Abstract
Теломераза, рибонуклеопротеиновый, отвечает за поддержание длину теломер и, следовательно, содействие геномной целостности, пролиферацию, и продолжительность жизни. Кроме того, теломераза защищает митохондрии от окислительного стресса и придает устойчивость к апоптозу, предлагая свое возможное значение для выживания не-митотических, высокоактивные клетки, такие как нейроны. Мы ранее продемонстрировали способность новых теломеразы активаторов для увеличения активности теломеразы и выражение в различных регионах мозга мыши и защищать моторных нейронов клетки от окислительного стресса. Эти результаты укрепляют мнение, что теломераза участвует в защите нейронов от различных повреждений. Чтобы подчеркнуть роль теломеразы в мозге, мы здесь сравнивать активность теломеразы в мужской и женский мозг мыши и ее зависимость от возраста. TRAP анализа является стандартным методом для обнаружения активности теломеразы в различных тканях или клеточных линий. Здесь мы показываем, анализа парамSIS теломеразной активности в трех областях головного мозга мыши путем неденатурирующих экстрагирования белка с использованием буфера для лизиса CHAPS затем модификации стандартного TRAP анализа.
В этом 2-ступенчатой анализа, эндогенный теломеразы удлиняет конкретный теломеразы субстрат (TS праймера) добавив TTAGGG 6 повторов, BP (теломеразы реакцию). Реакционные теломераза продукты усиливаются с помощью ПЦР-реакции, создающей ДНК лестнице 6 шагом ВР. Анализ ДНК маркера производится с помощью электрофореза в агарозном геле 4,5% высокого разрешения с последующим окрашиванием красителем высокочувствительного нуклеиновой кислоты.
По сравнению с традиционным TRAP анализа, которые используют 32 P с надписью радиоактивных дЦТФ для выявления ДНК и электрофореза в полиакриламидном геле для решения лестницу ДНК, этот протокол предлагает нетоксичный экономия времени TRAP анализа для оценки активности теломеразы в мозге мыши, демонстрируя способность к выявления различий в telomerasэ деятельность в различных женского и мужского области мозга мыши.
Introduction
Теломеразы является рибонуклеопротеин состоит из теломеразной обратной транскриптазы (TERT), каталитической субъединицы теломеразы, и компонент РНК (TERC). Каноническая роль теломеразы является сохранение надлежащего длину теломер, добавив повторяющиеся последовательности (TTAGGG) к теломерными концов, поэтому содействие геномной целостности и пролиферацию клеток 1. Дополнительные роли были отнесены к трет в клетках, то есть придает устойчивость к апоптозу, вызванному различными повреждающего агента 2, защищает человека мезенхимальные стволовые клетки от окислительного стресса 3, и играет роль про-выживания в полностью дифференцированных нейронов своей причастностью к TIA1 положительный РНК гранулы 4.
TERT выражается и активны в основном в соматических деления клеток и в большинстве видов рака, в то время как уровни экспрессии фермента и активность жестко регулируется в не-деления клеток 5,6. Исследования показали, что в рОден мозга, активность теломеразы более не обнаруживается день после рождения 10, в то время как ТРЕТ мРНК поддерживается на более низких уровнях и во взрослом возрасте 7. Другие исследования показали, активность теломеразы в рамках суб-желудочковой зоны взрослого, обонятельной луковице, гиппокампе, и во взрослом мозжечке и коре 8. Мы недавно показали, что новые соединения, которые повышают экспрессию теломеразы и активность в мозге и спинном мозге, оказываемое нейропротекторное действие в N-метил-D-аспартат (NMDA) - вводили мышам, задержка развития и прогрессирования о боковой амиотрофический склероз болезни в СОД1 трансгенных мышей и повышает выживаемость моторных нейронов в спинном мозге этих мышей 9. Чтобы полностью понять роль про-выживания теломеразы в нейронах и в мозге, важно разработать простой и относительно чувствительной быстрый тест для обнаружения активности теломеразы в различных областях головного мозга.
Теломерный гПротокол EPEAT амплификации (TRAP) представляет собой хорошо известный чувствительным анализом сочетания канонический активность теломеразы и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В этом анализе, теломераза добавляет TTAGGG повторяет в теломеразы подложки (TS грунтовку) олигонуклеотида, а затем с помощью ПЦР-амплификации, который генерирует 6 пар оснований (АД) ДНК лестнице, используя TS обратного праймера -. ACX 32 P помечены дЦТФ, используются для обнаружения низкое количество продуктов ПЦР. Лестница ДНК решается секвенирование полиакриламидном геле (ПААГ). И интенсивность полос ДНК и длина лестницы ДНК отражают количество активных молекул фермента и их процессивности соответственно 10.
Этот традиционный анализ имеет некоторые серьезные трудности: опасность воздействия на радиоактивных веществ, больших и твердых обрабатывать секвенирования страницы и время потребление работающем гель и пленки воздействия радиоактивного продукта (в течение ночи в обоих случаях). Этот протокол предлагает улучшенный нерадиоактивный агарозном мини-гель анализа, основанный. ДНК 6 б.п. лестница будет решена с помощью 4,5% с высоким разрешением агарозном геле и обнаружение достигается с помощью высокочувствительного пятно нуклеиновой кислоты. Сочетание высокого разрешения с использованием агарозы мини-гель и чувствительный краситель нуклеиновой кислоты предлагает простой в обращении анализа, исключает опасность воздействия радиоактивности и значительно сократить общую продолжительность анализа от 3 дней до нескольких часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были одобрены этическим комитетом для экспериментов на животных в Университете Бен-Гуриона (IL-39-08-2010).
1 мышь Мозг Белок Добыча
- Подготовьте 3 трубки 15 мл каждая из которых содержит 5 мл раствора и место трубки Рингера на льду.
- Жертвоприношение мыши с помощью Isoflurane анестезии (ВНИМАНИЕ - использовать химическую капот) в течение 10-20 сек с последующим смещением шейных позвонков и немедленного обезглавливания.
- Снимите мозг из черепа и промыть в течение нескольких секунд с раствором ледяным Рингера для предотвращения повреждения мозговой ткани.
- Использование хирургического лезвия, отделить мозжечок (CR) и ствол мозга (BS) от лобной коры. Далее, отделить мозжечок от мозга и сократить лобную долю (FL) от лобной коры; удалить обонятельной луковицы от лобной доли. Поместите регионы 3 мозга в обозначенных 15 мл пробирок.
- Однородный ткани в каждую пробирку. Добавить фрЭШ ледяным Рингера так каждая трубка содержит тот же объем и центрифуги для 7 мин при 800 х г.
- Удалить супернатант и добавить 100 мкл CHAPS буфера для лизиса в каждую пробирку. Все хорошо перемешать, пропусканием раствора несколько раз (~ 10) через 1 мл шприц с 21 G иглы, и инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Передача содержимого каждой пробирки на новый микро-центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 30 мин при 13000 х г в. Передача супернатант в новую микро-центрифужную пробирку и определяют концентрацию белка с использованием ранее установленного способа. Хранить белковых экстрактов в виде аликвот по 10 мкл при -80 ° С.
2 TRAP анализа Подготовка инструментов, реакционные растворы и белка разбавления Расчеты
- Подготовьте необходимое количество меченых микро-трубки центрифуги для белковых экстрактов разведения и реакционного буфера теломеразы. Выполните все пипетирование в протоколе с использованием советы фильтра для предотвращения загрязнения. Оттепель следующие решения на льду: TRAP реакционной смеси 10x, TS грунтовки, дНТФ UPW и белковых экстрактов (см таблицу материалов для реагенты и реактивы концентраций).
- Развести раствор белкового экстракта до конечной концентрации 1 мкг / мкл с использованием сверхчистой воды (UPW).
3 теломеразы Реакция
- Подготовьте теломеразы реакционной смеси путем добавления в микро-трубки центрифуги: 2 мкл TRAP микс (10x), 1 мкл TS праймера (0,1 мкг), 1 мкл дНТФ (10 мм) и 15 мкл UPW. Для нескольких образцов, умножить вышеупомянутые объемы по количеству образцов, плюс 1.
- Добавить 19 мкл реакционной смеси в каждой реакционной трубе и добавить 1 мкл разбавленного экстракта белка (1 мкг белков) в каждую пробирку для конечного объема 20 мкл.
- Поместите в реакционные трубы 30 ° C предварительно нагретую ванну с водой в течение 45 мин.
4 ПЦР реакции
- Пятнадцать мильн до конца реакции теломеразы, оттепель следующие решения: ACX праймеров, титана Taq буфера, UPW.
- Подготовка ПЦР реакции смесь, добавив следующее в микро-трубки центрифуги: 2,5 мкл Титан Taq буфера (10x), 1 мкл ACX грунтовки (0,1 мкг), 2 мкл UPW (1 мкл, когда IC используется) и 0,5 мкл Титан Taq полимеразы (50x). Для нескольких образцов, умножить вышеупомянутые объемы по количеству образцов плюс 2.
- Добавить 6 мкл ПЦР смешивают в каждую ПЦР-пробирку и добавить весь объем реакции теломеразы (20 мкл) в каждую пробирку для конечного объема 26 мкл.
- Вставьте пробирки для ПЦР к термо циклере ПЦР и выполните следующую программу:
- 90 ° C - 2 мин.
- 94 ° C -. 30 сек *
- 60 ° C -. 30 сек *
- 72 ° C -. 45 сек *
- 72 ° C - 2 мин.
Храните продукты ПЦР при -20 ° C.
* = 34 циклов
5 Агароза Мини-GEл Приготовление, образцы Бег, и гель для окрашивания
- Добавить 25 мл охлажденной буфера электрофореза (КЭ) и мешалку в стакан, который в 2-4 раза объем буферного раствора и медленно посыпать в 1,125 г с высоким разрешением (HR) агарозы порошка в то время как раствор быстро перемешивают . Снимите мешалку, покрыть стакан с пластмассовой оберткой и проколоть в небольшое отверстие для вентиляции. Нагрейте стакан в микроволновой печи на "Low" власти в течение 3 мин, а затем переключиться на "высокий" власть и нагревают раствор в коротких импульсов с осторожностью, чтобы не вызвать разлив. Следует отметить, что, когда пена создается путем нагревания становится крупные пузыри и исчезает через несколько секунд, агарозы готов.
- Литой гель на аппарате с горизонтальной мини-гель, после того, как гель затвердевает при комнатной температуре позволяют гель, чтобы охладить в течение 20 мин при 4 ° С перед использованием.
- Загрузка каждый полосу с 25 мкл образца TRAP (20 мкл ПЦР-продуктов TRAP и 5 мкл 6x гель-загрузочного красителя) и работать на 110 В в течение 3 ч в 4 ° C холодной комнате.
- Подготовка нуклеиновых кислот пятен 3x рабочего раствора путем добавления 15 мкл 10,000x нуклеиновой кислоты, пятно маточного раствора до 50 мл бидистиллированной воды (DDW) с 0,1 М NaCl (0,29 г). Пятно гель в течение 20 мин при осторожном встряхивании.
- Используйте УФ трансиллюминатора с 302 нм длины волны для просмотра полос ДНК TRAP лестницы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экстракты белка клетки были получены из лобной доли (Флорида), ствол мозга (BS) и мозжечка (CR), полученный из 3 CD-1 женского и 3 CD-1 мышей-самцов в возрасте от 1 и 3 месяца для изменение TRAP анализа и 3 CD-1 мышей-самцов в возрасте 2 месяцев для радиоактивных TRAP анализа. Активность теломеразы была обнаружена в 1 мкг белков экстракта с помощью модифицированного TRAP анализа и 2 мкг белки извлечь для радиоактивных TRAP анализа. Обнаружение активности теломеразы в результате радиоактивного TRAP анализа и с помощью модифицированного TRAP анализа показывает, что лучше визуализация и разрешение продукции ДНК теломеразы наблюдается с модифицированным анализа как видно по длительности и интенсивности лестницы ДНК (Рисунок 1А против 1С и 1D). Постепенное снижение продукции ДНК теломеразы наблюдается при уменьшении концентрации белковых экстрактов, полученных из глиобластомы U-251 клеточной линии, был использован suggeжала чувствительности модифицированного метода TRAP анализа для обнаружения теломеразной активности при более низких концентраций белков экстракт (фиг.1В).
Значительно выше активность теломеразы наблюдается в FL и BS регионах по сравнению с ЧР в 3-месячных самок и самцов, как показали по интенсивности полос ДНК и длины изделия ДНК лестнице. Кроме того, было показано, что во время перехода мыши в зрелом возрасте активность теломеразы увеличивается в FL и уменьшается в БС и CR (рисунок 1d). Сравнение между полами показывает, что в теломеразной активности FL выше у женщин, в отличие от БС и CR, показывающие высокую активность теломеразы у мужчин.
В тканях, экспрессирующих низкие уровни активности теломеразы, мы обнаружили, что обнаружение лестницы ДНК с помощью ПЦР является более эффективным без использования внутренний контроль (IC) праймера, так как IC использует ТS как прямого праймера, таким образом, препятствуя усилению фрагментация ДНК. Воспроизводимость данных достигается путем повторения каждого эксперимента несколько раз.
Рисунок 1 Активность теломеразы в мозге мыши: Традиционный против модифицированной TRAP анализа. А) Активность теломеразы в 3 областях мозга проанализированы радиоактивного TRAP анализа (2 месяца CD-1 самцов мышей, 2 мкг белки извлечь). B) Чувствительность модифицированного TRAP анализа показано, уменьшая концентрацию белков экстракта, полученного из глиобластомы U -251 клеточной линии. C, D) Активность теломеразы в 3 мозга регионах 1 (С) и 3 (D) месяцев CD-1 женщины и самцов мышей. лестница ДНК начинается в 50 б.п. полосы с 6 шагом ВР. (NC - отрицательный контроль, IC- внутреннего контроля, BS - ствол мозга, CR - мозжечок, FL - лобная доля).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ активности теломеразы в мозге мыши через ловушку анализа состоит из 4 основных этапа: 1) белков извлечения из конкретных регионов мозговой ткани 2) ИР удлинение праймера по теломеразы - теломераза реакции 3) усиления реакции теломераза продуктов с помощью ПЦР 4 ) разделение продуктов ПЦР с использованием агарозном геле с высоким разрешением.
Это изменение TRAP анализа рассматриваются две главные трудности, которые поднимаются от традиционного анализа: использование радиоактивных дЦТФ для чувствительного обнаружения ПЦР странице продуктов и разделения лестницы ДНК. Высокая агарозном геле разрешение упрощает обнаружение реакции теломераза продукции (ДНК маркера) по сравнению с трудно справиться секвенирования PAGE. Кроме того, окрашивания нуклеиновой кислоты представляет собой нетоксичный раствор с высокой чувствительностью, необходимой для обнаружения небольшого количества ДНК.
Особое внимание следует уделить следующим важных шагов: 1), Поддерживая времени между удалением тканей и гомогенизации до минимума, чтобы сохранить целостность белка 2) CHAPS буфера для лизиса повторное замерзание следует избегать 3) белковые экстракты следует иметь в аликвоты и оттаивают один раз перед использованием. Избегайте повторного замораживания образцов.
Проблемы могут возникнуть на стадии получения геля после высокая концентрация агарозном геле подвержен перелива и требует пристального внимания во время приготовления. Методика имеет ряд ограничений с необходимостью запуска гель в холодной комнате. Кроме того, низкое количество продуктов ПЦР не может рассматриваться в УФ таблице.
Уровень активности теломеразы варьируется в зависимости от различных тканей и, как полагают, с низким содержанием мозга. Этот протокол обеспечивает более чувствительный метод обнаружения, по сравнению с традиционной радиоактивного анализа, позволяющих лучше обнаружение активности теломеразы в мозге. Хотя разные временные эффективные методы доступны (один шаг комплекты TRAP анализов, используя labeleд TS праймер для обнаружения) эти методы значительно дороже. Кроме того, использование агарозы исключает опасность токсического использования полиакриламидном геле.
Как показали от представительных результатов, с помощью описанного выше метода, можно продемонстрировать различия в уровнях активности теломеразы между различными регионами головного мозга и между мужчиной и женщиной. Этот метод может быть использован для обнаружения активности теломеразы в других нормальных тканей с низкой активностью теломеразы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
