélection et montage des pupes
- Stade de nymphes, soit par la collecte comme prénymphes blanc (WPP) et les maintenir à 25 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent l'âge approprié ou en utilisant des critères morphologiques 12.
- Pour observer des divisions cellulaires, sélectionnez nymphe qui ont récemment subi une tête de retournement.Partir de ce moment jusqu'à ce que juste avant l'éclosion (à> 96 h), les nymphes sont immobiles permettant l'observation prolongée time-lapse.
- Retirer les nymphes des flacons d'abord en les touchant avec un pinceau imbibé d'eau, en attendant une minute pour permettre à l'eau pour desserrer la colle et puis doucement les pousser sur le pinceau.
- Lavez délicatement les nymphes sélectionné par les pousser avec un pinceau dans l'eau pour éliminer les particules adhésives de la glande et alimentaires salivaires.
- Transférer les pupes propre à une boîte de Petri de 25 mm avec un fond de la lamelle couvre-objet (numéro 1 ½ lamelles couvre-objet).
- Utilisation de fines bandes de pâte à modeler soit ou cire dentaire à titre de support, de sorte que les pupes monter le tissu d'intérêt est la plus proche de la lamelle.
Note: Dans les études décrites ici, ailes de nymphose, les jambes, histoblastes abdominales ou dorsales notum ont été observés. En pratique, n'importe quel tissu dans 20 um de la surface de la coque de nymphose est observable. - Nymphes Orient avec soin afin que le tissue d'intérêt est parallèle à la surface de la lamelle de verre.
- Une fois les nymphes sont montés, utilisez un pinceau pour transférer une fine couche de thiodiéthylèneglycol (TMD) à l'espace entre la nymphe et la lamelle.
Remarque: TMD réduit la diffusion de surface, correspond à l'indice de réfraction de l'huile, et permet à l'oxygène de pénétrer le tissu 13. L'utilisation des huiles n'est pas recommandé, car ils ont tendance à priver les tissus de l'oxygène, ce qui provoque la cessation rapide des comportements cellulaires.
3. Imagerie
Remarque: Pour l'imagerie, un microscope confocal est susceptible d'être essentiel que le confocalité supprime la plupart des fond d'obscurcissement causé par un éclairage intense de la coque de nymphose.
- Réglez les paramètres sur la confocale à minimiser l'impact de l'éclairage sur le développement des pupes et la viabilité. Pour ce faire, trouver un équilibre entre l'intensité de l'excitation et de la sensibilité de la collecte. Une configuration typique pour l'imagerie wie le Leica SP5 utilisé le scanner de résonance (8000 Hz), la puissance du laser fixé à 2% (10% de transmission de puissance de 20%), ensemble sténopé à 120 um, et la ligne VITESSE réglée à 8. Paramètres peuvent varier en fonction des conditions expérimentales.
Remarque: Pour résoudre échelle fine dispose 40X et 63X lentilles à immersion d'huile (0,1 mm de distance de travail) ont également été utilisés avec succès dans cette méthode, même si elles limitent la profondeur de champ.
4. Analyse
Pour analyser les trames, z-piles ou des films importer les fichiers de données à FIDJI, qui dispose d'outils efficaces pour la visualisation, la mesure et la modification des fichiers de présentation 14. Par exemple le temps de compléter la mitose a été mesurée en utilisant l'intervalle d'échantillonnage et le navigateur d'image multidimensionnelle de l'étape à travers les cadres tout en regardant une cellule de la prophase à la télophase. x, y, et z dimensions peuvent être mesurées à l'aide de l'outil de mesure. Pour obtenir des instructions détaillées sur le logiciel et son utilisationvoir: http://fiji.sc/Fiji.
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Representative Results
Les cellules de l'épithélium pseudo-stratifié, telles que le développement de l'œil de Drosophila, ou de la couche du ventricule du système nerveux central des vertébrés en développement, subissent des mouvements nucléaires, appelée migration nucléaire interkinetic, dans le temps avec le cycle cellulaire. réplication de l'ADN se produit lorsque les noyaux sont au niveau ou près de la surface de la base et les cellules entrent en mitose lorsque les noyaux atteignent la surface apicale 15,16. Les cellules de l'aile des pupes forment une monocouche épithélium division rapide pendant les premières heures après la tête de retournement. Les données ont été recueillies en mode xyzt d'une aile de pupe tôt, en prenant toutes les sections 2 pm à intervalles de 1 min. Dans la mitose films 3D en résulte que l'a vu à la surface apicale (figure 1A). Sections prises à des endroits plus basales ne présentaient aucun signe de la mitose (figure 1B), mais les mouvements nucléaires ont eu lieu comme les noyaux nouvellement divisées retour de la surface apicale.
Figure 1. Noyaux se déplacer vers le haut de l'épithélium de diviser. Sections représentatives d'une image xyzt confocale de type sauvage Drosophila pupe aile exprimer His2AvGFP. Au haut de la plupart des sections (A) des noyaux peuvent être vus dans les différentes phases du cycle cellulaire. Noyaux en métaphase (flèches) sont abondants dans cette photographie que sont les noyaux en télophase (pointes de flèches). Au plans inférieurs de la section (B) aucun signe de la mitose est apparent qu'il y ait variation du diamètre nucléaire, ce qui est indicatif de l'état de la réplication de l'ADN. Barre d'échelle de 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Pour visualiser, mesurer et quantifier les caractéristiques des cellules en division, le développement nécessaire d'une préparation simple pour l'observation de la mitose dans l'aile pupe vie de la drosophile par des moyens d'analyse confocale de cellules exprimant His2AvGFP. Cette méthode a été utilisée pour documenter que le cycle cellulaire dans l'aile pupe porte de fortes similitudes avec la cellule cycles dans l'épithélium pseudo-stratifié en ce que les noyaux passage à la surface apicale de l'épithélium où ils entrent en mitose. Après télophase, les noyaux retombent dans la couche épithéliale. Ainsi, les cellules de cette monocouche, épithélium apparemment non stratifié, spectacle limités interkinetic migration nucléaire.
Imagerie des stocks et des lignes créées pour brainbow 17 imagerie de type direct chez la drosophile 11 accessibles au public, a démontré que cette technique est généralisable à l'étude d'autres phénomènes biologiques. La technique décrite ici a été utilisé dans la production de videos sur des durées allant de quelques minutes à 10 heures. Dans une certaine mesure, les paramètres de microscope varient avec l'expérience. Par exemple, le taux de l'imagerie time-lapse échantillonnage doit être conforme à la nature du phénomène biologique sous observation: pour l'observation des divisions cellulaires, qui prennent généralement autour de 12 min de la prophase à la télophase, la collecte d'une pile d'images chaque minute est appropriée. Pour observer le comportement des filopodes dans les mêmes cellules, sections ou piles doivent être collectées au plus fine (3 sec) intervalles.
Dans les conditions décrites, sans effet sur la survie ou la morphologie des adultes de eclosing a été observé indépendamment de la période d'observation. Lorsque le marqueur fluorescent est de faible abondance, la puissance du laser a été généralement augmenté. Dans ces situations, le raccourcissement de la durée du film ou de réduire le nombre de sections ou z empilements, une exposition réduite au minimum. Dans les contrôles pour d'autres expériences, exposer le tissu à intensité maximale pendant 5 minutes n'avait pas efficacet sur la morphologie ou la survie de l'adulte. La visualisation a été étendu pour inclure rouge, vert, jaune, orange et bleu protéines fluorescentes marqués à une variété de protéines différentes, localisée à la membrane, et / ou le remplissage du cytoplasme. Caractéristiques de la gamme submicronique ont été observées sur des périodes de quelques secondes à quelques heures. Cette méthode a été largement utilisée pour observer et mesurer le temps et la fidélité de la mitose dans le type sauvage et des mutants (en préparation).
Le stade de pupe de développement de la drosophile est une période de plasticité remarquable dont la forme larvaire est essentiellement éliminé tandis que la forme adulte se développe sur l'échafaud du corps larvaire. Malgré une histoire riche, l'étude de la métamorphose a été méthodologiquement entravé. Par exemple, l'utilisation de l'observation directe d'étudier le processus métamorphose sous-jacente a été limitée par le manque de fiabilité de l'accès vivo pour les cellules et les tissus au cours de remodelage. La surprenanteapproche simple présentée ici permet d'accéder à cette période cryptique du développement chez la drosophile. L'approche est assez simple pour que étudiants peuvent facilement apprendre et à utiliser et suffisamment robuste pour permettre des observations de tissus, de cellules et de l'organisation subcellulaire. Le microscope utilisé pour ces expériences n'est pas optimisé pour l'imagerie des tissus profonds, et si nos observations sont largement limitée à l'extérieur de 20 um de la chrysalide. Il est probable que les techniques qui permettent la pénétration des tissus plus profonds, tels que la microscopie multi-photons, permettrait une bien plus grande profondeur de l'imagerie et de permettre l'étude de réarrangements de structures internes sous-jacentes métamorphose.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Akira Chiba pour un soutien intellectuel, le soutien matériel et les stocks. Merci à Julia Dallman pour commentaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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