Introduction
Die Möglichkeit, die Zellaktivität mit einer präzisen räumlichen und zeitlichen Auflösung Manipulation stellt eine wichtige Strategie in der neurowissenschaftlichen Forschung und bei der Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Störungen. 1 Herkömmliche Verfahren werden auf eine elektrische Stimulation von Zellen unter Verwendung von Elektroden in der Nähe oder in Kontakt mit positioniert basierend die gezielte System, 2, die unterschiedlicher Komplexität sein kann (einzelne Zelle, Mobilfunknetzes, Hirnschnitten, In-vivo-Hirngewebe). Während des letzten Jahrhunderts, haben die Verwendung von Patch-Clamp, Metall und Substrat integrierten Elektroden ein detailliertes Bild von der Physiologie und Pathophysiologie von einzelnen Nervenzellen und der Funktionsmechanismen von neuronalen Netzen zur Verfügung gestellt. Allerdings leidet die elektrische Stimulation von wichtige Einschränkungen. Der erste wird mit einer allgemein schlechten räumlichen Auflösung aufgrund der physikalischen Abmessungen der Elektroden und deren fester Geometrie, die nicht ohne weiteres angepaßt werden kann bezogenenbis hin zu komplexen organisierte Systeme wie biologische Gewebe. Auch kann es zu Problemen mit den Elektroden-Impedanz und des Übersprechens zwischen Stimulations- und Aufzeichnungssysteme aus den Abschluss Signal-Rausch-Verhältnis der Messungen verschlechtert. 3 Auf der anderen Seite kann die Verwendung von Licht zur Anregung helfen, viele Einschränkungen zu überwinden der elektrischen Ansatz. Zunächst einmal bietet sie völlig neue Raum (<1 um) und zeitliche Auflösung (<1 ms), so dass es möglich ist, spezifische Zelltypen oder sogar Unter Zellkompartimente zu zielen. Darüber hinaus ist es sehr nicht-invasive, da es keine physischen Kontakt mit dem Gewebe von Interesse vermeidet und entwirrt Stimulation von Aufnahme. Außerdem kann sowohl der Lichtintensität und der Wellenlänge genau reguliert werden und somit unterschiedlichen Stimulationsprotokolle angewendet werden kann. 3,4
Allerdings wissen die meisten tierischen Zellen nicht vorhanden irgendeine spezifische Lichtempfindlichkeit. Mehrere Strategien für optische stimulation Damit haben vorgeschlagen, entweder in der Nähe oder innerhalb der Zellen auszunutzen lichtempfindliche molekulare Mediatoren oder mit photoaktiven Bauelementes außen gelegt, in der Nähe der Zelle. Die erste Kategorie bezieht sich auf endogene Mechanismen wie die Stimulation über sichtbares oder infrarotes (IR) Licht, wie auch die Verwendung von entweder photoisomerisierbare / photospaltbaren Verbindungen oder die genetische Expression von lichtempfindlichen molekularen Aktuatoren (Optogenetik). Letztere Klasse umfasst Techniken für die exogene Stimulation mit dem Einsatz von anorganischen Nano- / Mikropartikel oder photoleitende Siliziumsubstraten erreicht. 5 Doch alle diese Systeme haben helle Seiten und Nachteile. Insbesondere endogen Absorption von Zellen in dem sichtbaren Bereich schwach und nicht zuverlässig, und die damit verbundene Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies kann schädlich für die Zelle sein. Im allgemeinen wird IR zum Induzieren lokaler thermischer Erwärmung aufgrund der Wasserabsorption verwendet, aber die Extinktionskoeffizienten von Wasser gering ist, so st bedürftigenrong Infrarotlicht (von zehn bis hundert W / mm 2), die schwer über Standard-Mikroskop-Optiken liefern und kann Sicherheitsbedenken für die In-vivo-Anwendungen stellen ist. Auf der anderen Seite, haben photoschaltbare Käfigverbindungen eine zeitlich begrenzte Wirkung und erfordern oft UV-Licht, die schwer zu liefern, ist aufgrund der begrenzten Gewebepenetration. Außerdem leiden sie unter Diffusionsproblemen der aktivierten Verbindungen durch Photolyse außerhalb des beleuchteten Bereichs. Schließlich haben optogenetische Werkzeuge Wissenschaftlern erlaubt, spezifische zelluläre Subpopulation und Unterfächer zielen und sich rasch zu einer der Schlüsseltechnologien in der neurowissenschaftlichen Forschung. , Einsetzen eines exogenen DNA-Segment über einen viralen Vektor wirft jedoch wichtige Fragen der Sicherheit, insbesondere im Hinblick auf die Annahme an menschlichen Patienten. 5,6 Aus diesen Gründen ist die Forschung an neuen Materialien und Vorrichtungen, die Zellenlichtmanipulation ist ein extrem heißes Thema.
Kürzlich wurde ein neuartigerAnsatz basierend auf der Verwendung von lichtempfindlichen konjugierter Polymere in der Lage, einen optischen Reizes effizient transduzieren zu einer Modulation der Zell elektrische Aktivität, vorgeschlagen worden. Die Zellstimulation durch Polymer Photoanregung (CSPP) Technik nutzt viele Schlüssel ermöglicht Funktionen typischer organischer Halbleiter: Sie eigen empfindlich auf Licht im sichtbaren Bereich sind; 7 sie biokompatibel, angenehm weich und anschmiegsam sind und deren mechanische Flexibilität ermöglicht eine intime Schnittstelle mit Gewebe sowohl In-vitro- und In-vivo-8-10. Abgesehen davon, können sie leicht funktionalisiert werden, um eine bessere Anpassung an die Schnittstelle mit lebenden Zellen und spezifische Anregung zu ermöglichen, Sondieren und Erfassungsfähigkeiten werden. 11,12 Darüber hinaus unterstützen sie die elektronische als auch Ionentransport, wodurch sie ideal für die Kombination Elektronik ad Biologie. 13,14 Interessant ist, sie in der Photovoltaik-Modus arbeiten kann, wodurch die Notwendigkeit, eine externe Bias-f anwendenoder effiziente Zell optische Stimulation. 15
Die Zuverlässigkeit der CSPP Technik wird bisher in mehreren Systemen bewiesen, einschließlich primären Neuronen, Astrozyten 15,16, 17 sekundäre Zelllinien 18 und explantierten Netzhautgewebe. 16 In dieser Arbeit, alle notwendigen Schritte, um eine lichtempfindliche Biopolymer herzustellen Schnittstelle 19 für optische Stimulation der In-vitro-Systeme sind im Detail beschrieben. Wie eine Studie Fall einer prototypischen organischen Photovoltaik Mischung aus regions regelmäßigen Poly (3-hexylthiophen) (rr-P3HT), der als der Elektronendonor und Phenyl-C61-Buttersäure-Säure-Methylester (PCBM), als amtierender die Elektronenakzeptor verwendet. Wie das biologische System, sind menschliche embryonale Nieren (HEK-293-Zellen) verwendet. Ein Beispiel eines Photo Protokoll mit der relativen Aufnahme von Zellaktivität über elektrophysiologische Messungen vorgesehen.
Die beschriebene Plattformist jedoch der allgemeine Gültigkeit, und es kann leicht auf die Verwendung von anderen konjugierten Polymeren ausgedehnt werden (durch geeignetes Einstellen der Lösung Herstellungsverfahren und die Abscheidungsparameter) für unterschiedliche Zelltypen (durch entsprechendes Ändern des Zellkulturprotokoll, Überzug Verfahren und die angeforderte für Zellaussaat und Proliferation) und verschiedene Stimulationsprotokolle (Lichtwellenlänge, Frequenz und Dauer Reize, Photoanregung Dichte).
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Protocol
1. Herstellung von Photoaktive Substrate
- Vorbereitung einer P3HT: PCBM Lösung (1: 1 w / w) in Chlorbenzol bei einem P3HT Konzentration von 20 g / L. Mische die Lösung mit einem Magnetrührer mindestens 4 Stunden bei 60 ° C. Betrachten wir ein Volumen von 150 ul der Lösung für jedes Substrat hergestellt werden soll.
- Sauberes ITO-beschichtete Glasobjektträger (R s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, Dicke 170 um) mit aufeinanderfolgenden Bädern von entionisiertem Wasser, Aceton und Isopropanol in ein Ultraschallbad (10 Minuten für jeden Schritt). Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Stickstoff-gun. Setzen Sie die Proben in einem Plasma cleaner bei 100 W Leistung für 10 min.
- Abzuscheiden einen dünnen Film der aktiven Schicht auf den gereinigten Substraten durch Spin-Beschichtung.
- Mit einer Diamantspitze, schneiden ein Mikroskopglasträger (Dicke ≈ 1 mm), um den gleichen lateralen Abmessungen der ITO-beschichteten Substrate. Entfernen Sie die P3HT: PCBM-Lösung von der Heizplatte und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen.
- Stellen Sie eine Zwei-steps Spincoater Programm: i) 30 Sekunden bei 800 Umdrehungen pro Minute; ii) 30 sec bei 1600 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie die Folie auf dem Spannfutter der Spin-Coater und starten Sie das Vakuum, um es zu beheben. Einen Tropfen Aceton auf der Folie und dann das gereinigte Substrat, wobei die ITO-beschichtete Seite nach oben. Starten Sie den Spin-Coater Drehung des überschüssigen Aceton loszuwerden.
- Setzen Sie 150 ul P3HT: PCBM-Lösung auf den Substraten und starten erneut die Spin-Coater (verwenden Sie in 1.3.2 beschrieben das gleiche Protokoll).
- Nach dem Schleuderbeschichtungsvorrichtung beendet ist, entfernen Sie die Probe und vorsichtig lösen das beschichtete Substrat aus dem Glasobjektträger. Reinigen Sie die Rückseite des Substrats mit einer Reinraum-Tupfer in Aceton getaucht.
Hinweis: Die photoaktiven Substraten kann für ein paar Tage in einem dunklen Kasten gelagert werden, bis sie verwendet. Für längere Zeiträume, halten sie in einem Handschuhfach mit Inertgas.
2. Herstellung von Zellkulturmedium Electrophysiology Lösungen
- Bereiten Sie die komplette Wachstumsmedium (CGM) fürHEK-293-Zellen: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) nicht hitzeinaktiviert, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Sterilisieren des Mediums mit einem 0,2 & mgr; m-Filtersystem und bei 4 ° C.
- Bereiten Sie den extrazellulären Lösung in ultrareinem Wasser (Konzentration in mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glucose, 1,8 CaCl 2, 1 MgCl2. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,2 & mgr; m-Filtersystem und bei 4 ° C.
- Vorbereitung der intrazellulären Lösung in ultrareinem Wasser (Konzentration in mM): 12 KCl, 125 K-Gluconat, 1 MgCl 2, 0,1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Beachten Sie, dass ATP-Na 2 ist hitzeempfindlich und letzten hinzufügen. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Sterilisieren der Lösung mit einem 0,2 & mgr; m-Filtersystem, aliquoten in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C.
3. Überzug HEK-293 Zellenauf die aktive Untergründe
- Platzieren des photoaktiven Substrat in einem Becherglas mit Aluminium oder einer verschlossenen Petrischale abgedeckt und in einen Ofen gegeben bei 120 ° C für 2 h zur Sterilisation. Von diesem Zeitpunkt an, führen alle Operationen unter sterilen Bedingungen. Setzen Sie die Proben in einem sterilen Haube und lassen Sie sie abkühlen.
- Beschichten des photoaktiven Substrat mit einer Haftschicht, um die Oberflächenhydrophobie zu vermindern und die Zelladhäsion fördern.
- Legen Sie die aktiven Substraten in einer P35 Petrischale oder ein 6 Multiwellplatte. Angesichts der Hydrophobie der konjugierten Polymerschicht, stellen ein Polydimethylsiloxan (PDMS) auch, um die Probe zu fixieren und beschränken die Lösungen.
- Mischungs PDMS und Katalysator in einem 10: 1-Verhältnis mit einem Glasstab, um eine viskose Aufschlämmung zu erhalten.
- Gießen der Aufschlämmung in eine Multiwell-Platte 6, Abgeben einer ausreichenden Menge, um die Hälfte der Vertiefungen bedecken.
- Warten PDMS Polymerisation bei RT.
- Schneiden Sie die gehärtete PDMS in der Mitte für OBTAining eine quadratische Form mit den gleichen Abmessungen der Polymerprobe.
- Sterilisieren PDMS Vertiefungen durch Eintauchen in eine 70% Ethanol-Wasser-Mischung für mindestens 30 min.
- Wenn mit den PDMS gut, Kratzer auf der photoaktiven Schicht entlang der gesamten Grenze zwischen dem mit spitzen Pinzette, um die Ablösung der gesamten Schicht zu vermeiden, wenn das Entfernen der PDMS auch nach Zellkultivierung.
- Decken die gesamte Oberfläche jeder Probe mit einer Fibronektin-Lösung (2 mg / l in PBS). Ein Volumen von 500 bis 750 & mgr; l pro Probe ist normalerweise ausreichend, wenn ein PDMS auch verwendet wird (klare Oberfläche der Wanne: 15x15 mm 2). Ohne die PDMS gut, sind notwendig, um die Probe vollständig einzutauchen etwa 2 ml Fibronektin-Lösung; darauf achten, dass das Substrat nicht zu schweben, während die Zugabe der Lösung. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für mindestens 1 Std.
- Entfernen Sie die Fibronektin-Lösung mit einer Glaspipette und einmal mit 2 ml PBS waschen.
- Legen Sie die aktiven Substraten in einer P35 Petrischale oder ein 6 Multiwellplatte. Angesichts der Hydrophobie der konjugierten Polymerschicht, stellen ein Polydimethylsiloxan (PDMS) auch, um die Probe zu fixieren und beschränken die Lösungen.
- Plaß HEK-293-Zellen an Fibronektin behandelten Proben mit einer Dichte von 15.000 Zellen / cm 2 in vollständigem Wachstumsmedium. Verwenden ein Volumen von 750-1.000 ul CGM für jede Probe, ob ein PDMS auch verwendet, ansonsten 2-3 ml CGM notwendig sind. Die Zellen für 24-48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
4. Optische Stimulation Protokoll und elektrophysiologische Messungen
- Setzen der extrazellulären Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C bis zu thermalisieren; tauen die intrazelluläre Lösung, steckte es in eine 1 ml-Spritze mit einer 34-Gauge-Nadel und halten Sie sie in Kontakt mit Eis, um den Abbau des ATP zu vermeiden.
- Werfen Sie einen Zell beschichtete Substrat aus dem Inkubator, sorgfältig Entfernen der PDMS auch, falls vorhanden. Entfernen Sie das Wachstumsmedium mit einer Glaspipette und spülen Sie die Probe mit extrazellulären Lösung. Gehen Sie langsam auf Zellablösung zu vermeiden.
- Legen Sie das Gerät in den Probenhalter des Elektrophysiologie-Station mit extrazellulären solution und die Referenzelektrode. Bereiten Sie frische Glasmikropipetten für Patch-Clamp mit einem Abzieher (ideal Widerstand im Bereich von 2-4 MOhm). Füllen Sie die Hälfte der Pipette mit intrazellulären Lösung und montieren es auf dem Mikromanipulator.
- Suchen Sie nach einer gesunden Zelle, um das Gerät zu patchen. Um unerwünschte Anregung des photoaktiven Substrats zu vermeiden, die IR-Beleuchtung für die Abbildung, indem ein Langwellenlängenpassfilter (zum Beispiel kann ein Kantenwellenlänge λ = 750 nm für Polymere absorbieren im sichtbaren verwendet werden) vor der Mikroskopleuchte.
- Patch die ausgewählte Zelle und wenden das gewünschte Protokoll für optische Stimulation durch Liefern Licht an die Probe über die Fluoreszenzanregung Gang des Mikroskops (1). Eine detaillierte Beschreibung der patch-clamp-Protokoll kann in dem Bezugszeichen 20 festgestellt werden.
- Positionieren Sie die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe zu der Zellmembran mit einem mikrometrischen Manipulator. Während der Positionierung gelten overpressure auf die Pipette, um Schmutz kleben an der Spitze zu vermeiden. Die Pipette sollte wenige Mikrometer über der Zelle sein.
- Starten Absenken der Pipette auf die Zellmembran, während die Pipette Widerstand auf der Patch-Steuerungssoftware. Wenn die Pipettenwiderstand hat etwa 1 M erhöht wird, entfernen Sie den Überdruck aus der Pipette, während eine sanfte Saugwirkung, um die undurchlässige Verbindung von der Pipette und der Zellmembran bilden (dh, der gemessene Widerstand sollte bei Werten zu erhöhen mehr als 1 G & Omega;) .
- Anwenden eines negativen Potentials an die Pipette in der Nähe der erwarteten Zellenruhepotential (für HEK293-Zelle ein Potential von -40 mV verwendet werden kann), um die Stabilisierung der Dichtung. Kompensation der kapazitiven Transienten aufgrund der Pipette Kapazität mit den relativen Befehle auf der Patch-Verstärker und / oder dem Patchsteuerungssoftware.
- Brechen Sie die Membran in elektrische Zugang zum Zytoplasma der Zelle durch Anlegen eines kurzen und intensiven Saugimpuls ermöglichenan der Pipette. Gesetzt den Patch Verstärker aktuellen Clamp-Modus (I = 0, das heißt, kein Strom in die Zelle injiziert), um den Zellmembranpotential verfolgen. Einige Minuten warten, um zu sehen, wenn die Zellspannung stabil ist.
- Bringen die gewünschten Beleuchtungsablauf zur Zelle und Aufzeichnung der Wirkung auf das Membranpotential.
Anmerkung: Die Beleuchtung kann auf die Probe entweder von unten oder von oben zugeführt werden, abhängig von der Mikroskop-Architektur.- Wählen einer Anregungswellenlänge, die auch von dem aktiven Material absorbiert wird; für die P3HT: PCBM Mischung kann eine Wellenlänge in dem 450-600 nm-Bereich verwendet werden. Geeignete Photoanregung Dichten liegen im Bereich von 10-100 mW / mm 2.
Anmerkung: Kurze Pulse von Licht (unterhalb 10-20 msec) führen zu einer vorübergehenden Depolarisation der Zelle, während bei längerem Beleuchtung (hundert Millisekunden oder mehr Impulse) eine anhaltende Hyperpolarisation beobachtet wird, bis das Licht ausgeschaltet wird.
- Wählen einer Anregungswellenlänge, die auch von dem aktiven Material absorbiert wird; für die P3HT: PCBM Mischung kann eine Wellenlänge in dem 450-600 nm-Bereich verwendet werden. Geeignete Photoanregung Dichten liegen im Bereich von 10-100 mW / mm 2.
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Representative Results
Zellen können auf P3HT leicht gezüchtet werden: PCBM Substrate, sofern eine geeignete Haftschicht abgeschieden wird (wie das in Schritt 3.2 der beschriebenen Protokoll verwendet Fibronektin). P3HT: PCBM optischen Absorptionsmaxima im grünen Teil des sichtbaren Spektrums; aber andere lichtempfindliche konjugierte Polymere können ausgewählt werden, gemäß der bevorzugten Photowellenlängen-Bereich (Abbildung 2). Biokompatibilität dieser Substrate wurde gezeigt, nicht nur mit Zelllinien 18,21, wie HEK-293, sondern auch mit Primärkulturen von Neuronen und Astrozyten 17 15 Eine typische Mikrograph von gesunden HEK-293-Zellen auf einem P3HT kultiviert. PCBM Film gezeigt wird in 3. Optische Stimulation der Zellen durch die photoaktive Substrate vermittelt kann auf unterschiedliche Effekte auf die Zellmembran 18 beim Einsetzen des Lichtimpulses, die in Abhängigkeit von der Dauer der Lichtreiz., aschnelle Dorn (mit einer Intensität von etwa 3 mV und einer Dauer von etwa 1 ms) in den Zellmembranpotential Aufnahmen (4) beobachtet werden. Dieses Signal ist auf eine kapazitive Ladung der Polymer / Elektrolyt-Grenzfläche, auf die Ladungserzeugungs in dem aktiven Material.
Nach dieser anfänglichen schnellen Spiking, wird eine vorübergehende Depolarisation (mit einer Intensität von etwa 1 mV und einer Dauer in der Größenordnung von zehn Millisekunden) in der Zelle (4) beobachtet. Für kurze Lichtimpulse, wenn das Licht ausgeschaltet ist, wird ein entgegengesetztes Verhalten beobachtet. Diese Signale zu einer Variation Membrankapazität aufgrund lokaler Erwärmung folgenden Lichtabsorption zugeschrieben.
Für längere Beleuchtungs jedoch die anfängliche Depolarisation während der Lichtpulse wird zu einer Zellhyperpolarisation (Abbildung 5). Dieses Phänomen hat einegewinnen einen thermischen Ursprungs, aber in diesem Fall wird es zu einer Veränderung der Membrangewichtspotential aufgrund einer Änderung in der Ionenkanäle Leitfähigkeiten durch die erhöhte Temperatur induziert verwandt.
Figur 1 Skizze der photoaktiven Substrat. Die photoaktiven Schnittstellen für zellulare optische Stimulation verwendet werden, aus einem dünnen Film eines organischen Halbleiter auf einem ITO-beschichteten Glassubstrat abgeschieden ist. Die Zellen können direkt auf die Geräteoberflächen gewachsen, nachdem es mit einem geeigneten Haftschicht (zB Fibronektin) behandelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Absorption Spektren von verschiedenen konjugierten Polymeren. Die Verwendung von dünnen Schichten organischer Halbleiter können große Abstimmbarkeit in Anregungswellenlänge ermöglichen unter Beibehaltung einer teilweisen Durchsichtigkeit des Substrats. Als Beispiel wird die Absorptionsspektren der verschiedenen konjugierten Polymeren in der Regel in der Photovoltaik eingesetzt werden gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 HEK-293 Zellen auf einem photoaktiven Substrat kultiviert. Typische mikroskopische Aufnahme von HEK-293-Zellen auf der Oberfläche eines photoaktiven Substrat nach 24 h Inkubation kultiviert. Maßstabsleiste, 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Optische Stimulation von HEK-293 Zellen mit 20 msec Lichtimpulse. Variation des Membranpotentials einer HEK-293-Zellen mit einem 20 msec Lichtimpuls hervorgerufen wird. Eine anfängliche schnelle Spitze beim Einsetzen des Lichts wird durch eine Depolarisation der Zelle während des Impulses folgt. Als das Licht ausgeschaltet ist, ein entgegengesetztes Verhalten beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5. Optische Stimulation von HEK-293-Zellen mit 200 msec Lichtimpulse. Variation des Membranpotentials einer HEK-293-Zelle, die durch ein 200 msec Lichtimpuls hervorgerufen wird. Die für kurze illum beobachtet anfängliche Depolarisationination ist nur ein vorübergehendes Phänomen, das nach einigen zehn Millisekunden längerer Beleuchtung verwandelt sich in eine Hyperpolarisation der Zelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritischen Schritte der gemeldeten Protokoll für in-vitro optische Stimulation von Zellen die Wahl des lichtempfindlichen Polymers, der thermischen Sterilisationsparameter, die Intensität und die Dauer der Lichtreize hauptsächlich betreffen. Eine P3HT: hier wurde PCBM dünnen Film ausgewählt, weil es eine gute zeitliche und elektrochemische Stabilität garantiert. Allerdings sollte man beachten, dass nicht alle lichtempfindliche Polymere können analoge Leistungen insbesondere bei Beleuchtung bieten, 22. Darüber hinaus wird in diesem Fall ausgewählt thermischen Sterilisationsparameter nicht zu beträchtlichen Abbau der Polymeroptoelektronischen Eigenschaften führen; man aber durch den, falls das Sterilisationsverfahren oder dem Wärmebehandlungsparameter geändert werden, möglich, Effekte auf die Polymereigenschaften sollten sorgfältig abgewogen werden. Es ist bekannt, zum Beispiel, dass die UV-Belichtung führt schnell zu irreversiblen Polymer Bleichen und Verschlechterung aufgrund von Verlust der Konjugation. Darüber hinaus verschiedene GlühenTemperaturen und Dauer kann auf verschiedenen morphologischen, um der Polymeroberfläche führen, mit negativen Auswirkungen auf die elektrischen Ladungstransporteigenschaften. Die Parameter der Photoanregung Protokoll sollte sorgfältig geprüft werden, sowie: Anregungsdichten oberhalb von 100 mW / cm 2, und / oder längerer Reize, leicht zu Polymerabbau und Ausfall des Photo Protokoll führen. Ein weiterer kritischer Schritt im Protokoll besteht in der Verwendung einer Protein-Haftschicht, durch die hohe Hydrophobie-Grad des P3HT: PCBM Oberfläche. Wenn keine Haftschicht in der Realisierung des Bio-Polymer-Grenzfläche, Zellbesiedelung und Proliferation eingesetzt könnte ernsthaft beschädigt ist.
Innerhalb der oben erwähnten kritischen Schritte und Einschränkungen jedoch das berichtete Protokoll kann ohne weiteres modifiziert werden, je nach den spezifischen experimentellen Anforderungen und Zielen. Andere stabile, lichtempfindliche Polymere, gefunden werden kann, 7 aus mehreren comkommerziellen Lieferanten oder durch geeignete Synthese neuer Verbindungen. Dies ermöglicht die Verwendung von unterschiedlichen Anregungswellenlängen, die sich vom blauen zur roten und NIR-Bereich. Darüber hinaus wird die Polymerabscheidungstechnik nicht auf die Schleuderbeschichtung Verwendung beschränkt. Tatsächlich können auch andere Verfahren Gewährleistung guter Homogenität und geeignete Filmdicke in Betracht gezogen werden, wie Tintenstrahldruck, Sprühbeschichtung oder Beschaufelung Die Auswirkungen der längeren Kontakt mit der Zellkultursubstrate und der Sterilisationsverfahren sollte für jeden neuen Materials ausgewertet werden berücksichtigt. Obwohl die Verwendung von Protein Haftschichten ist notwendig, um eine gute Zellkulturen auf der Oberseite der Polymeroberflächen, die spezifische Verwendung von Fibronektin enthalten, wie hier berichtet, ist nicht zwingend. Verschiedene Adhäsionsprotein Schichten verwendet werden, ebenfalls in Übereinstimmung mit der Zelllinie zu wachsen, 21 sind beispielsweise Nervenzellen in der Regel auf einem Poly-L-Lysin-Schicht gezüchtet. Schließlich können Beleuchtungs Protokolle verändert und angepasst, um specific Bedürfnisse in Bezug auf Wellenlänge, Punktgröße, Stromanregungsdichte, Dauer und Häufigkeit Reize, Lichteinfallsrichtung (aus dem Substrat bzw. aus dem Elektrolyt-Bad). Wie oben kurz erwähnt, aber die Definition der Protokollparameter zu berücksichtigen, die das Polymer optischen Absorptionsbereich und mögliche Abbaueffekte, die eine Menge von Fall zu Fall unterschiedlich sein kann zu nehmen.
Die begrenzte zeitliche und elektrochemische Stabilität einiger lichtempfindlichen Polymeren stellt tatsächlich die wichtigsten Grenzen der Technik. Zusätzlich kann die Verwendung von handelsüblichen Polymeren ohne weitere Reinigung in einigen Fällen beschränkt Wiederholbarkeit der Ergebnisse zwischen verschiedenen Chargen des Materials aufgrund unterschiedlicher Reinheitsgrad führt.
Wir auch feststellen, dass die genauen Mechanismen auf der Basis des Phototransduktion Wirkung in CSPP Protokolle müssen noch näher erläutert werden und charakterisiert. Thermischen, elektrischen und chemischen phenomena sind möglicherweise beteiligt sind, bei unterschiedlichem Ausmaß in verschiedenen biologischen Modellen. Ein vollständiges Verständnis ist der Schlüssel, um die Technik voll ausschöpfen zu können. Insbesondere sollte das Auftreten von Wärme-vermittelte Phänomene als Einschränkung der Technik im Fall von in vivo-Anwendungen überprüft werden, da sie kaum gesteuert werden kann, und kann eine lokale Überhitzung Wirkungen führen, insbesondere. Eine spezielle Implementierung der Vorrichtung, auf die Kontrolle der Wärmeverteilung in der extrazellulären Umgebung durch die richtige Konstruktion von wärmeleitenden Pfaden ausgerichtet, könnte notwendig in der nächsten Zukunft für die volle Ausnutzung der Technik offenbaren.
In der Literatur, verschiedene Techniken, die optische Impulse für die Temperatur-vermittelten Stimulation von Zellen und Geweben zu verwenden, sowohl in-vitro und in-vivo gefunden werden. In diesen Studien wird die Absorption von IR-Laserstrahlen, die durch Wasser in der Regel als Übertragungsmechanismus verwendet wird. 23-25 Bezug auf InfrarotNeuronale Stimulation, hat das CSPP Mechanismus deutliche Vorteile, insbesondere für in-vitro Experimente. CSPP auf Licht im sichtbaren Bereich und mittlerer Intensität basiert, so dass die Stimulation durch den Anregungspfad eines Standard-Fluoreszenzmikroskop zur Verfügung gestellt werden. Im Gegenteil, die Wasserabsorption erfordert Wellenlängen im IR (hauptsächlich um 1,45 & mgr; m und 1,93 & mgr; m), die zu der Probe über externe Quellen, wie optischen Fasern in der Nähe des Vorbereitungs mikromanipulierter zugestellt werden müssen, da die optische Bahn eines Standard Mikroskop kann zu solchen Wellenlängen verwendet werden. Im Fall von CSPP können die mit Laser-Scanning-Systeme sowie die räumliche Lichtmodulatoren erhaltenen Lichtmuster direkt an den Strahlengang der meisten Mikroskope gekoppelt werden. Auf diese Weise kann die Photostimulation von Substraten auf Basis von organischen Halbleitern ist es möglich, die Stimulation von mehreren Zellen in dem Sichtfeld unabhängig zu erhalten, wobei sowohl eine hohe zeitliche nd räumlicher Auflösung.
Eine weitere, sehr wertvolle Alternative für die optische Stimulation durch genetische Methoden angeboten werden, basierend auf anzielbare Expression von gentechnisch photoaktivierbare Sonden in Zellen. Optogenetik bietet heutzutage beispiellose zeitliche und räumliche Auflösung, mit typischen Beleuchtungsstärken im Bereich von einigen zehn mW / mm 2, kann sowohl zu erregen und hemmen die elektrische Aktivität und kann genetisch bestimmte Subpopulationen von bestimmten Hirnregionen von Interesse ausgerichtet sein. Allerdings noch stellt sie einige Probleme, die gelöst werden müssen. Insbesondere Sicherheitsbedenken in Bezug auf die Verwendung von Viren zur Genexpression, vor allem bei Menschen, und das Erreichen der stabilen und kontrollierten Langzeit die heterologe Proteinexpression noch stellen die großen Herausforderungen. CSPP Technik erlaubt es, die Notwendigkeit für den Gentransfer und alle damit verbundenen Sicherheitsprobleme, die in-vivo-Anwendungen von besonderer Relevanz sind, zu umgehen.
jove_content "> Alles in allem bietet das CSPP Verfahren mehrere Vorteile gegenüber endogenen Phototechniken. Da es nicht invasive, kann es leicht an jede vorhandene elektrophysiologischen Arbeitsstation gekoppelt werden, und es muss nicht komplex Laserquellen oder genetische Transfektion erfordern, während Beibehaltung hoher räumlicher und zeitlicher Selektivität. Aus diesen Gründen hält CSPP Versprechen, ein ergänzendes Instrument in den Neurowissenschaften in-vitro-Untersuchungen jedoch zu werden und neue Perspektiven in der in-vivo-Anwendungen zu öffnen., eine große Anstrengung von der Materialwissenschaften, Physik und Ingenieurwissenschaften Gemeinden wird in den kommenden Jahren, benötigt, um zu suchen, zu optimieren und die Technik voll ausschöpfen zu erwarten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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