Summary
Dette papiret demonstrerer anvendelse av en rask scanning konfokalmikroskop til bildecelle oppførsel direkte gjennom puparium. Ved å la pupal tilfelle intakt, gir denne metoden observasjon og måling av dynamiske celleprosesser på et stadium av Drosophila utvikling som er vanskelig å studere direkte.
Abstract
Den mangeårige bruk av Drosophila som en modell for celle-og utviklingsbiologi har gitt en rekke verktøy. Sammen har disse teknikkene aktivert analyse av celle-og utviklingsbiologi fra en rekke metodiske vinkler. Live-avbildning er en ny metode for å observere dynamiske celleprosesser, for eksempel celledeling eller cellemotilitet. Etter å ha isolert mutasjoner i uncharacterized antatte cellesyklusproteiner ble det viktig å observere mitose in situ ved hjelp av levende bilder. De fleste live-imaging studier i Drosophila har fokusert på de embryonale stadier som er tilgjengelig for manipulasjon og observasjon på grunn av sin lille størrelse og optisk klarhet. Men i disse fasene cellesyklus er uvanlig ved at den mangler en eller begge av de gap faser. Derimot, celler av pupal fløyen av Drosophila har en typisk cellesyklus og gjennomgår en periode med hurtig mitose som strekker seg over omtrent 20 timer for pupal utvikling. Det er lett å identify og isolere puppe av den aktuelle scenen for å fange mitose in situ. Montering intakt puppe gitt den beste kombinasjonen av tractability og holdbarhet under bildebehandling, slik at eksperimenter for å kjøre i flere timer med minimal innvirkning på celler og dyr levedyktighet. Metoden gjør det mulig observasjon av funksjoner så liten som, eller mindre enn, fly kromosomer. Justering av mikroskop innstillinger og detaljene for montering, tillates utvidelse av blandingen for å visualisere dynamikk membran av tilstøtende celler og fluorescensmerkede proteiner som tubulin. Denne metoden fungerer for alle testede fluorescerende proteiner og kan fange submikron skala funksjoner over en rekke tidsskalaer. Mens begrenset til den ytre 20 mikrometer til puppe med en konvensjonell konfokalmikroskop, kan denne metode for å observere protein og cellulære dynamikken i pupal vev in vivo være generelt nyttige ved studiet av cellen og utviklingsbiologi i disse vev.
Introduction
Eddik fly, Drosophila melanogaster, er en godt etablert modell for å studere mange aspekter av biologi. Drosophila forskning har en rik historie av genetisk eksperimentering som gjør at sofistikerte former for genmanipulering inkludert uttrykk, knockdown og mutasjon. Med bruk av fluorescerende protein etiketter, har dette repertoaret utvidet til å omfatte studier av celler og proteiner i levende dyr. Flua embryo er et utmerket system for slike studier som det er lite og optisk klart slik dyp, bildebehandling med høy oppløsning in vivo 1-3. Andre stadier av fly utvikling har vist seg å være mindre medgjørlig, krever anestesi 4, disseksjon og kort sikt kultur 5,6, eller etablering av vinduer i hårstråene for bildebehandling 7,8. Disse manipulasjoner vanligvis kompromiss dyr utvikling på lang sikt eller påvirke dyr på måter som begrenser bilde til korte perioder.
ent "> Å studere nye mutasjoner i gener som ligner cellesyklus regulatorer, var det viktig å finne en passende forberedelse til å studere timing og troskap av cellesyklusen. Siden de fleste embryonale cellesykluser avkortes (SM eller S-G2-M) og mutantene som undersøkes, ikke viser defekter før senere stadier, var det viktig å observere cellesyklus i pupal scenen vev. epitel-celler i puppe har en mer typisk G1-S-G2-M cellesyklus og pupper av dette stadiet er ikke i stand til muskelbevegelser ni. Den opprinnelige utgangspunktet for manipulasjoner inkludert intakt hele puppe uttrykker Histone2AV-GFP. tross for den tilsynelatende tetthet av pupal tilfelle, dette viste seg intakt forberedelse til å være utmerket for langsiktig in vivo imaging. Denne teknikken er enkel nok til at undergraduate forskere rutinemessig bruke den til å studere aspekter ved celle-og utviklingsbiologi i Drosophila og likevel oppløsningen er fin nok til å tillate diskriminering av mikrometer skala funksjoner. Med denne metoden, observasjoner av hendelser enn timer, minutter eller sekunder er mulig bare ved å justere tidsserier parametere. Videoer med blå, grønne, gule, oransje og røde fluorescerende proteiner, eller kombinasjoner av disse, er det gjort. Det blir fore hvis vekt på å minimalisere laserintensitet, selv langvarig avbildning har ingen effekt på utvikling eller levedyktigheten av dyrene.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Fly Work
- Oppretthold fluer på standard cornmeal-agar-melasse-gjær medium ved romtemperatur 10.
- For kors, isolere jomfruer innen seks timer av eklosjonshormon. Etter å ha krysset til hanner av ønsket genotype, flyr endring til nye ampuller hver 3-4 dager.
Merk: For disse eksperimentene, ble Gal4 linjen A9 brukes til å drive uttrykk for transgener i vingen. Fly aksjer kan fås fra aksjesenter i Bloomington. Aksjer som brukes i disse forsøkene inkluderer A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CYO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Valg og montering av Pupae
- Stage puppe enten ved å samle dem som hvit prepupae (WPP) og holde dem ved 25 ° C til de når riktig alder eller ved hjelp av morfologiske kriterier 12.
- Å observere celledelinger, velger puppe som nylig har gjennomgått hode eversion.Fra denne tiden før like før eklosjonshormon (ved> 96 timer), er puppe immobile slik at utvidet time-lapse observasjon.
- Fjern puppe fra ampullene ved først å berøre dem med en pensel fuktet med vann, venter på et minutt for å la vannet for å løsne limet og deretter forsiktig prodding dem på pensel.
- Vask forsiktig valgt puppe med stikking dem med en pensel i vann for å fjerne de spyttkjertel klebende og matpartikler.
- Overfør rent puppe til en 25 mm petriskål med en dekk bunn (nummer 1 ½ Dekk).
- Ved hjelp av tynne strimler av enten modelleringsleire eller tann voks som en støtte, montere puppe, slik at vevet i området er nærmest dekkglass.
Merk: I de studiene som er beskrevet her, har pupal vinger, ben, mage histoblasts eller rygg notum blitt observert. I praksis er alle vev i 20 mikrometer på overflaten av pupal tilfelle observeres. - Orient puppe nøye slik at tissue av interesse er parallell med glassdekkflaten.
- Når puppe er montert, kan du bruke en pensel til å overføre et tynt lag av thiodiethylene glycol (TDG) til plassen mellom puppe og dekkglass.
Merk: TDG reduserer overflate spredning, tilsvarer brytningsindeksen for olje, og tillater oksygen å trenge gjennom vevet 13. Bruk av oljer anbefales ikke, da de har en tendens til å frata vev av oksygen, forårsaker rask avslutning av celle atferd.
Tre. Imaging
Merk: For bildebehandling, vil trolig være avgjørende som confocality fjerner det meste av tilsløring bakgrunnen forårsaket av intens belysning av pupal tilfelle en konfokalmikroskop.
- Juster innstillingene på confocal å minimere virkningen av belysning på puppestadiet utvikling og levedyktighet. For å gjøre dette, finne en balanse mellom intensiteten av eksitasjon og følsomheten av samlingen. En typisk konfigurasjon for bildebehandling with Leica SP5 benyttet resonans scanner (8000 Hz), laser-kraft er satt til 2% (10% transmisjon av 20% styrke), pinhole satt til 120 mikrometer, og linje i snitt sett til 8. Innstillinger vil variere avhengig av eksperimentelle betingelser.
Merk: For å løse finskalaen har 40X og 63x oljeimmersjon objektiver (0,1 mm arbeidsavstand) har også blitt brukt i denne metoden, selv om de begrense dybdefokus.
4. Analyse
Å analysere rammer, z-stabler eller filmer importere datafiler til FIJI, som har effektive verktøy for visning, måling, og endre filer for presentasjon 14. For eksempel tid til å fullføre mitose ble målt ved hjelp av sampling intervall og flerdimensjonalt bilde nettleser til å gå gjennom rammer mens du ser på en celle fra prophase å Telofase. x-, kan y-og z-dimensjoner måles ved hjelp av måleverktøyet. For detaljerte instruksjoner om programvaren og brukense: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler i pseudostratified epitel, slik som det fremkallende Drosophila øye, eller den ventrikulære lag av det fremkallende virveldyr sentralnervesystemet, gjennomgår atombevegelser, betegnet interkinetic atom migrasjon, i takt med cellesyklusen. DNA-replikasjon forekommer når kjerner er ved eller nær den nedre overflate og celler inn mitose når kjernen når den apikale overflate 15,16. Pupal vinge cellene danner et raskt dele monolayer epitel løpet av de første timene etter hode eversion. Data ble samlet inn i xyzt modus fra en tidlig pupal vingen, tar seksjoner hver 2 mikrometer med 1 minutts intervaller. I den resulterende 3D filmer mitose ble bare sett på den apikale overflaten (figur 1A). Seksjoner tatt på flere basale steder viste ingen tegn til mitose (Figur 1b), men kjernefysiske bevegelser skjedde som de nylig delt kjerner returnert fra den apikale overflaten.
Figur 1. Kjerner flytte til toppen av Epitel å dele. Representative deler fra en xyzt confocal bilde av villtype Drosophila pupal fløyen uttrykker His2AvGFP. På den øverste seksjoner (A) kjerner kan sees i forskjellige faser av cellesyklusen. Kjerner i metafase (piler) er rikelig i dette micrograph som er atomkjerner i Telofase (pilspisser). Ved lavere plan av delen (B) uten tegn til mitose er tydelig selv om det er variasjon i atomdiameter, noe som er en indikasjon på den tilstand av DNA-replikasjon. Scale Bar 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å visualisere, måle, og kvantifisere funksjonene dele celler, kreves utvikling av en enkel forberedelse for å observere mitose i den levende pupal fløyen av Drosophila ved hjelp av confocal analyse av His2AvGFP uttrykke celler. Denne metoden ble brukt til å dokumentere at cellesyklusen i pupal fløyen bærer sterke likhetstrekk til cellesykluser i pseudostratified epithelia i at atomkjerner flytte til den apikale overflaten av epitel hvor de kommer inn mitose. Etter telophase, kjernene faller tilbake inn i epitellaget. Derfor cellene i denne monolayer, tilsynelatende stratifisert epitel, viser begrenset interkinetic atom migrasjon.
Imaging av offentlig tilgjengelige aksjer og linjer som er opprettet for brainbow 17 typen direkte avbildning i Drosophila 11, viste at denne teknikken er generalizable til studiet av andre biologiske fenomener. Teknikken som beskrives her ble brukt i produksjon av videos over tid, fra minutter til 10 timer. Til en viss grad, mikroskopet parametrene varierer med forsøket. For eksempel, må samplingsfrekvensen time-lapse bildebehandling i samsvar med naturen av biologisk fenomen under observasjon: for å observere celledelinger, noe som vanligvis tar rundt 12 min fra prophase å Telofase, samle en bunke bilder hvert minutt er hensiktsmessig. For å observere atferden til filopodia i de samme cellene, må seksjoner eller stabler hentes på finere (3 sek) intervaller.
Under de forholdene som er beskrevet, ble ingen effekt på overlevelse eller morfologi eclosing voksne observert uavhengig av observasjonsperioden. Når den fluorescerende markør er for lav mengde, ble lasereffekten typisk økt. I disse situasjonene, forkorte varigheten av filmen eller redusere antall seksjoner eller z-stabler, minimert eksponering. I kontroller for andre eksperimenter, utsette vevet for maksimal intensitet i 5 minutter hadde ingen effektivt på morfologi eller overlevelse av den voksne. Visualisering ble utvidet til å omfatte rød, grønn, gul, oransje og blå fluorescerende proteiner merket til en rekke forskjellige proteiner, lokalisert til membranen og / eller fylling av cytoplasma. Funksjoner i submikrometer serien ble observert over tidsskalaer fra sekunder til timer. Denne metoden har vært brukt mye til å observere og måle timing og troskap av mitose i villtype og mutanter (under forberedelse).
Den pupal fasen av Drosophila utvikling er en periode med bemerkelsesverdig plastisitet hvor larve formen er i det vesentlige eliminert samtidig som voksen form utvikles på stillaset på larve legeme. Til tross for en rik historie, har studiet av metamorfose blitt metodisk hemmet. For eksempel har bruk av direkte observasjon for å studere prosesser liggende metamorfose vært begrenset av den manglende pålitelige in vivo tilgang til celler og vev under ombygging. Den overraskendeenkel tilnærming som presenteres her gir tilgang til denne kryptisk periode med utvikling i Drosophila. Tilnærmingen er enkel nok til at studenter lett kan lære og bruke det og robust nok til å tillate observasjoner av vev, celler og subcellulære organisasjon. Mikroskopet brukt for disse eksperimentene er ikke optimalisert for dype vev avbildning, og så våre observasjoner er i stor grad begrenset til den ytre 20 mikrometer til puppe. Det er sannsynlig at teknikker som tillater dypere vev penetrasjon, slik som multifotonmikroskopi, ville tillate en mye større dybde av avbildning og tillater studium av de interne strukturelle rearrangements liggende metamorfose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Akira Chiba for intellektuell støtte, materiell støtte, og bestandene. Takk til Julia Dallman for kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
