Abstract
テロメラーゼ、リボ核タンパク質は、テロメアの長さを維持し、したがって、ゲノムの完全性、増殖および寿命を促進するための責任があります。さらに、テロメラーゼは、酸化ストレスからミトコンドリアを保護し、そのようなニューロンのような非有糸分裂活性の高い細胞の生存のために重要である可能性を示唆し、アポトーシスに対する耐性を付与する。私たちは、以前にさまざまなマウスの脳領域におけるテロメラーゼ活性および発現を増加させ、酸化ストレスからの運動ニューロンの細胞を保護する新規なテロメラーゼ活性剤の能力を実証した。これらの結果は、テロメラーゼは、さまざまな病変からのニューロンの保護に関与しているという考えを強化する。脳内のテロメラーゼの役割を強調するために、ここでは男性と女性のマウス脳におけるテロメラーゼの活性、年齢への依存を比較します。 TRAPアッセイは、さまざまな組織または細胞株においてテロメラーゼ活性を検出するための標準的な方法である。ここでは、ANALYを実証標準的なTRAPアッセイの改変が続くCHAPS溶解緩衝液を用いてタンパク質抽出を非変性によるマウス脳の三つの領域におけるテロメラーゼ活性のSIS。
この2工程アッセイでは、内因性テロメラーゼはTTAGGG 6 bpの反復（テロメラーゼ反応）を添加することにより、特定のテロメラーゼ基質（TSプライマー）を伸長する。テロメラーゼ反応生成物は、6 bpの増分のDNAラダーを作成するPCR反応により増幅される。 DNAラダーの分析は、高感度の核酸染色で染色し、続いて4.5％高分解能アガロースゲル電気泳動によって行われる。
32 Pは、DNAの検出およびDNAラダーを解決するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動のために放射性のdCTPのラベル付け活用する従来のTRAPアッセイと比較すると、このプロトコルは、マウス脳におけるテロメラーゼ活性を評価する能力を実証するためのTRAPアッセイを節約非毒性時間を提供telomerasの相違を検出さまざまな雌雄マウスの脳領域での電子の活動。
Introduction
テロメラーゼは、テロメラーゼからなるリボ核タンパク質逆転写酵素（TERT）、テロメラーゼの触媒サブユニット、およびRNA成分（TERC）である。テロメラーゼの標準的な役割は、ゲノムの完全性を促進するため、テロメア末端に反復配列（TTAGGG）を添加することによりテロメアの適切な長さを維持することであり、細胞増殖1。それはさまざまな損傷剤2により誘導されるアポトーシスに対する耐性を付与する、つまり追加の役割は、細胞内でTERTに起因した、酸化的ストレス3からのヒト間葉系幹細胞を保護し、肯定的なRNAをTIA1するその協会が完全に分化したニューロンにおける生存促進の役割を果たしている顆粒4。
酵素発現および活性レベルは緊密に非分裂細胞5,6で規制されている間TERTは、分裂細胞および癌のほとんどの種類の中で、主に体細胞で発現され、アクティブにされている。研究は、rの中でそれを示しているTERT mRNAが成人期7に低いレベルに維持しながらodent脳は、テロメラーゼ活性は、生後10日目では検出不可能になる。他の研究では、成人のサブ脳室帯、嗅球、海馬内のテロメラーゼ活性を示し、そして大人の小脳および皮質8。 、注射したマウスSOD1トランスジェニックにおける筋萎縮性側索硬化症の発症および進行を遅延 - 私たちは、最近、脳および脊髄におけるテロメラーゼ発現および活性を増加させる新規化合物は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）における神経保護効果を発揮することを実証マウスおよびこれらのマウス9の脊髄における運動ニューロンの生存を増加させた。完全ニューロンおよび脳におけるテロメラーゼの生存促進の役割を理解するためには、脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性の検出のための単純かつ比較的敏感な高速アッセイを開発することが不可欠である。
テロメアREPEAT増幅プロトコール（TRAP）は、テロメラーゼの標準的な活性とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を組み合わせるよく知られた高感度のアッセイである。このアッセイでは、テロメラーゼはTTAGGGがテロメラーゼ基質へのTSリバースプライマー用いて6塩基対（bp）のDNAラダー生成するPCR増幅に続いて（TSプライマー）、オリゴヌクレオチド、繰り返さ付加する。 - ACXを32 P標識dCTPを者が検出するために使用されるPCR産物の量が少ない。 DNAラダーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を配列決定することにより解決される。どちらのDNAバンドの強度とDNAラダーの長さは、活性酵素分子の量とその処理能力はそれぞれ10を反 映している。
この伝統的なアッセイは、いくつかの主要な難しさを保持します（一晩どちらの場合も）シーケンシングPAGEおよびゲル走行時の消費量と放射性製品のフィルム露光を処理するために大規模なハード放射性物質への暴露の危険性。 このプロトコルは、改良された非放射性アガロースミニゲルに基づくアッセイを提供しています。 DNA 6 bpラダーは4.5％高分解能アガロースゲルを用いて解決され、検出は高感度の核酸染色を用いて達成される。高分解能アガロースミニゲルを用いて、敏感な核酸染色アッセイを扱うことは容易提供の組み合わせは、放射能への暴露の危険性を排除し、大幅に数時間から3日全体のアッセイ時間を短縮する。
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Protocol
動物実験は、ベングリオン大学（IL-39-08-2010）における動物実験のための倫理委員会によって承認された。
1マウス脳タンパク質抽出
- 各氷上で5ミリリットルリンゲル液と場所のチューブを含む15ミリリットルの3つのチューブを準備します。
- 頸椎脱臼即時断頭続い10-20秒間 - （化学フードを使う注意）イソフルラン麻酔を使用して、マウスを生け贄に捧げる。
- 頭蓋骨から脳を取り出し、脳組織への損傷を防ぐために、氷冷リンゲル液で数秒間すすぐ。
- 外科用メスを使用して、前頭皮質から小脳（CR）と脳幹（BS）を分離。次に、脳幹から小脳を分離および前頭皮質から前頭葉（FL）をカット。前頭葉から嗅球を削除します。指定された15ミリリットルのチューブに3脳領域を配置します。
- 各チューブ内の組織を均質化する。 FRを追加ESHの氷冷リンゲル液、各チューブは、800×gで7分間、同じボリュームや遠心分離機が含まれています。
- 上清を除去し、各チューブにCHAPS溶解バッファー100μlを加える。 21 Gの針を1mlシリンジに溶液を数回（〜10）を渡すことで、よく混ぜ、そして30分間、氷上でインキュベートする。
- 13000×gで30分間、新しいマイクロ遠心チューブと遠心分離機に各チューブの内容を転送します。新しいマイクロ遠心チューブに上清を移し、以前に確立された方法を用いてタンパク質濃度を決定。 -80℃で10μlの一定分量におけるタンパク質抽出物を保管してください。
2楽器のTRAPアッセイの準備、反応溶液、およびタンパク質希釈の計算
- タンパク質抽出物希釈液とテロメラーゼ反応バッファー用のラベル微量遠心管の適切な数を用意してください。汚染を防ぐためにフィルターチップを使用して、プロトコルのすべてのピペット操作を実行します。 TRAP反応ミックス10倍、TSプライマー、のdNTP、UPWとタンパク質抽出物（試薬および試薬濃度のための材料の表を参照してください）：氷上で以下の手段を解凍する。
- 超純水（UPW）を使用して、を1μg/μlの最終濃度までタンパク質抽出物の溶液を希釈する。
3テロメラーゼ反応
- 2μlのTRAPミックス（10倍）、1μlのTSプライマー（0.1μg）を、1μlのdNTPを（10 mM）をし、15μlの超純水：マイクロ遠心チューブに以下を追加することによって、テロメラーゼ反応ミックスを調製する。複数のサンプルについては、サンプル数、1を加えたことによって、前述のボリュームを掛けます。
- 各反応管に反応ミックス19μLを加え、20μlの最終容量のために各チューブに希釈したタンパク質抽出物を1μl（1μgのタンパク質）を追加します。
- 45分間30℃に予熱した水浴中で反応チューブを配置します。
4 PCR反応
- フィフティーンマイルACXプライマー、チタンのTaqバッファー、UPW：nのテロメラーゼ反応の終了前に、次の解決策を解凍。
- 2.5μlのチタンのTaqバッファー（10倍）、1μlのACXプライマー（0.1μg）を、2μlの（ICが使用されている1μl）を超純水と0.5μlのチタンTaqポリメラーゼ：マイクロ遠心チューブに以下を追加することで、PCR反応ミックスを調製する（50X）。複数のサンプルのために、試料を加えた2の数によって、上記のボリュームを掛けます。
- 各PCRチューブにPCRミックス6μlのを追加し、26μlの最終容量のために各チューブにテロメラーゼ反応（20μL）のボリューム全体を追加します。
- のPCRサーモサイクラーにPCRチューブを挿入し、次のプログラムを実行します。
- 90°C - 2分。
- 94℃ - 30秒*。
- 60℃ - 30秒*。
- 72℃ - 45秒。
- 72℃ - 2分。
-20℃で保存PCR産物。
* = 34サイクル
5。アガロースミニGELの準備、実行サンプル、およびゲル染色
- 25ミリリットルチルド電気泳動バッファー（TBE）と緩衝液の2〜4倍のボリュームであり、ゆっくりと高解像度（HR）アガロースの粉末1.125グラムで溶液が急速に撹拌している間に振りかけるビーカーに攪拌棒を追加します。 。攪拌棒を取り外し、換気のための小さな穴にプラスチック製のラップやピアスを入れたビーカーをカバーしています。 3分間の「低」の電源をマイクロ波中、ビーカーを加熱した後、「ハイ」の電源に切り替え、こぼれる原因にさせないように注意しながら短パルス内の溶液を加熱する。加熱により作成されたフォームが数秒後に大きな気泡となって消滅する際、アガロースの準備ができていることに注意してください。
- ゲルは室温で固化した後、ゲルは、使用前に4℃で20分間冷やしできるように、水平ミニゲル装置にゲルをキャスト。
- TRAPサンプル25μlを（20μlのTRAPのPCR産物と5μlの6×ゲルローディング色素）を各レーンにロードし、11で実行4℃の低温室での3時間0 V。
- 15μlの10,000倍の核酸染色、0.1MのNaCl（0.29グラム）で50mlの再蒸留水（DDW）の原液を添加することにより、ソリューションの作業核酸染色の3倍を準備します。穏やかに振盪しながら20分間ゲルを染色。
- TRAPラダーDNAバンドを表示するには、302 nmの波長のUVトランスイルミネーターを使用してください。
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Representative Results
全細胞タンパク質抽出物の場合は1、3ヶ月の年齢で3 CD-1メスと3 CD-1雄マウスに由来し、前頭葉（フロリダ州）、脳幹（BS）と小脳（CR）から調製した改変されたTRAPアッセイおよび放射性TRAPアッセイの古い2ヶ月歳の時に3 CD-1雄マウス。テロメラーゼ活性は、改変されたTRAPアッセイを用いて抽出物1μgのタンパク質において検出され、2μgのタンパク質は、放射性TRAPアッセイのために抽出した。放射性TRAPアッセイによる、修正TRAPアッセイによるテロメラーゼ活性の検出は、DNAラダー1C 対 （ 図1Aの長さと強さから見たテロメラーゼDNA産物のよりよい可視化および解像度が変更されたアッセイで観察されていることを示しているおよび1D）。膠芽細胞腫U-251細胞系由来のタンパク質抽出物の濃度を減少させる際に、テロメラーゼDNA製品の段階的な減少が観察され、suggeを使用したタンパク質は、低濃度の抽出におけるテロメラーゼ活性の検出（ 図1B）のための修正されたTRAPアッセイ法の感度を刺す。
DNAバンドおよびDNA産物ラダーの長さの強度によって明らかに有意に高いテロメラーゼ活性は、3ヶ月齢の雌および雄においてCRと比較して、FL及びBS領域に見られる。また、フロリダ州の成人のテロメラーゼ活性が増加するに、マウスの遷移中にそれを示し、BSとCR（ 図1D）に減少する。男女間の比較は、FLテロメラーゼ活性に雄に高いテロメラーゼ活性を示すBSとは対照的とCRにおいて、女性の方が高いことを示している。
テロメラーゼ活性の低レベルを発現する組織では、ICは、Tを利用するので、PCRを用いてDNAラダーの検出は、内部対照（IC）プライマーを使用せずに、より効率的であることを見出したSは、フォワードプライマーとしてこのようにDNAラダー増幅を妨害する。データの再現性は、各実験を数回繰り返すことによって達成される。
マウス脳における図1テロメラーゼ活性：変更されたTRAPアッセイに対する伝統。放射性TRAPアッセイ（2カ月齢のCD-1雄マウスは、2μgのタンパク質が抽出）。B）タンパク質の濃度を減少させることによって示されている改変されたTRAPアッセイの感度によって分析3脳領域におけるA）のテロメラーゼ活性は、神経膠芽U由来の抽出図1（C）および図3（D）カ月齢のCD-1雌と雄のマウスの3脳領域における-251細胞株である。C、D）テロメラーゼ活性、DNAラダーは6bpの刻みで50のバンドから始まります。 （NC - ネガティブコントロール、IC-内部統制、BS - 脳幹、CR - 小脳フロリダ州 - 前頭葉）。
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Discussion
TRAPアッセイを介したマウスの脳内のテロメラーゼ活性の分析4の手順で構成されます。脳組織2の特定の領域からの1）タンパク質抽出）テロメラーゼによるTSプライマー伸長 - PCR法4によるテロメラーゼ反応生成物のテロメラーゼ反応3）増幅高分解能アガロースゲルを用いてPCR産物を）分離する。
敏感なPCR産物の検出とDNAラダーのPAGE分離のためのdCTP年代放射性の使用：この修正されたTRAPアッセイは、従来のアッセイから上昇二つの主要な困難に対処しています。高分解能アガロースゲルは、配列決定PAGEを処理するのは難しいと比較してテロメラーゼ反応産物の検出（DNAラダー）を簡素化する。さらに、核酸染色は、少量のDNAを検出するために必要な高感度で非毒性の溶液である。
特別な注意は、次の重要なステップに与えられるべきである：1）タンパク質抽出物をアリコートに保管し、使用前に一度に解凍されるべきである））は、タンパク質の完全性2を維持するために最小限に組織除去及び均質化の間の時間を、溶解緩衝液の再凍結を3避けるべきであるCHAPS保つ。サンプルの再凍結は避けてください。
高濃度のアガロースゲルが波及する傾向があり、調理の際には細心の注意を必要とするので、問題がゲル調製工程の間に発生する可能性があります。技術は低温室でゲルを実行する必要性をいくつかの制限を保持します。また、PCR産物の量が少ないUVテーブル上で閲覧することができない。
テロメラーゼ活性のレベルは、異なる組織間で変化し、脳内で低いと考えられる。このプロトコルは、より高感度の検出法を提供しています、脳内のテロメラーゼ活性の良好な検出を可能にする伝統的な放射性アッセイと比較します。異なる時間効率のよい方法はlabeleを使用して、（1ステップTRAPアッセイキット利用可能であるが、dはTS検出用プライマー）、これらの方法は、かなり高価である。また、アガロースの使用は、ポリアクリルアミドゲルを使用する毒性の危険を排除する。
代表的な結果から明らかなように、上述の方法を用いることにより、脳のさまざまな領域間の雄型と雌型との間のテロメラーゼ活性レベルの差を実証することが可能である。この方法は、低テロメラーゼ活性を有する他の正常組織におけるテロメラーゼ活性の検出に使用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
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