Abstract
La télomérase, une ribonucléoprotéique, est responsable du maintien de la longueur des télomères et donc la promotion de l'intégrité génomique, la prolifération et la durée de vie. En outre, la télomérase protège les mitochondries de stress oxydatif et confère une résistance à l'apoptose, ce qui suggère son importance possible pour le survivant de non-mitotique des cellules hautement actifs tels que les neurones. Nous avons démontré précédemment la possibilité de nouveaux activateurs de la télomérase pour augmenter l'activité de la télomérase et d'expression dans les diverses régions du cerveau de la souris et pour protéger les cellules des neurones moteurs du stress oxydatif. Ces résultats renforcent l'idée que la télomérase est impliqué dans la protection des neurones à partir de diverses lésions. Pour souligner le rôle de la télomérase dans le cerveau, nous comparons ici l'activité de la télomérase dans le cerveau mâle et femelle souris et sa dépendance à l'âge. test TRAP est un procédé standard pour la détection de l'activité de la télomérase dans différents tissus ou lignées cellulaires. Ici, nous démontrons l'analysis de l'activité télomérase dans les trois régions du cerveau de souris non dénaturant par extraction de protéines à l'aide de CHAPS tampon de lyse suivi d'une modification de la méthode TRAP standard.
Dans cet essai, deux étapes, la télomérase endogène s'allonge un substrat spécifique de la télomérase (TS d'amorce) en ajoutant 6 répétitions TTAGGG pb (réaction de télomérase). Les produits de la réaction de télomérase sont amplifiés par réaction de PCR créer une échelle d'ADN de six incréments de pb. L'analyse de l'échelle de l'ADN est effectué par 4,5% en haute résolution électrophorèse sur gel d'agarose suivie par une coloration avec très sensible aux taches d'acide nucléique.
Par rapport à la méthode TRAP traditionnels qui utilisent marqué au 32P radioactif dCTP de la détection de l'ADN et de polyacrylamide électrophorèse sur gel de résolution de l'échelle de l'ADN, ce protocole offre un gain de test TRAP pour évaluer l'activité de la télomérase dans le cerveau de la souris, ce qui démontre la capacité de temps de non-toxique détecter des différences dans telomerasl'activité dans les différents e région du cerveau de la souris mâle et femelle.
Introduction
La télomérase est une ribonucléoprotéine composé de télomérase transcriptase inverse (TERT), la sous-unité catalytique de la télomérase, et un composant d'ARN (TERC). Le rôle canonique de la télomérase est de préserver la bonne longueur des télomères en ajoutant des séquences répétitives (TTAGGG) aux extrémités télomériques, favorisant ainsi l'intégrité du génome, et une prolifération cellulaire. Autres rôles ont été attribués à TERT dans les cellules, c'est à dire qu'il confère une résistance à l'apoptose induite par divers agent endommageant 2, protège les cellules souches mésenchymateuses humaines du stress oxydatif 3, et joue un rôle pro-survie dans les neurones complètement différenciées par son association à TIA1 ARN positif 4 granules.
TERT et est exprimé principalement actif dans les cellules somatiques et de division dans la plupart des types de cancers, alors que les niveaux d'expression et l'activité enzymatique sont étroitement régulés dans les cellules ne se divisant pas 5,6. Des études ont montré que dans le rcerveau Odent, l'activité de la télomérase devient indétectable par jour postnatal 10, tandis que TERT ARNm est maintenue à des niveaux inférieurs à l'âge adulte 7. D'autres études ont démontré l'activité télomérase à l'intérieur de la zone sous-ventriculaire adulte, le bulbe olfactif, l'hippocampe et dans le cervelet et le cortex adulte 8. Nous avons récemment démontré que les nouveaux composés qui augmentent l'expression et l'activité de la télomérase dans le cerveau et la moelle épinière des cordons exercent des effets neuroprotecteurs de la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) - souris injectées, ont retardé l'apparition et la progression de la maladie de sclérose latérale amyotrophique dans SOD1 transgénique souris et augmente la survie des motoneurones dans la moelle épinière de ces souris 9. Pour bien comprendre le rôle pro-survie de la télomérase dans les neurones et dans le cerveau, il est essentiel de développer un test rapide simple et relativement sensible pour la détection de l'activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau.
Le télomérique rprotocole d'amplification épéter (TRAP) est un essai sensible bien connu combinant l'activité de la télomérase canonique et la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Dans cet essai, la télomérase ajoute TTAGGG répète sur un substrat de la télomérase (TS amorce) oligonucléotide, suivie d'une amplification PCR qui génère des 6 paires de bases (pb) échelle d'ADN à l'aide du TS amorce inverse -. ACX marqué au 32P dCTP son sont utilisés pour détecter le faible quantité de produits de PCR. L'échelle d'ADN est résolu par électrophorèse sur gel de séquençage de Polyacrylamide (PAGE). Tant l'intensité des bandes d'ADN et la longueur de l'échelle d'ADN reflètent la quantité de molécules d'enzymes actives et leur aptitude à la maturation, respectivement 10.
Cette analyse traditionnelle détient des difficultés majeures: Le danger de l'exposition à des substances radioactives, de grandes et difficiles à gérer séquençage PAGE et la consommation de temps de gel fonctionnement et l'exposition du film du produit radioactif (nuit dans les deux cas). Ce protocole offre un test d'agarose non radioactif amélioration mini-gel à base. Le pb échelle ADN 6 est résolu en utilisant un gel à 4,5% d'agarose à haute résolution et la détection est réalisée en utilisant très sensible aux taches d'acide nucléique. La combinaison de l'utilisation à haute résolution d'agarose des mini-gel et sensible aux taches d'acide nucléique propose dosage facile à manipuler, permet d'éliminer le risque d'exposition à la radioactivité et de raccourcir considérablement la durée totale de l'essai de 3 jours à plusieurs heures.
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Protocol
Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité d'éthique pour l'expérimentation animale dans l'Université Ben Gourion (IL-39-08-2010).
Extraction de la protéine 1 de cerveau de souris
- Préparer 3 tubes de 15 ml contenant chacun 5 ml de solution et placer les tubes Ringer sur la glace.
- Sacrifier la souris en utilisant l'isoflurane (ATTENTION - utiliser hotte chimique) pendant 10-20 sec suivie par dislocation cervicale et décapitation immédiate.
- Retirez le cerveau du crâne et de rincer pendant quelques secondes avec la solution de Ringer glacée pour éviter d'endommager les tissus du cerveau.
- L'utilisation d'une lame chirurgicale, séparer le cervelet (CR) et le tronc cérébral (BS) à partir du cortex frontal. Ensuite, séparer le cervelet du tronc cérébral et couper le lobe frontal (FL) du cortex frontal; supprimer le bulbe olfactif du lobe frontal. Placez les régions 3 du cerveau dans les désignés tubes de 15 ml.
- Homogénéiser le tissu dans chaque tube. Ajouter frsolution glace chair froide Ringer sorte que chaque tube contient le même volume et centrifuger pendant 7 minutes à 800 x g.
- Eliminer le surnageant et ajouter 100 ul de tampon de lyse CHAPS à chaque tube. Bien mélanger, en faisant passer plusieurs fois la solution (~ 10) à travers une seringue de 1 ml avec une aiguille 21 G, et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Transférer le contenu de chaque tube dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse et centrifuger pendant 30 min à 13 000 x g. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse et déterminer la concentration de protéine en utilisant un procédé précédemment établi. Conserver les extraits de protéines dans des aliquotes de 10 pi à -80 ° C.
2. TRAP Essai Préparation des instruments, des solutions de réaction, et de protéines calculs de dilution
- Préparer nombre approprié de tubes de micro-centrifugation de protéines marquées pour des dilutions de l'extrait et du tampon de réaction de télomérase. Effectuer toutes pipetage dans le protocole à l'aide des conseils de filtrage pour éviter la contamination. Décongeler les solutions suivantes sur glace: TRAP mélange réactionnel 10x, TS primaire, dNTP, extraits UPW et de protéines (voir tableau des matériaux pour les réactifs et réactifs concentrations).
- Diluer la solution de l'extrait de protéine à une concentration finale de 1 ug / ul avec de l'eau ultra-pure (UPW).
3. télomérase Réaction
- Préparer la télomérase mélange réactionnel en ajoutant ce qui suit à un tube de micro-centrifugeuse: 2 pl TRAP mélange (10x), 1 pl TS primaire (0,1 ug), 1 dNTP pi (10 mm) et 15 pi UPW. Pour de multiples échantillons, multiplier les volumes mentionnés ci-dessus par le nombre d'échantillons, plus 1.
- Ajouter 19 ul du mélange réactionnel dans chaque tube de réaction et ajouter 1 pl de l'extrait de protéine diluée (1 mg de protéines) à chaque tube pour un volume final de 20 ul.
- Placer les tubes de réaction dans un bain d'eau préchauffé à 30 ° C pendant 45 min.
4 La réaction PCR
- Quinze kmn avant la fin de la réaction de la télomérase, dégeler les solutions suivantes: ACX amorces, Titanium Taq tampons, UPW.
- Préparer mélange réactionnel de PCR en ajoutant ce qui suit à un tube de micro-centrifugeuse: 2,5 pi titane Taq Buffer (10x), 1 pl ACX primaire (0,1 ug), 2 pl UPW (1 pi quand IC est utilisé) et 0,5 ul titane Taq polymérase (50x). Pour de multiples échantillons, multiplier les volumes mentionnés ci-dessus par le nombre d'échantillons plus 2.
- Ajouter 6 ul du mélange PCR dans chaque tube PCR et ajouter la totalité du volume de la réaction télomérase (20 pi) dans chaque tube pour un volume final de 26 ul.
- Insérez les tubes PCR à un thermo cycleur PCR et exécuter le programme suivant:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sec *
- 60 ° C -. 30 sec *
- 72 ° C -. 45 sec *
- 72 ° C - 2 min.
Magasin de produits PCR à -20 ° C.
* = 34 cycles
5 Agarose Mini-gel Préparation, échantillons Courir, et Gel coloration
- Ajouter 25 ml de tampon d'électrophorèse frais (TBE) et une barre d'agitation dans un bécher qui est 2-4 fois le volume de la solution tampon et saupoudrer lentement 1,125 g de la haute résolution (HR) de poudre d'agarose alors que la solution est rapidement agité . Retirez la barre d'agitation, couvrir le bécher avec un film plastique et percer dans un petit trou pour la ventilation. Chauffer le bécher dans le micro-ondes à puissance "Low" pendant 3 minutes, puis passer à la puissance "High" et chauffer la solution à impulsions courtes avec soin de ne pas causer de renverser. Notez que lorsque la mousse créée par chauffage devient grosses bulles et disparaît après quelques secondes, l'agarose est prêt.
- Couler le gel dans un appareil mini-gel horizontal, après que le gel se solidifie à température ambiante, le gel permet de refroidir pendant 20 min à 4 ° C avant utilisation.
- Chargez chaque voie avec 25 ul d'échantillon de TRAP (produits de PCR TRAP 20 pi et 5 pi 6x colorant gel-chargement) et de fonctionner à 110 V pendant 3 heures dans un 4 ° C chambre froide.
- Préparer nucléiques 3x tache d'acide solution de travail en ajoutant 15 pl 10.000 fois acide nucléique tache, solution stock à 50 ml Double Eau distillée (DDW) avec 0,1 M de NaCl (0,29 g). Colorer le gel pendant 20 min en remuant doucement.
- Utilisez transilluminateur UV avec 302 nm de longueur d'onde pour afficher les bandes d'ADN TRAP échelle.
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Representative Results
Des extraits protéiques de cellules entières ont été préparés à partir du lobe frontal (FL), le tronc cérébral (BS) et le cervelet (CR), dérivé de la femelle et 3 souris CD-1 mâles de 3 1 CD aux âges de 1 et 3 mois pour l' test TRAP modifié et 3 souris CD-1 mâles à l'âge de 2 mois pour le test TRAP radioactifs. L'activité de télomérase a été détectée dans une ug de protéines extrait en utilisant le test TRAP à jour et 2 mg de protéines pour extraire le test TRAP radioactif. Détection de l'activité de la télomérase par le test TRAP radioactifs et par le test TRAP modifié montre qu'une meilleure visualisation et la résolution des produits d'ADN de la télomérase est observée avec le test modifié comme on le voit par la durée et l'intensité de l'échelle d'ADN (Figure 1A par rapport à 1C et 1D). Une diminution progressive des produits d'ADN de la télomérase est observée lors de la diminution des concentrations d'extraits de protéine, les dérivés de la lignée cellulaire de glioblastome U-251, a été utilisé suggepiquer la sensibilité de la méthode de test TRAP modifié pour la détection de l'activité télomérase à des concentrations plus faibles de protéines extrait (figure 1B).
Une activité télomérase est significativement plus élevée observée dans les régions de Floride et par rapport à la BS CR âgés de 3 mois dans les femelles et les mâles comme révélé par l'intensité des bandes d'ADN et la longueur de l'échelle des produits d'ADN. En outre, il est montré que lors de la transition de la souris dans l'activité télomérase à l'âge adulte augmentation de la Floride et diminue dans la BS et CR (Figure 1D). La comparaison entre les sexes démontre que l'activité de la télomérase FL est élevée chez les femmes à la différence de la BS et CR présentant une activité télomérase élevée chez les mâles.
Dans les tissus qui expriment de faibles niveaux d'activité de la télomérase, nous avons découvert que la détection de l'échelle de l'ADN en utilisant une PCR est plus efficace sans utiliser le contrôle interne (CI) d'amorce, depuis le circuit intégré utilise la TS comme une amorce sens interférant ainsi avec l'amplification de l'échelle de l'ADN. La reproductibilité des données est obtenue en répétant plusieurs fois l'expérience.
Figure 1: L'activité de télomérase dans le cerveau de la souris: traditionnel contre test TRAP modifié. A) L'activité de télomérase dans les trois régions du cerveau analysé par radioactif test TRAP (2 mois souris CD-1 mâles, 2 ug de protéines extrait). B) Sensibilité de la méthode TRAP modifié est représenté par une diminution des concentrations des protéines extrait dérivé de glioblastome U -251 lignée cellulaire. C, D) l'activité de la télomérase dans 3 régions du cerveau de 1 (mois vieux CD-1 femelles et les souris mâles C) et 3 (D). L'échelle de l'ADN commence à la bande de 50 pb avec 6 tranches de pb. (NC - témoin négatif, IC contrôle interne, BS - tronc cérébral, CR - cervelet, FL - lobe frontal).
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Discussion
Analyse de l'activité de la télomérase dans le cerveau de la souris par le test TRAP est constitué de quatre étapes principales: 1) l'extraction des protéines à partir de régions spécifiques du tissu cérébral 2) TS élongation d'amorce par la télomérase - réaction télomérase 3) l'amplification des produits de la réaction de télomérase par PCR 4 ) séparation des produits de PCR en utilisant un gel d'agarose de haute résolution.
Ce test TRAP modifié répond à deux grandes difficultés qui surgissent de l'analyse traditionnelle: l'utilisation de dCTP radioactives de la détection sensible de la PCR produits et PAGE séparation de l'échelle d'ADN. Gel d'agarose à haute résolution simplifie la détection des produits de la réaction télomérase (l'échelle de l'ADN) par rapport au disque à traiter séquençage PAGE. De plus, la coloration d'acide nucléique est une solution non-toxique avec une grande sensibilité nécessaire pour la détection d'une petite quantité d'ADN.
Une attention particulière devrait être accordée aux étapes critiques suivantes: 1) En gardant le temps entre le prélèvement de tissus et d'homogénéisation au minimum pour préserver l'intégrité de la protéine 2) Chaps lyse regel tampon doit être évitée 3) extraits de protéines doivent être conservés dans des aliquotes et décongelés une fois avant utilisation. Ne pas recongeler des échantillons.
Des problèmes peuvent survenir lors de l'étape de préparation du gel depuis gel d'agarose à forte concentration est sujette à débordement et nécessite une attention particulière lors de la cuisson. La technique contient plusieurs limites de la nécessité d'exécuter le gel dans une chambre froide. En outre, la faible quantité de produits de PCR ne peut pas être visualisé sur une table UV.
Le niveau d'activité télomérase varie selon les différents tissus et est considérée comme faible dans le cerveau. Ce protocole offre un procédé de détection plus sensible, à comparer le dosage radioactif classique permettant une meilleure détection de l'activité de la télomérase dans le cerveau. Bien que différentes méthodes de temps-efficace sont disponibles (une étape kits de dosage de TRAP, en utilisant un labeled amorce pour la détection TS), ces méthodes sont beaucoup plus coûteux. De plus, l'utilisation d'agarose élimine le risque de toxicité de l'utilisation de gel de polyacrylamide.
Comme l'ont révélé des résultats représentatifs, en utilisant le procédé décrit ci-dessus, il est possible de mettre en évidence les différences dans les niveaux d'activité de la télomérase entre les diverses régions du cerveau et entre mâles et femelles. Cette méthode peut être utilisée pour la détection de l'activité de la télomérase dans les autres tissus normaux avec une faible activité de la télomérase.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
