Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Abstract

Synaptischen Übertragung ist ein extrem schnelles Verfahren. Aktionspotential angetrieben Einstrom von Ca ^{2 +} in den präsynaptischen Terminal durch spannungsabhängige Kalziumkanäle (VGCCs) in der Trennfläche Membran befindet, ist der Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern. Entscheidend für die Schnelligkeit der synaptischen Übertragung ist die räumliche und zeitliche Synchronität zwischen der Ankunft des Aktionspotentials, VGCCs und der Neurotransmitter-Freisetzung Maschinen. Die Möglichkeit, direkt aufzeichnen Ca2 ⁺ Ströme von der Trennfläche Membran der einzelnen präsynaptischen ist zwingend notwendig für eine genaue Verständnis der Beziehung zwischen präsynaptischen Ca2 ⁺ und die Freisetzung von Neurotransmittern. Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche für elektrophysiologische Aufzeichnung ist nicht verfügbar in den meisten Präparaten und präsynaptischen Ca2 ^+-Eintrag wurde mit bildgebenden Techniken und makroskopischen Strom MeasureMe gekennzeichnetNTS - Techniken, die nicht über ausreichende zeitliche Auflösung zu Ca ^{2 +-Eintrag} zu visualisieren. Die Charakterisierung der VGCCs direkt an einzelnen präsynaptischen war nicht in zentralen Synapsen möglich und wurde bisher erfolgreich nur in der Kelch-Typ-Synapse des Kükens Ciliarganglion und in Ratten Kelche erreicht. Wir haben erfolgreich in der Riesensynapse retikulospinale der Neunauge Rückenmark durch die Entwicklung einer akut dissoziierten Vorbereitung des Rückenmarks, die isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen frei von postsynaptischen Strukturen ergibt adressiert dieses Problem. Wir können fluoreszenzkennzeichnen und zu identifizieren einzelnen präsynaptischen und Ziel sie für die Aufnahme. Mit dieser Vorbereitung, wir haben VGCCs direkt an der Trennfläche der einzelnen präsynaptischen Enden mittels Immunhistochemie und Elektro Ansätze aus. Ca ^{2 +} Ströme wurden direkt an der Trennfläche Membran o aufgezeichnetf einzelnen präsynaptischen Terminals, die erste derartige Aufnahme an zentralen Synapsen durchgeführt werden.

Introduction

Synaptischen Übertragung ist eine extrem schnelle und präzise Prozess. Aktionspotential Invasion der präsynaptischen Terminal führt zum Öffnen VGCCs in der Trennfläche Membran, die daraus resultierende Erhöhung der präsynaptischen Ca2 ⁺ als Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern ¹ wirkenden entfernt. Alle diese Schritte werden innerhalb von hundert Mikrosekunden ^2, und erfordern daher enge räumliche Kopplung von VGCCs auf die Fusion von Vesikeln Maschinen ^3. Präsynaptischen Ca2 ⁺ Flüsse wurden in erster Linie durch bildgebende Ansätze mit Ca2 ^+-sensitiven Farbstoffen ⁴ gekennzeichnet. Einbau Ca ^{2 +-Puffer,} die Ca ^{2 +} modulieren präsynaptischen Neuronen wurde verwendet, um indirekt zu charakterisieren, die die Beziehung zwischen präsynaptischen Calcium und Neurotransmission ^3. Darüber hinaus Modulation der präsynaptischen Ca2 ^{+-Konzentration} frei von Uncaging Ca ^{2 + 5} oder Aufnahme macroscopic Ca ^{2 +} Strömungen in Verbindung mit Maßnahmen der Fusion von Vesikeln und / oder Freisetzung verwendet; wie Kapazitätsmessungen ⁶ oder postsynaptischen Antworten ^2, um die gleiche Frage anzugehen. Allerdings Charakterisierung Ca2 ⁺ Ströme direkt an der Trennfläche, die Fachgruppe der präsynaptischen Membran, wo Depolarisation der Membran ist in Ca ^{2 +} übersetzt Ströme Auslösung synaptischen Vesikel Fusion und Freisetzung von Neurotransmittern, ist integraler Bestandteil erhalten eine genaue Messung der Ca ^{2 +} Voraussetzung für die synaptischen Vesikel Fusion. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, direkt zu charakterisieren Ca2 ⁺ Ströme an einzelnen präsynaptischen Enden, verbunden mit genauen gleichzeitige Messungen Vesikelverschmelzung und Freisetzung ermöglicht eine genaue Erläuterung der zeitlichen Beziehung zwischen dem Zeitverlauf des Aktionspotentials, präsynaptischen Ca ^{2 +} Strom, Fusion von Vesikeln und loslassen. Zugriff auf die Trennfläche Membranist nicht in der Mehrheit der präsynaptischen Enden durch Anlagerung von den postsynaptischen Dendriten zu schließen. Diese Unzugänglichkeit ist ein großes Hindernis bei der Charakterisierung von VGCCs, da es verhindert, dass direkte Messungen von Strom an einzelnen präsynaptischen Terminals. Direkte Charakterisierung der präsynaptischen Ca2 ⁺ Ströme bei einzelnen präsynaptischen bisher nicht im Zentrum von Synapsen möglich und wurde nur in zwei Kelchtyp präsynaptischen erreicht worden; Kelch-Typ-Synapse der Küken Ciliarganglion ^7-10 und Ratten Kelche ^11,12. In allen anderen präsynaptischen einschließlich der riesigen retikulospinale Synapse in der Neunauge Rückenmark ^13, hat der Mangel an Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche die Verwendung der indirekten Ansätze notwendig, wie Ca ^{2 +-Bildgebung} zu präsynaptischen Ca2 ⁺ Flüsse zu studieren.

Abbildung 1. Neunauge Riesen retikulospinale Synapse. (A) Querschnitt von Neunauge Rückenmark zeigt dorso-ventralen Ausrichtung. Retikulospinale Axone sind mit grünen Stern markiert. (B) 3-D-Rekonstruktion des retikulospinale Synapse im Rückenmark, die Neunauge präsynaptischen Axon retikulospinale machen zahlreiche en passant Kontakte (durch grüne Pfeile markiert) auf der postsynaptischen Neuron ^13. Präsynaptischen Terminals wurden mit Alexa Fluor 488 Hydrazid Phalloidin (grün) markiert worden, während der postsynaptischen Neuron mit Alexa Fluor 568 Hydrazid (rot) gefüllt wurde.

Neunauge Riesen retikulospinale Axone, in der ventralen Region des Rückenmarks parallel zur rostral-kaudale Achse 1a, Form mehrerer en passant synaptische Kontakte liegt auf Neuronen desVorderhorn des Rücken ¹⁴ 1b ^13. Makroskopischen Ganzzell Ca2 ⁺ Ströme wurden von retikulospinale Axone im Rückenmark intakt ^13,15 aufgezeichnet. Allerdings vorherigen Blindversuche direkte Messung von Ca2 ⁺ Ströme in retikulospinale Axone im Rückenmark intakt Neunauge mit Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik erfolglos ¹³ aufgrund fehlender Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche durch den gegenüberliegenden postsynaptischen Prozesse bewährt Abbildung 1b. Die Trennfläche Membran zuvor zugänglich durch Entfernen der postsynaptischen Neuron ^11, mechanische Störung des Synapse vor der Aufzeichnung ¹² oder enzymatische Behandlung in Verbindung mit mechanischer Dissoziation ¹⁶ hergestellt. Angesichts der komplexen Organisation des Rückenmarks, kann es äußerst schwierig sein würde, die postsynaptischen Neuron identifizieren und zurückgezogen werden mechanisch oder stören the Synapse. Daher haben wir beschlossen, enzymatische Behandlung ^17, gefolgt von mechanischen Dissoziation zu verwenden.

Mit diesem Ansatz haben wir eine akut dissoziierten Vorbereitung der Neunauge Rückenmark, das lebensfähig isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen ohne jegliche postsynaptischen Prozesse ergibt entwickelt, wodurch eine uneingeschränkte Zugriff auf die einzelnen präsynaptischen Terminals. In Verbindung mit einem Standard-Umkehrmikroskop und Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht es uns zu erkennen und gezielt einzelne fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminals, mit einer Patch-Pipette, die eine Aufzeichnungslösung, die Ca ^{2 +} Ströme 4c und 4d-Isolate, für die Aufnahme mit zell angebracht Voltage-Clamp-Technik. Ca ^{2 +} Ströme wurden direkt an der präsynaptischen Membran Trennfläche der einzelnen präsynaptischen 4f aufgezeichnet. Dies ist eine significaNT im Bereich der synaptischen Übertragung Durchbruch, da es die erste derartige Aufnahme bei zentralen Synapsen durchgeführt werden soll.

Protocol

1. Herstellung von Poly-D-Lysin-Hydrobromid

1. Vorbereitung 1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid in 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5).
2. Aliquoten und bei -20 ° C.

2. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser

Hinweis: Führen Sie alle Reinigungs und Beschichtungsschritte in einer laminaren Strömungskammer.

1. Deck Ort in eine Petrischale mit 1 N Salzsäure (HCl) für 2 Stunden.
2. Saugen Sie alle HCl und spülen mit 70% Ethanol (EtOH) 2-3 x.
3. Lassen Sie in 70% EtOH für 1 Stunde.
4. Saugen Sie alle 70% EtOH und spülen Sie mit 100% EtOH 2-3x.
5. Lassen Sie in 100% EtOH für 2 Stunden. Saugen Sie alle EtOH.
6. Trocken tupfen und mit Filterpapier an der Luft trocknen für ein paar Sekunden.
7. Ort O / N auf 1 mg / ml Poly-Lysin-Lösung.
8. Spülen Deckgläser nächsten Tag mit Millipore-Wasser 4-5x.
9. Luft trocknen Poly-Lysin beschichtete Deckgläser auf Glasrollen in einer sauberen Petrischale.
10. Für immunohistochemistry, verwenden 35 x 10 mm Petrischale Deckel. Bereiten Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) ausgekleidet Gerichte durch Gießen PDMS (Elastomer und Härter 10: 1 nach Gewicht) in die Schüssel zu einer Dicke von 0,3 cm und lassen bei 30 ° CO / N eingestellt. Sobald dies eingestellt, schneiden Sie ein 2 cm x 1 cm in die PDMS eingelassen. Sauber und Beschichtung der Einsatz mit Poly-Lysin folgenden wie oben erwähnt für Deck die gleichen Schritte.
11. Shop poly-Lysin beschichtete Deckgläser und Geschirr in der Laminar-Flow-Kammer bedeckt bis zur Verwendung (bis zu 2 Wochen, aber erzielen beste Ergebnisse Klebstoff durch die Vorbereitung regelmäßig alle 3-4 Tage).
12. Bereiten Sie eine PDMS-Block, der in der vibrierenden Gewebe Slicer Pin das Rückenmark. Mischung Elastomer A und Elastomer B 1: 1 beträgt. Gießen Sie in einer 100 x 15 mm Petrischale und lassen Sie O / N bei 30 ° C eingestellt. Schneiden Sie ein rechteckiges Stück der PMDS und kleben Sie es auf die Schneidegrundplatte mit Epoxy-Kleber. Lassen Sie den Kleber zur Festsetzung der PDMS in Kraft gesetzt und in Scheiben schneiden mehrere dünne Schnitte von der Oberfläche eine Wohnung zu erhaltenOberfläche, um das Gewebe zu fixieren.

3. Akute Dissoziation von Neunauge Rückenmark zu Isolierte retikulospinale Axone Ausbeute

1. Betäuben eine ammoecoete oder Erwachsener Neunauge (Petromyzon marinus) mit Tricaine Methansulfonats (MS-222; 100 mg / L). Narkose hinzufügen in das Wasser, in einen Plastikbecher mit einem Deckel abgedeckt, die das Neunauge geopfert werden.
2. Enthaupten Neunauge in kaltem (4 ° C) Ringer-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mm): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl _2, 1,8 MgCl _2, 4 HEPES, 4 Dextrose (pH-Wert 7,6, die Osmolarität 270 mOsm) und nehmen Körper Wandmuskulatur Rückenfläche des Rückenmarks aus.
3. Hirnhaut entfernen Primitiva von der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks mit einer feinen Pinzette. Sie ventralen Hirnhaut Primitiva in diesem Stadium nicht entfernen.
4. Geschnitten Rückenmark in 1 cm lange Stücke schneiden.
5. PIN eines Rückenmarkstück mit feinen Insektenstifte, dorsale Seite nach oben, auf ein PDMS ausgekleidet Schneiden BODENPLAte (siehe 2.12) in einer vibrierenden Gewebe Schneidemaschine Kammer mit eiskalter Ringer-Lösung.
6. Entfernen eines zentralen Abschnitts der dorsalen Säule des Rückenmarks durch Schneiden entlang der rostro-kaudalen Achse mit der Klinge, hinter intakte Rückenstützenabschnitte am rostralen und kaudalen Enden dienen als während der Dissoziation 2a und 2b behandelt. Verwenden langsamste Geschwindigkeit Einstellung, die das Schneiden und eine Tiefeneinstellung, die nur die dorsalen Säule Verlassen des zugrunde liegenden retikulospinale Axon Spalte unbeschädigt entfernt 2b ermöglicht.
7. Inkubieren Scheiben geschnitten Rückenmark Stücke bei RT für 45 min in einem Cocktail von 1 mg / ml Protease (Typ XIV aus Streptomyces griseus) und 1 mg / ml Kollagenase in Ringer-Lösung (Typ IA aus Clostridium histolyticum) (aus El Manira & Bussières angepasst 1997 17).
8. Pin Enzym-behandelten Rückenmark Stücke mit feinen Nadeln in einem PDMS ausgekleidet Petrischale Containing Kälte (4 ° C) Ringer-Lösung.
9. Ventralen Hirnhaut entfernen Primitiva mit feinen Pinzette.
10. Geschnitten seitlichen Flächen des Rückenmarks mit einem Skalpell in der Mitte des geschnittenen Rückenabschnitt Verlassen der Mittelsäule retikulospinale Axone intakt in das Rückenmark 2d.
11. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf dem Objektiv.
12. Legen Sie die Poly-Lysin beschichtete Deckglas (3a, Oberteil, rotes Rechteck) in den Schlitz der Aufnahmekammer 3 und Vakuum Fett auf alle Kanten (Raum zwischen roten und blauen Rechtecke in 3a, um eine Dichtung zu erleichtern. Schraube die oben einrasten. Setzen Sie die Kammer in dem Einsatz auf der Aufzeichnungs rig.
13. Hinzufügen Ringer-Lösung in die Aufzeichnungskammer unter Verwendung einer Pasteurpipette.
14. Schließen Sie den Abfluss Schlauch der Druckflasche mit Frostschutzmittel in die thermoelektrische Kühlvorrichtung Eingangsschlauch. Schließen Sie den Ausgut Schlauch der thermoelektrischen Kühlvorrichtung mit dem Eingangsende des Außenkühlmantel und dem Ausgangsende zu dem Reservoir 3b.
15. Legen Sie ein Stück des Rückenmarks zu einer Zeit, in der Aufnahme Kammer und sanft trennen das Rückenmark Aufrechterhaltung es entlang der Deckglas zu allen Zeiten mit Teflon beschichtet Pinzette bis Axone isoliert 2e und 2f.
16. Bringen des Aufzeichnungslösungstemperatur auf 10 ° C durch Leiten des unter Druck (Stickstoffgas in die Flasche geschoben) Frostschutzmittellösung (durch Verschiebung), über die thermoelektrische Kühlvorrichtung, durch die äußere Kühlmantel der Aufnahmekammer 3b.
17. Ermöglichen Axone für 1 h nach der Dissoziation bei 10 ° C erholen.

(A) Entfernung von dorsalen Säule. Der Pfeil zeigt die Richtung des Schneidens des Gewebes. Die Rückenwirbel werden durch das Alphabet D (red Schriftfarbe) gekennzeichnet, während die ventralen Hörnern des Alphabets V (roter Schrift Farbe). (B) dorsalen Säule in dem zentralen Abschnitt des Rückenmarks Aussetzen der retikulospinale Axone entfernt (grüne Linien ). Die ventralen Hörner, die nach dem Schneiden Prozess intakt bleiben, werden durch das Alphabet V (rot Schriftfarbe) gekennzeichnet. (C) 45 min Behandlung mit Protease und Kollagenase Enzymen Cocktail (1 mg / ml). (D) Schneiden von Seitenbahnen des Rückenmarks; die die Position, Richtung und Ausmaß der seitlichen Schnitt. (e) mechanische Dissoziation des Rückenmarks. Pfeile zeigen Position der Zange und die Richtung der Trennkraft während Dissoziation. (F) Vertreve Beispiel dissoziiert retikulospinale Axon Vorbereitung. Grüne Pfeile markieren Bereiche mit akut dissoziiert retikulospinale Axone ohne postsynaptischen Prozesse.

Abbildung 3. Schematische Darstellung der Aufnahme Kammer für die Elektrophysiologie Experimente. Maße vorgesehenen Zoll. In basepiece Diagramm (a) gezeigt rote Rechteck zeigt Positionierung des Deckglases in dem Deckglas Nut in der basepiece. Der Bereich zwischen der roten und blauen Rechteck, in dem basepiece Diagramm (a) gezeigt ist, wo die Hochvakuumfett angewendet wird. (B) zeigt die Aufnahme Kammer montiert.

4. Kennzeichnung und Identifizierung von präsynaptischen Enden mit FM 1-43

1. Beschriften Sie präsynaptischen Terminals, durch den Einbau von FM 1-43 in vesicles während der synaptischen exo-Endozytose in der Hoch K + Depolarisation. Perfundieren Vorbereitung mit 5 uM FM 1-43 (in 5 ml Ringer-Lösung, die 30 mM KCl).
2. Perfusion Präparat mit 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml Ringer-Lösung), um überschüssigen Farbstoff FM) ¹⁸ zu entfernen.
3. Perfusion Zubereitung mit Ringerlösung für 15 Minuten, um jede Remant Farbstoff und dem Advasep auszuwaschen.
4. Bild mit 100 × Ölimmersionsobjektiv (NA 1,25) an einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, in Verbindung mit einer digitalen CCD-Kamera und Bildaufnahme-Software Mikromanager unter Verwendung von Standardfluoreszenzbildgebungsprotokolle.
5. Identifizieren fluoreszenzmarkierten präsynaptischen Enden für die Aufnahme 4c und 4d Ziel.

5. Immunhistochemie von isolierten retikulospinale Axone

1. Füllen Gericht Einsatz (Protokoll Abschnitt 2.10.) Mit zweiwertigen Ionen (Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} kostenlosRinger-Lösung.
2. Fertigen Patch-Pipetten in einem P-87-Mikropipette Puller. Legen Sie eine kleine Menge von Nahtkleber an einem Ende des Poly-Lysin-Einschub mit einer Patch-Pipette (1,5 mm Durchmesser Glasaußen) und Absaugung (mit einem Silikonschlauch 0,89 mm Innendurchmesser mit einer Mikropipette Spitze an der Ansaugseite beigefügt).
3. Führen Sie Dissoziationen mit dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 3 Protokoll 2 erwähnt. Platzieren Sie ein Ende des Rückenmarks auf der Naht Kleber und drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette, um sie stark an der Oberfläche haftet. Legen Sie einen Tropfen Leim Naht am anderen Ende des Einsatzes und sanft dehnen das Rückenmark bis Axone dissoziiert sind und sich die freie Ende des Rückenmarks, indem Sie sie vorsichtig über die Nahtkleber. Fixieren durch sanftes Herunterdrücken mit der Zange.
4. Austausch zweiwertigen Ringerlösung mit regelmäßigen Ringer-Lösung durch Perfusion.
5. Axone erlauben, für 20 min nach dissoc erholeniation bei 10 ° C aufweist.
6. Fix dissoziiert Axone in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min {in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na ₂ HPO ₄ 10 KH ₂ PO ₄ 1,8, pH 7,4) hergestellt}. Filtern PFA Lösung vor, indem sie durch einen 0,2 um-Spritzenfilter verwenden.
7. Auswaschen der PFA durch Perfusion 0,1 M Glycin (in PBS) für 10 min.
8. Inkubieren in 0,1% Triton-X (in PBS) für 10 min.
9. Durch Perfusion PBS für 20 min waschen.
10. Blockieren mit 5% fettfreier Milch (in PBS) für 6 Stunden bei 4 ° C ist.
11. Fügen Sie in primären Antikörpers an VGCC von Interesse (1: 200-Verdünnung in PBS) und Inkubation für 20 h bei 4 ° C.
12. Durch Perfusion PBS für 20 min waschen.
13. Blockieren mit 5% fettfreier Milch (in PBS) für 10 min bei 4 ° C ist.
14. Fügen in sekundären Antikörper (1: 400-Verdünnung in PBS) und Inkubation in Dunkelheit für 2 h bei 4 ° C ist.
15. Durch Perfusion mit PBS für 20 min waschen.
16. Block mit 1% Rinderserum Albumin (in PBS) für 20 min.
17. Fügen Sie in Alexa Fluor 488 Phalloidin (5 Einheiten / ul Arbeitskonzentration; Lager in Methanol 200 Einheiten / ml) hergestellt.
18. Durch Perfusion mit PBS für 20 min waschen.
19. Bild mit 100X Wasserimmersionslinse auf konfokalen Mikroskop.

6. Elektrophysiologische Aufnahme

1. Herzustellen Aluminosilicatglas Patch-Pipetten (2-5 Pipettenwiderstand MQ) in einem P-87-Mikropipette Puller. Design Patch-Pipette, so dass Pipettenspitze umfasst ganze präsynaptischen Terminal Durchmesser.
2. PDMS Mantel Patchpipetten durch Eintauchen der Patch-Pipette unter 50-60 psi Druck in PDMS ²³ (Anschluss Silikonschlauch, 0,89 mm Innendurchmesser, mit einem Stickstoffgaszylinder verbunden ist, um das hintere Ende der Patch-Pipette) und Trocknen unter Verwendung einer Heiß Pistole. Alternativ manuell Beschichtung der Pipette mit PDMS, eine Beschichtung, so nahe an der Spitze, wie möglich, unter einer zusammengesetzten Mikroskop.
3. Feuerpolitur Patch-Pipetten mit einem MICRoforge (a custom built Platin Filament auf die Bühne einer Verbindung Mikroskop montiert).
4. Identifizieren isoliert Axone zeigen beschriftet präsynaptischen Enden durch Fluoreszenzmikroskopie.
5. Füllen Aufzeichnungslösung (Ca ^{2 +} entwickelt, um Ströme zu isolieren; 10 mM CaCl ₂ oder 90 mM BaCl ₂ als Ladungsträger, gepufferte HEPES pH 7,6, Osmolarität 270 mOsm) in der Patch-Pipette mit einer Spritze.
6. Legen Patch-Pipette in die Pipettenhalter und Position über Bad mit einem motorisierten Manipulator MP225. Senken Sie die Patch-Pipette in das Bad und die Position gegen das Gesicht eines fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminal.
7. Schieben Sie den Patch-Pipette langsam, bis ein Kontakt mit der Membran gemacht. Zu diesem Zeitpunkt erreicht eine Gigaohm Dichtung durch sanftes Saugen Mund durch einen Schlauch der Pipettenhalter befestigt.
8. Um die für die Aufnahme einzelner Kanal Ca2 ⁺ Ströme benötigt extrem niedrigen Hintergrundgeräuschpegel zu erreichen, benötigen Sie ein Axopatch 200B mit einer gekühlten heads für die Aufnahmen. Beispieldaten bei 20-50 kHz und Filter mit einem 5 kHz Bessel-Filter. Führen Sie die Datenerfassung mit Hilfe eines Axograph X.
9. Verwenden Sie ein Standard-Schritt-Protokoll, in Schritten von 10 mV als Stimulus. Enthalten einen Vorimpuls in dem Protokoll, vor der Schritt-Protokoll, um eine maximale Aktivierung von Ca ^{2 +-Kanäle} zu gewährleisten. Integrieren Sie eine 10 mV Leck Schritt in die Schritt-Protokoll für die post-Analyse Subtraktion der Leckströme.

Representative Results

Diese Dissoziation Protokoll Erträge gesunde und funktionelle isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f, die aber dennoch behalten funktionellen präsynaptischen Enden der Lage, hervorgerufen synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose 4c und 4d. Abschnitte der isolierten Regionen der retikulospinale Axone kann unter Lichtmikroskopie eindeutig identifiziert werden klar von anderen neuronalen Prozesse ermöglicht uneingeschränkten Zugriff auf das Axon-Membran retikulospinale 2f zu sein. Die Axone behalten strukturelle Integrität nach der Dissoziation. Axone isoliert wurden in Ganzzellkonfiguration geflickt und mit Alexa Fluor 488 Hydrazid gefüllt. Der Farbstoff gleichmäßig innerhalb des Axons und kein Austritt von Farbstoff verteilt wurde aus dem Axon 4a beobachtet.

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Abbildung 4. Repräsentative Aufnahmen aus einer isolierten retikulospinale Axon. (A) Isolierte retikulospinale Axon mit Alexa Fluor 488 Hydrazid mit einer Patch-Pipette in Ganzzellkonfiguration gefüllt. Pipette Position ist mit einem weißen Pfeil gekennzeichnet. (B) i. Vertreter Aktionspotential in einer isolierten retikulospinale Axon gefeuert. ii. Vertreter Aktionspotential in einem retikulospinale Axon im intakten Rückenmark gebrannt. Schwarzer Pfeil zeigt Zeitpunkt der Stimulation. (C) und (d) Zwei Bilder von einem isolierten retikulospinale Axon zeigt punktförmige Markierung von präsynaptischen Enden mit FM 1-43 und Targeting eines einzelnen präsynaptischen Terminal mit Patch-Pipette für Cell-Attached-Patch Aufnahme. Grüne Pfeile markieren einzelne präsynaptischen während weiße Pfeil markiert die Patch-Pipette. (E) Dead isoliert retikulospinale Axon zeigt indiscriminate Einbau von FM 1-43 in der gesamten Axon. 4f. Repräsentatives Beispiel zeigt Cell-Attached-Aufnahme von Ca2 ⁺ Ströme (10 mM [Ca ^{2 +]} _Außen in der Recording-Lösung in der Patch-Pipette) von der präsynaptischen Membran Trennfläche demonstriert das Öffnen mehrerer Ca ^{2 +-Kanäle.} Gezogene Linie markiert 0 zeigt geschlossenen Zustand des Kanals, während die gestrichelten Linien zeigen die Gauß-Peaks für Kanalöffnungen.

Akut dissoziiert Axone behalten elektrische Eigenschaften. Ruhemembranpotential (RMP) kann durch Aufspießen die distanzierte Axon mit einer Mikroelektrode oder durch das Patchen des Axons in Ganzzellkonfiguration in Stromzange Modus gemessen werden. Ähnliche RMPs werden in beiden Methoden erfasst, mit einem Mittelwert von -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 Axone). Zusätzlich dissoziiert Axone Aktionspotentiale ausgelöst stimuliert 4B, mit der Form und den Zeitverlauf des Aktionspotentials vergleichbareinem in einem retikulospinale Axon in der intakten Wirbelsäule gebrannt.

Fusion von Vesikeln und Recycling bestehen in dissoziierten Axone. Recycling-Vesikel-Cluster können mit der Styrylfarbstoff FM 1-43 in der Hoch Kalium (30 mM KCl) Stimulation ¹⁹ gekennzeichnet werden. Auf Farbstoff-Clearance, können verschiedene punktförmige Markierung von präsynaptischen 4c und 4d beobachtet werden, mit einer Verteilung ähnlich retikulospinale Axone im Rückenmark intakt ^13. FM 1-43 Färbung bietet eine klare Unterscheidung zwischen gesunden und ungesunden Axone als ungesund Axone zeigen wahllose FM Farbstoff Eintrag in der gesamten Axon 4e. Die Fähigkeit, einzelne präsynaptischen eindeutig identifizieren können wir sie mit einer Patchpipette zur Aufnahme 4c und 4d Ziel. Unter Verwendung dieser Fähigkeit haben wir Ca direkt von der Trennfläche m ^{2 +} Ströme aufgezeichnetembrane Einzel präsynaptischen 4f.

Die akut isoliert retikulospinale Axon Vorbereitung bietet auch deutliche Vorteile im Vergleich zu den intakten Rückenmark für die Immunhistochemie Einzel präsynaptischen Terminals. Das Fehlen jeglicher Hintergrund-Autofluoreszenz und die Abwesenheit von Flecken auf postsynaptischen Strukturen oder Gliazellen kann zur eindeutigen Identifizierung von Antikörpermarkierung bei identifiziert präsynaptischen Enden (5b, i). Mit einem präsynaptischen Marker gekoppelt wie Alexa-488-Phalloidin (5a, ii) und (5b, ii), die präsynaptischen Aktin ^20, Lokalisierung von immunhistochemischen Markierung zu präsynaptischen eindeutig nachgewiesen werden kann Etiketten (Abbildung 5a, iii). Dieser Ansatz hat sich in Verbindung mit der konfokalen Mikroskopie verwendet worden, um die Durchführung immunhistochemischen Charakterisierung der verschiedenen Subtypen zeigt VGCC tErben spezifische Lokalisation zu präsynaptischen Enden 5a.

Abbildung 5. Immunfärbung eines isolierten retikulospinale Axon. (A) Immunhistochemische Charakterisierung der R-Typ (CaV2.3) Calcium-Kanal an einzelnen präsynaptischen Terminals. i. Ein polyklonaler primärer Antikörper wurde verwendet, um ein Epitop in der intrazellulären Schleife zwischen den Domänen II und III der R-Typ-Kalziumkanal zu kennzeichnen (Host - Kaninchen). Sekundäre Antikörper war Alexa Fluor 633 Hydrazid konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG. ii. Präsynaptischen Enden von Alexa Fluor 488 Phalloidin Kennzeichnung von präsynaptischen Aktin identifiziert. iii. Kolokalisation zwischen R-Typ-Antikörpermarkierung (rot) und Alexa-488-Phalloidin (grün) in einer zusammengeführten Overlay angezeigt. (B) i. Vorinkubation der Anti R-Typ-Kalziumkanal-Antikörpers mitKontrollantigen keine spezifische Kennzeichnung von Calciumkanälen ergeben. ii. Alexa Fluor 488 Phalloidin Kennzeichnung von präsynaptischen Axon für die gleiche, die diskrete punktförmige Markierung.

Discussion

Unsere Dissoziation Protokoll ist durch Abgabe isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f signifikant, aber dennoch funktionellen präsynaptischen 4c und 4d zu behalten. Das Fehlen von postsynaptischen Prozesse gegen die präsynaptischen Terminal ermöglicht den direkten Zugriff auf die Aufnahme der präsynaptischen Membran Trennfläche bei Einzel präsynaptischen Terminals, die zuvor in zentralen Synapsen nicht möglich ist und in nur zwei präsynaptischen Kelch-Typ erfolgreich erreicht; Kelch-Typ-Synapse der Küken Ciliarganglion ^7-10 und Ratten Kelche ^11,12. Einzel präsynaptischen Enden, die an der elektronenmikroskopischen Ebene haben gezeigt, dass einfache, einzige aktive Zonen ²¹ präsentieren, kann durch Kennzeichnung Recycling-Vesikel-Cluster mit FM 1-43 identifiziert und für die Aufnahme 4c und 4d richtet sein. Ca 4f aufgezeichnet werden. Die Aufzeichnung von Ca ^{2 +} Ströme direkt von der Trennfläche Membran einzelner präsynaptischen signifikant ist, da dies die erste derartige Aufzeichnungs an zentralen Synapsen. Die physiologische Bedeutung der Herstellung wird durch die Tatsache, dass die Axone behalten Funktion nach Dissoziation, so dass für die Aufnahme von präsynaptischen Enden mit ähnlichen Eigenschaften mit den Anschlüssen in den retikulospinale Axone im intakten Wirbelsäule hervorgehoben. Darüber hinaus präsynaptischen Ca2 ^{+-Transienten} in retikulospinale Axone haben in der intakten Neunauge Rückenmark durch Kalzium-Imaging ¹³ bietet einen Verweis auf die von den akut dissoziiert Axone erhaltenen Ergebnisse bestätigen gekennzeichnet.

Der Schlüssel zum Erhalten isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen liegt in einer Reihe von Kritikeral aufeinanderfolgenden Schritten. Gewebe behindern akuter Dissoziation der riesigen Axone hauptsächlich in der dorso-medialen Bereich des Rückenmarks Abbildung 1a gelegen hatte, um zunächst in einem vibrierenden Gewebe Schneidemaschine 2a entfernt werden. Dies macht es einfacher, mechanisch dissoziiert das Rückenmark mit der geringstmöglichen Kraft. Das Schneiden der dorsalen Säule erfordert die vollständige Entfernung des dorsalen Hirnhaut Primitiva da jede verbleibende Rücken meninx Primitiva würde die Schneidwirkung der Klinge zu verhindern. Wir finden, dass das Verlassen des ventralen Hirnhaut Primitiva auf das Rückenmark zum Zeitpunkt des Schneidens hilft, die Form der Wirbelsäule und hilft besser schneiden. Erhalt Spannung in der Wirbelsäule während des Schneidprozesses verhindert jede seitliche Bewegung oder auftreffenden des Gewebes unter der Klinge, die die Axone beschädigen würden. 1 cm lange Stücke Rückenmark bietet eine gute Länge für das Schneiden, wenn das Gewebe gedehnt und festgenagelt Aufrechterhaltung der Spannung w werdenährend Schneiden. Ein weiterer kritischer Faktor zu überwachen, ist die Tiefe des Schnitts; zu flach eine Scheibe verhindert, dass gute Trennung des Rückenmarks, während eine Scheibe zu tief schädigt die retikulospinale Axone. Eine gute Schnitttiefe ist eine, wo die dorsale Säule entfernt wird sichtbar Verlassen des ventralen retikulospinale Spalte unbeschädigt. Die Tiefe der Scheibe muss während des Schneidprozesses ist die dort angegebene Variation in Rückenmark Dicke zwischen Tieren gemessen werden. Die Entfernung der dorsalen Säule wird am besten im mittleren Abschnitt des Rückenmarks Stück 2b durchgeführt, wie es für die unsliced ​​rostral und Schwanzenden dienen als Griffe, um das Gewebe während der Dissoziation 2e erfassen.

Nach Entfernung des dorsalen Säule, die Behandlung der geschnittenen Stücke des Rückenmarks mit einem Gemisch aus Kollagenase (Kollagenase Typ IA aus Clostridium histolyticum) und Protease (Protease Typ XIV aus Streptomyces griseus), Enzyme (1 mg / ml in Ringer-Lösung) hilft verdauen das Bindegewebe und ermöglicht eine sanftere Dissoziation. Ein 30-45 min bei RT Verdauung ist ideal für die Dissoziation. Vollständige enzymatische Dissoziation des Neunauge Rückenmark wurde vorher mit sequentiellen Behandlungen von Kollagenase (2 mg / ml, 30 min) und Protease durchgeführt (2 mg / ml, 45 min), um spinale Neuronen ¹⁷ zu isolieren. Sequentiellen Behandlungen gegenüber der Behandlung mit einem Cocktail von Protease-und Collagenase nicht besser Ergebnisse in distanziert retikulospinale Axone. Wir haben auch Experimente mit verschiedenen Konzentrationen der Dissoziation Enzyme. Enzymkonzentrationen höher als 2 mg / ml oder Verdauung mal länger als 45 min führte im Rückenmark verliert seine Konsistenz und schlechte Dissoziationen. Die höhere Enzymkonzentration und längeren Behandlungszeiten können in vollständige Dissoziation der Wirbelsäule zu unterstützen, wenn Ausbeuten kleiner Neuronen erforderlich sind. Retikulospinale Axone, haben dagegen eine erweiterte struld und Behandlungen von mehr als 45 min waren kontraproduktiv. Halte eine gewisse Spannung in der Wirbelsäule gestützt besser Dissoziationen.

Der nächste wichtige Schritt ist, um die seitlichen Flächen von der Enzym-behandelten Rückenmark Stücke am Mittelpunkt des geschnittenen Bereichs schneiden, um die endgültige Spaltkraft auf die Region, die retikulospinale Axone isolieren. Die Schnitte sollten von der Seitenkante des Vorderhorn der grauen Substanz an die zentrale ventro-medialen Spalte retikulospinale Axone verlängern so dass sie unbeschädigt 2d. Schneiden Sie die seitlichen Flächen bietet eine Anlaufstelle, bei der Zwangstrennung des Rückenmarks wird bei der mechanischen Dissoziation auftreten und ermöglicht eine reibungslosere Trennung der Gewebe. Während des Schneidvorgangs aufrechterhalten wird Spannung in der Wirbelsäule erforderlich und kann durch Strecken und Pinning der kaudalen und rostralen Enden des Rückenmarks Stück erreicht werden. Dies verhindert, dass Gewebe Verformung unter dem Skalpellund daraus resultierende Schäden an den Axonen.

Der letzte Schritt bei der Dissoziation Anlegen mechanischer Spannung und sanft Dehnung des Gewebes entlang der rostro-kaudalen Achse 2e mit einer Pinzette zum Ergreifen des Gewebes. Dieser Schritt wird als Poly-Lysin beschichtete Deckgläser durchgeführt, um die Haftung der aufgetrennten Axone zur nachfolgenden Aufzeichnung zu ermöglichen. Um eine größere Haftung für die langen Axone erweiterten retikulospinale erreichen, haben wir ein hohes Molekulargewicht verwendet (> 300.000) und Poly-D-Lysin-Hydrobromid, die größere Anzahl von Befestigungspunkten die Deckgläser und Petrischale Einsätze bietet, zu beschichten. Die Poly-Lysin-beschichtete Oberfläche bietet eine ausreichende Haftung für das Rückenmark endet und die akut isoliert retikulospinale Axone. Teflon beschichtet Zange zu greifen benötigt das Rückenmark, weil es klebt fest an regelmäßigen Edelstahl Pinzette behindern Dissoziationen. Das Gewebe muss langsam gedehnt werden und vorsichtig ziehen die Axone aus dem spInal Kabel. Der beste Weg, um die Axone, sich niederzulassen ist die Erhaltung des Rückenmarks endet entlang der Deckglas zu jeder Zeit während der Dissoziation durch die Aufrechterhaltung Druck nach unten auf den rostralen und kaudalen Rückenmark endet mit der Zange.

Die Axone werden am besten als teilweise isoliert klassifiziert, da ein Teil des Axons bleibt innen an mindestens einem Ende des Rückenmarks Ende je nach dem Ausmaß der Dissoziation. Isolierungen kann durch mechanisches Trennen der zwei Enden des Rückenmarks, bis die Axone vollständig von einem Ende des Rückenmarks separaten geführt werden. In diesem Fall, in dem Rückenmark Ende, aus dem es austritt, während der verbleibende Teil aus dem Rückenmark Innenraum isoliert bleibt ein Teil des Axons. Das Terminal offenen Ende der Axone dichtet durch eine Membran Ausheilprozesses abhängig von der Gesundheit des Axons. Isolierungen auch so durchgeführt, dass die Axone entstehen aus dem Rückenmark, b werdenut der kaudalen und rostralen Enden des Rückenmarks weiterhin mittels der isolierten retikulospinale Axone verbunden 2E. An dieser Stelle sanft Lösen des Drucks ermöglicht die Axone unter Spannung zu entspannen und Schleife aus was isolierten Regionen von Axonen frei von postsynaptischen Projektionen. Beide Techniken ergeben Dissoziation Funktions Axone. Die physiologische Temperatur für die Neunauge 10 ° C und damit der Herstellung wird bei 10 ° C für 1 Stunde zu erholen zu lassen für die Axone von akuten Dissoziation erholen. Für elektrophysiologische Aufnahmen wurden die Dissoziation an einem Poly-Lysin beschichtete Deckgläschen in eine individuelle Kammer Abbildung eingefügt 3 durchgeführt. Lamprey Rückenmark wurden in der Regel bei 10 ± 2 ° C durch Perfusion Ringer-Lösung auf 10 ° C vorgekühlt, indem es durch beibehalten eine thermoelektrische Kühleinrichtung. Außergewöhnlich ist für die Lösung einzelner Kanal Ca geringem Hintergrundrauschen erforderlich

Hohen K ⁺ (30 mM KCl) wird verwendet, um die Axone (Abschnitt 4.1), so dass FM Farbstoff in einge depolarisierenVesikel während der synaptischen exo-Endozytose. Es ist schwierig, Einführen einer Mikroelektrode isoliert Axone über einen längeren Zeitraum zu halten, wie die geringste Drift Axon Position bewirkt, dass die Elektrode aus dem Axon zurücktreten. Dies macht es schwierig, die Axone für längere Zeit unter Verwendung einer Mikroelektrode zu stimulieren. Die große Axondurchmesser (20-50 um) macht es schwierig, unter Verwendung einer Wolfram stimulieren Stimulationselektrode. Daher hohen K ⁺ wurde verwendet, um die Axone depolarisieren. Die präsynaptischen Enden im retikulospinale Axone haben einen Durchmesser von 1-2 um.

Ca ^{2 +} Ströme an der Trennfläche bei präsynaptischen Membran lokalisiert und es ist daher wichtig, genau zu zielen präsynaptischen Ende. Daher wird eine wichtige Voraussetzung, um diese Aufnahmen zu erzielen in der Lage, die Bewegung der Patch-Pipette Position in Schritten um zu manipulieren. Ca ^{2 +} Ströme an präsynaptischen Freisetzung Gesicht Membranen wurden demonstrated in Kelch Synapsen extrem klein in der Amplitude kleiner als 0,5 Pa ist. Einzelkanal-Aufnahmen von Ca2 ⁺ Ströme erfordern daher extrem niedrigen Hintergrundgeräuschpegel. Geringe thermische Rauschen wurde mit einem Axopatch 200B-Verstärker und einem gekühlten heads erreicht. Weiterhin verunreinigen Lärmquellen müssen systematisch identifiziert und eliminiert werden. Patch-Pipetten wurden hergestellt, aus Aluminiumsilikatglas, um sicherzustellen, geringes Rauschen, da das Glas extrem niedrige Verunreinigungen und hohen spezifischen Widerstand. Die Pipetten wurden solche geschaffen, dass die Pipettenspitze einen größeren Durchmesser als der Durchmesser der präsynaptische dadurch vollständig umfasst präsynaptischen Ende war, können die Abmessungen von deutlich FM 1-43 Kennzeichnung beachten. Dies gewährleistet die Aufnahme aus der gesamten Trennfläche Membran. Die kapazitive Rauschen wurde durch Beschichten der Pipette mit PDMS möglichst nahe an der Spitze wie möglich reduziert. Die Giga-Ohm-Dichtungen an präsynaptischen Terminal Membranen sind nicht für lange pro stabilIODs und Aufnahmen dauern in der Regel maximal 2 min. Dies macht die Aufnahmen sehr schwierig zu erhalten, da die geringe Erfolgsrate erfordert eine große Anzahl von Versuchen erfolgreich Aufnahmen erhalten. Aufzeichnungslösungen müssen so ausgelegt sein, dass alle anderen bekannten Ströme in der präsynaptischen Membran Endgerät wie spannungsgesteuerten Na ⁺ und K ^+-Kanäle und Ca ^{2 +} -aktivierten K ^+-Kanäle blockiert sind, so dass die Aufnahme von Ca ^{2 +} Ströme.

Es gibt einige Einschränkungen der Verwendung der Poly-Lysin Klebefläche mit dieser Zubereitung. Eine davon ist die Unfähigkeit, den physischen Standort des Kammer mit der Vorbereitung, da alle Vibrationen störten die Vorbereitung zu bewegen. Eine weitere Einschränkung der Klebefläche während Immunhistochemie Experimente entdeckt, als die rostralen und kaudalen Rückenmark Endstücke verlieren Adhäsion, wenn sie in 4% Paraformaldehyd inkubiert. Wir haben alternative Klebe coa versuchtstellungen wie Handy-Tak und stieß auf ähnliche Probleme. Um diese Probleme zu lösen, haben wir flüssigen Nahtkleber auf die Rückenmarksgriffen befestigen. Die Einzelheiten bezüglich der Verwendung des Nahtkleber in einem früheren JoVE Artikel von Chen und Featherstone ²² diskutiert. Die Klebesätze langsamer in Lösungen ohne zweiwertige Ionen und wir nutzten der Immobilie und führte die Dissoziation in Ringer-Lösung ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +.} Dies hat uns zusätzliche Zeit für die Manipulation des Gewebes während der Dissoziation. Wir haben eine ähnliche Herangehensweise an Chen und Featherstone ²² mit Patch-Pipetten und Mund saugt über einen Schlauch an die Patch-Pipette verbunden, um den Leim auf die spezifische Zielbereich auf der Dissoziation Oberfläche vor der Durchführung der Dissoziation (Protokoll Abschnitt 5.2) gelten. Die Dissoziation wurde wie früher beschrieben, mit dem Unterschied, daß das Rücken C durchgeführtord Enden wurden während der Dissoziation durch leichtes Ziehen der Griffende über die zuvor platzierten Kleber (Protokoll Abschnitt 5.3) angebracht. Sobald die Spaltung abgeschlossen war, die zweiwertige Ionen Ringerlösung wurde Ringer-Lösung, die Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +-Ionen} ausgetauscht werden durch Perfusion und die Herstellung wurde bei 10 ° C für 20-30 min auf einer thermoelektrischen Kühlplatte vor erholen Fortschreiten zu nachfolgenden Schritten Immunhistochemie.

Der Schlüssel Implikation dieser Technik ist ein genaues Verständnis der Ca2 ⁺ Voraussetzung für die Freisetzung von Neurotransmittern, die nicht vollständig trotz jahrzehntelanger Forschung gelöst hat. Ein vorübergehender Anstieg der präsynaptischen [Ca2 ^+] als entscheidend zur Auslösung Release in allen Synapsen etabliert. Jedoch ist Konsens noch fehlt auf der Anzahl der Ca ^{2 +-Kanäle,} die an die Ca ^{2 +-Domäne} Gating relea beitragense. Simultane Messung von Ca2 ⁺ Ströme und Kapazitätsmessungen an der Trennfläche Membran der einzelnen präsynaptischen Enden würde eine eindeutige Antwort auf diese Frage zu erhalten. Weiterhin wäre es Aufklärung der Zeitbeziehung zwischen präsynaptischen Ca ^{2 +-Eintrag} und Vesikelverschmelzung ermöglichen, die eine genaue Messung der synaptischen Verzögerung. Die uneingeschränkte Zugänglichkeit der Trennfläche Membran an einzelnen präsynaptischen bietet die Möglichkeit, eine Reihe von verschiedenen experimentellen Ansätzen angewendet, um verschiedene Komponenten der Neurotransmitter-Verfahren zu untersuchen. Beispiele für solche Ansätze sind einzelne Vesikel Bildgebung mit Quantenpunkten, die synaptische Vesikel-Fusion zu studieren. Vesikelfusion Ereignisse können auch direkt an präsynaptischen Membran durch Messung von Kapazitätsänderungen, die Fusion von Vesikeln Ereignisse zugrunde liegen, charakterisiert werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300,000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodies R-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Pressure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	14046230132
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon