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Neuroscience

폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 방법 Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

여기에서 우리는 초파리에서 폐쇄 머리 외상성 뇌 손상 (TBI)를 입힐 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 파리에 사용할 실험 도구와 기술의 광대 한 배열을 사용 TBI 병리의 기초 세포와 분자 메커니즘을 조사하기 위해 게이트웨이를 제공합니다.

Abstract

외상성 뇌 손상 (TBI)는 물리적,인지 적, 행동 적 기능과 죽음의 손상을 초래, 매년 수백만의 사람에 영향을 미친다. 초파리를 이용한 연구는 신경 학적 과정을 이해에서 중요한 돌파구를 기여했다. 따라서, 인간의 TBI 병리의 세포 및 분자 기초를 이해하는 것을 목표로, 우리는 파리에 폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 높은 충격 외상 (HIT) 장치를 개발했다. 파리 임시 무능력 및 신경 퇴화와 같은 진행성 인간 TBI 부합 HIT 장치 디스플레이 표현형을 실시. HIT 장치는 플라이 뇌에 기계적인 손상을 초래, 유리 병의 벽에 파리를 추진하는 스프링 기반 메커니즘을 사용합니다. 장치는 자신의 조작이 간단하고 빠르며, 시공이 저렴하고 용이하며, 또한 재현 가능한 결과를 생성한다. 따라서, HIT 장치는 기존의 실험 도구와 파리는 근본적인 해결하기위한 기술과 결합 될 수있다외상성 뇌 손상에 대한 진단 및 치료의 발전으로 이어질 수 TBI에 대한 질문. 특히, HIT 장치 TBI 병리의 유전 기초를 이해하기 위해 대규모의 유전자 스크린을 수행하는데 사용될 수있다.

Introduction

외상성 뇌 손상 (TBI)가 외부로부터 기계적인 힘 뇌 손상으로서 정의된다. 가장 일반적으로, 같은 무딘 힘과 관성 가속과 뇌가 두개골의 내부를 공격하게 감속 힘으로 닫힌 헤드 세력 TBI 결과. 미국에서, 5 만 개인이 TBI 매년 죽고 2.5-6500000 개인, TBI의 결과와 함께 살고 물리적,인지 쇠약 포함, 1,2- 행동 문제가있는 것으로 추정된다. TBI의 결과로 인해 뇌에 차 기계 부상뿐만 아니라 시간이 3-5에 걸쳐 발생하는 뇌에 보조 세포 및 분자 부상뿐만 아니라 다른 조직에뿐만 아니라입니다. TBI 진단 및 치료 방법의 개발은 TBI는 복잡한 질병 과정이므로 어려운 것으로 입증되었다. 주 부상, 인간 생리학, 환경 요인의 변수 특성은 이기종 보조 나는 결과njuries 및 병리. 근본적인 요인 변수는 개인의 주요 손상의 중증도, 반복적 차 부상 사이의 시간, 및 연령 및 유전자형을 포함한다. 각 변수 요인이 TBI의 결과에 기여하는 방법을 이해하는 것은 진단하고 TBI 6,7 치료 방법의 개발에 도움을 가능성이 높습니다.

여기에서 우리는 TBI의 결과에 변수 요인의 기여를 묘사하는 데 사용할 수있는 초파리 (초파리)에 폐쇄 머리 TBI를 입힌하는 방법을 설명합니다. 방법은 강렬하게 손의 손바닥에 비행 문화 유리 병의 측면을 타격하는 야생형 발생 초기 관찰을 기반으로 일시적, TBI의 가능성이 결과를 무력화되기 위해 파리. 따라서, 우리는 손으로 치는 동작에서 가속 및 감속 힘을 요점을 되풀이하는 높은 충격 외상 (HIT) 장치를 건설했다. 고속 동영상 보여준다에서 단일 스트라이크장치가 원인 HIT는 머리와 몸 8 유리 병 벽을 여러 번 연락을 날아. 어느 정도, 모든 연락처는 총알과 폭포와 자동차 충돌 9 인간에게 발생하는 것과 유사한 머리 캡슐에 대해 변형 플라이 뇌가 발생할 가능성이 있습니다. 따라서, 뇌 10 실조증이어서 임시 무능력 이동성의 점진적인 회복, 헤드에서의 유전자 발현의 변화 및 진행성 신경 퇴행을 포함한 뇌 손상과 일치 HIT 장치 디스플레이 표현형 처리 날아간다. 따라서, HIT 장치는 가능한 실험 도구와 파리 위해 개발 된 기술을 이용하여 엄청난 아스날 TBI를 연구 할 수있다.

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Protocol

히트 장치 1. 건설

  1. 두 클램프와 4 개의 나사 (그림 1A)를 사용하여 보드에 스프링을 부착합니다. 보드의 폭을 기준으로 클램프를 중심 보드의 가장자리 외부 클램프 플러시 서로에 대해 그들을 엉덩이. 이전에 클램프를 부착로, 봄을 통해 단단히 맞게 플라이어를 사용하여 구부.
    주 : HIT 장치를 구성하는 데 필요한 자료에 대한 설명은 표 1을 참조하십시오. 스프링의 고정 단부는 기판의 가장자리로부터 1/8 인치 (3.2 mm)이어야하고, 자유 단부가 3/4 인치 (19mm)에 의해 기판 ​​위로 연장한다. 이 보드의 길이와 평행하게 놓 이도록 스프링을 조정합니다.
  2. 벨크로 루프 접착 스트립 한번 주위 스프링의 자유 단부를 감싸. 벨크로의 바깥 쪽 가장자리는 봄의 끝과 접하게한다. 는 CRE에 의해 스프링 바이알을 고정하는 데 사용되기 때문에 중요하다 벨크로꽉 압축 피팅 체제상에서. 벨크로는 또한 많은 바이알 단시간에 처리 할 수​​ 있도록 쉽게 연결하고 튜브의 제거를 허용한다.
  3. 단단한 나무 보드에 대해, 중심, 거꾸로 얼음 통 덮개를 놓습니다. 긴 쪽이 기판의 폭과 평행이되도​​록 얼음 통 덮개의 융 기부의 방향. 유리 병이 봄에 연결되어있는 경우 스프링 보드에 평평 거짓말을하지 않도록 얼음 통의 발생 지역, 나무 보드에 비해 1/2 인치 (13mm)보다 높은 있음을 유의하십시오.
  4. 얼음 양동이 커버 보드와 객체 사이에 끼여하고 이동하지 않습니다 그래서, 벽과 같은 고정 된 개체에 대한 전체 장치를 밀어 넣습니다.
  5. 테이프 판지의 바닥에 종이 각도기는 유리 병 트레이를 비행이 완벽하게 수직 위치로 철수 할 때 90 ° 마크가 봄과 정렬되도록 보드의 길이에 대해 가장자리에 서.

2.히트 장치의 작동

  1. 빈 유리 병에 날아와 꽉 끼는면 공을 사용하여 병을 마개 -anesthetized 1과 60 CO 2 사이에.
  2. 이 바닥에서 1 인치 (2.5 cm) 때까지 병에 목화 공을 밀어 유리 병의 바닥 1 인치 (2.5 cm)에 파리를 제한 할 것. 그것은 1 인치 (2.5 cm) 시점에서 유리 병에 선을 그어야하는 것이 도움이된다. 유리 병의 더 크거나 작은 지역에 파리를 구속하는 것은 표현형의 정도에 영향을 미칠 수 있습니다.
  3. 파리는 CO 2에서 이동성을 복구하기 위해 5 분을 기다립니다. 이 5 분을 완전히 CO 2의 효과를 제거 할 수있는 여부를 공지되지 않는다.
  4. 벨크로의 내부 가장자리가 유리 병 (그림 1B)의 상단과 수평이 될 때까지 유리 병에 봄의 끝을 삽입합니다. 봄이 평평 거짓말을하면, 유리 병의 1 인치 (2.5 cm)는 얼음 양동이 커버의 발생 영역을 중첩한다. 유리 병은 M을 재사용 할 수 있습니다모든 시간.
  5. 앉아있는 동안, 왼손의 엄지와 집게 손가락을 사용하여 벨크로 지역에서 병을 개최합니다. 오른손을 사용하여 벤치 탑에 보드가 꽉 잡아. 또한, 벤치 탑에 꽉 이사회를 개최 C - 클램프를 사용합니다.
  6. 완벽하게 직선 다시 원하는 각도에 스프링을 당깁니다. 봄을 놓습니다. 봄이 완전히 정지 할 수 있도록합니다.
  7. 봄의 병을 제거하고 파리 ≥5 분 동안 복구 할 수 있습니다. 다른 파업으로 파리를 주제 또는 플라이 음식과 함께 유리 병에 파리를 전송합니다.
    주 : 검정법의 다양한 HIT 장치로부터 공격의 표현형 효과를 평가할 수있다. 예를 들어, 수명에 영향이 손상 후 항상 생존 파리의 비율을 분석함으로써 결정될 수있다 뇌 형태에 미치는 영향은 헤드의 조직 학적 분석에 의해 측정 될 수 있고, 유전자 발현에 대한 효과는 mRNA 수준의 정량 분석​​에 의해 결정될 수있다 10.
  8. Determin동일 파업을 실시하지 않는 제어 파리 처리하여 파업으로 인해하지 않은 절차의 전자 효과. 얼음 양동이 커버에 대한 유리 병의 영향이 큰 소음이 발생하기 때문에 청력 보호 착용 할 것.

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Representative Results

우리는 파리가 차 손상 후 곧 죽을 이유를 이해하는 데 관심이 있습니다. 죽음을 정량화하기 위해, 우리는 차 부상의 24 시간 이내에 사망 파리의 비율을 24 시간에서 사망 지수 (MI 24)를 결정했다. 히트 장치에서 파업을 실시 파리는 플라이 식품 유리 병에 25 ℃에서 배양하고, 죽은 파리의 수는 24 시간 후에 계산되었다. 우리는 MI (24)에 영향을 미치는 요소를 식별하기 위해이 방법을 사용하여 MI 24 바이알 (10 내지 60 초파리 시험 하였다)에 파리의 개수에 의해 영향을받지 않는 것을 반복적 타격 사이의 시간 (1 ~ 60 분을 테스트 하였다 발견 ) 또는 플라이 (10)의 성별. 대조적으로, 우리는 기본 부상시에 그 결과가 나이 및 유전자형 MI 24 영향 않았다. 이전 파리는 젊은 파리보다 높은 MI (24)가 있고, 다른 유전자형의 파리는 유의 한 차이 MI (24)의했다.

그림 2에서우리는 기본 부상의 정도가 24 MI 영향을 미치는지 테스트. 차 부상의 정도를 변경하기 위해, 우리는 서로 다른 각도로 편향 스프링. 각 각의 경우, 1118 파리 (표준 실험실 주) W 이전 중 0-7 또는 20-27일의 유리 병은 파업 사이에 5 분 4 개의 파업을 실시 하였다. (60) 파리의 세 가지 병이 각 각 조사 하였다. 파리는 25 ° C에서 배양, 당밀 음식과 함께 유리 병에 전송하고, 죽은 파리의 수는 24 시간 후에 계산되었다. 평균의 MI (24) 평균과 표준 오차는 각각의 각도를 계산 하였다. 이러한 데이터는 편향의 큰 각도 즉., 더 심각한 주 부상, 편향의 작은 각도, 즉., 덜 심각한 부상보다 더 높은 MI (24)가 발생할 것을 알 수있다. 이 모두 0-7과 20-27일 오래된 파리 관찰되었다. 또한, Katzenberger 등의 알과 일치한다. (10), 20~27일 된 FL이거는 각 ≥50 °에서 상당히 높은 MI (24)보다 0-7 일 이전 파리를했다. 따라서, 이러한 데이터는 여러 연령대에서 MI (24)가 차 부상의 정도와 상관 관계가 있음을 나타냅니다.

그림 1
그림 1 :. 휴식 위치에 HIT 장치의 평면도의 히트 장치의도 () 그림. 히트 장치의 측면보기의 (B) 그림. 봄은 휴식 위치 (진한 빨강)에 표시된 90 ° (밝은 적색)에 편향된다.

그림 2
그림 2 :. 차 부상의 심각도는 MI (24)와 상관 관계 우리는 W 이전 0-7일의 MI (24)를 결정 1118 파리 (밝은 회색 막대)와 20~27일 이전 W 1118 파리 (어두운 회색 바)도에 표시된 각도에 빗나갔습니다. 0도 데이터가 있습니다 HIT 장치에 실시하지 날아간다. 평균 MI 24, 평균의 표준 오차를 보이고있는 바와 같다. 0-7과 20~27일 오래된 파리의 MI (24)는 50 ° (P <0.05, 하나의 꼬리 T 시험) 및 각도> 50 °에 대한 유의 한 차이가 있었다 (P <0.001, 하나 꼬리 T 시험) 각에서가 아니라 < 50 ° (P> 0.1, 하나의 꼬리 T 시험).

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Discussion

히트 장치 방법은 TBI (11)을 관통보다는 폐쇄 머리를 유발한다는 사실에 의해 파리에서 외상을 입힐 다른 방법과 구별된다. 또한, HIT 장치 방법은 많은 초파리 TBI를 입힐 적은 시간, 노력과 기술을 걸리므 방법은 대규모의 유전자 스크린에 대한 다른 방법들보다 더 의무이다. 마지막으로, HIT 디바이스에 의해 가해진 프라이 머리 부상에 한정되지 않는다는 사실은 한계와 이점을 모두이다. 추가 연구가 표현형은 뇌 또는 다른 신체 부위에 외상에 기인 여부를 평가하는 데 필요한 때문에 제한 사항입니다. 한편, polytrauma (여러 신체 부위가 외상에) 자주 수반 TBI 및 TBI 표현형을 조절하는 것으로 생각되므로, HIT 장치 방법은 TBI 표현형에 polytrauma의 기여도를 조사하기 위해 사용될 수있다. 플라이 TBI 모델은 설치류 및 비 - 인간 영장류 모델 TBI 위에 이점을 갖는다 생체 이미징 등.

이 프로토콜은 파리에서 폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수 있도록 설계되었습니다 히트 장치의 건설 및 운영에 대해 설명합니다. 우리는 MI 24과 함께 HIT 장치를 사용한 </ 서브> 분석은 TBI (7) 다음과 같은 생명체의 죽음을 연구합니다. 그러나, 플라이 TBI 모델 죽음을 이해하는 많은 다른 방법뿐만 아니라 다른 TBI의 결과에 사용될 수있다. 예를 들어, TBI의 실제 결과는 수면과 학습 및 기억 10,12-14 같은 매개 변수에 대한 분석법을 사용하여 측정 될 수 등산이나 비행기, TBI 및 행동의 결과로서 매개 변수 분석을 사용하여 측정 될 수있다. 뇌의 구조적인 효과는 면역 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 촬상 기술을 사용하여 결정될 수있다. 뇌에 영향 분자는 RNA-SEQ 또는 질량 분석 등의 프로테옴 분석 게놈 분석법을 사용하여 결정될 수있다. 뇌에 유전 효과는 조건부 유전자 녹다운 과발현과 같은 방법을 사용하여 결정될 수있다. TBI의 결과에 대한 환경 적 효과는 배양 온도 및 다이어트 또는 파라미터로서 변화 전후 부상 파라미터들에 의해 결정될 수있다스프링 편향 각도 또는 반복적 타격 간의 시간 등 HIT 장치. 마지막으로, HIT 장치는 TBI의 결과는 이하의 개인보다 오래된 개인 악화 이유로서뿐만 아니라 치료법을 식별 할 수 대규모 약물 스크린의 근본적인 문제를 해결하기 위해 대규모의 유전자 스크린에 사용될 수있는 TBI의 결과.

일관된 방식으로 사용될 때, 우리는 HIT 장치는 독립적 인 실험과 사용자 간의 재현성 표현형을 생산하는 것을 발견 하였다. 재현성에 영향을 미칠 수있는 파라미터는 HIT 장치의 셋업 및 동작이다. 표현형은 상당히 작은 보드, 플라이 바이알에 솜의 위치에 얼음 통 덮개의 위치 변화, 및 벨크로 스트립 바이알의 위치에 의해 영향을받을 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 또한, 표현형은 상당히 작은 변화에 의해 영향을받을 수있다스프링 편향의 각도. 따라서, HIT 장치의 새로운 사용자 설정 및 동작은 다른 사용자의 것과 동일하다는 것을 보장하기 위해 모니터링되어야한다. 우리는 일상적으로 그들을 MI (24) 1118 파리 승 오래된 0-7일의를 결정함으로써 새로운 사용자를 교정. 마지막으로, HIT 장치는 프로토콜에 설명 된 것과 동일 할 필요는 없다. 우리는 파리에서 TBI를 입힐 수있는 능력을 유지하면서 HIT 장치의 대부분이 변경 될 수 있음을 예상한다.

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Disclosures

우리는 공개 관심 없음 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 건강 보조금, R01 AG033620 (BG)의 국립 연구소에 의해 로버트 드레이퍼 기술 혁신 자금 (DAW)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

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References

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신경 과학 문제 (100) 높은 충격 외상 장치 사망률 외상성 뇌 손상

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 방법<em&gt; 초파리</em
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Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

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