Introduction
Muligheten for å manipulere den cellulære aktivitet med en nøyaktig romlig og tidsmessig oppløsning er en viktig strategi i nevro undersøkelser og ved behandling av nevrologiske og psykiatriske forstyrrelser. 1 Tradisjonelle metoder er basert på elektrisk stimulering av celler ved hjelp av elektroder som er plassert i umiddelbar nærhet av eller i kontakt med målrettet system, 2 som kan være av forskjellig kompleksitet (enkeltcelle, mobilnettverk, hjerneskiver, in-vivo hjernevev). I løpet av det siste århundret, har bruk av patch-clamp, metall og substrat-integrerte elektroder gitt et detaljert bilde av fysiologi og patofysiologi av enkeltnerveceller og av de fungerende mekanismer for nevrale nettverk. Imidlertid lider elektrisk stimulering av viktige begrensninger. Den første som er knyttet til et generelt dårlig romlig oppløsning på grunn av de fysiske dimensjoner av elektrodene og deres faste geometri, som ikke lett kan tilpassestil komplekse organiserte systemer som biologiske vev. Også problemer knyttet til elektrodene impedans og av krysstale mellom stimulering og registreringssystemer kan forringes det endelige signal-til-støy-forholdet av målingene. 3 På den annen side kan bruk av lys for stimulering bidra til å overvinne mange begrensninger av det elektriske opplegget. Først av alt, det gir enestående romlig (<1 mm) og tidsmessig oppløsning (<1 msek), noe som gjør det mulig å målrette spesifikke celletyper eller til og med sub-cellekamre. I tillegg er det sterkt ikke-invasiv ettersom den unngår noen fysisk kontakt med vevet av interesse og disentangles stimulering av opptak. Videre kan både lys intensitet og bølgelengde reguleres nøyaktig, og således forskjellige stimuleringsregimer kan brukes. 3,4
Men, det store flertallet av dyreceller ikke presentere noen spesiell følsomhet for lys. Flere strategier for optisk stimulation har derfor vært foreslått, enten utnytte lysfølsomme molekylære mediatorene i nærheten eller i cellene, eller ved hjelp av fotoaktive enhet plassert eksternt, i nærheten av cellen. Førstnevnte kategori viser til endogene mekanismer som stimulering via synlig eller infrarødt (IR) lys, så vel som anvendelse av enten photoisomerizable / photocleavable forbindelser eller genetisk ekspresjon av foto molekylære aktuatorer (optogenetics). Den sistnevnte klasse omfatter teknikker for eksogen stimulering oppnås med bruk av uorganiske nano / mikropartikler eller fotoledende silisium substrater. 5 Ikke desto mindre er alle disse systemer har klare sider og ulemper. Spesielt er endogen absorpsjon av celler i det synlige området svake og ikke pålitelig, og samtidig generering av reaktive oksygenarter kan være skadelige for cellen. Generelt er IR brukes til å indusere lokal termisk oppvarming på grunn av vannopptak, men ekstinksjonskoeffisient av vann er liten, og dermed krever strong infrarødt lys (fra titalls til hundrevis av W / mm 2) som er vanskelig å levere via standard mikroskop optikk og kan utgjøre sikkerhet bekymringer for i-vivo applikasjoner. På den annen side, foto vendbar sperre forbindelser har en tidsbegrenset virkning og krever ofte UV-lys som er vanskelig å levere på grunn av begrenset vevspenetrering. Dessuten lider de av diffusjon problemene med de aktiverte forbindelsene ved fotolyse utenfor det belyste området. Endelig har optogenetic verktøy tillatt forskere å målrette bestemt cellulær undergruppe og underrommene og er raskt voksende som en av de viktigste teknologiene i nevrovitenskapelig forskning. Men å sette inn et eksogent DNA segment via en viral vektor reiser viktige sikkerhetsspørsmål, spesielt med tanke på adopsjon på menneskelige pasienter. 5,6 Av disse grunner, er forskning på nye materialer og utstyr som kan cellen optisk manipulasjon en ekstremt hett tema.
Nylig har en nytilnærming basert på bruk av lysfølsomme konjugerte polymerer, i stand til effektivt å omsette en optisk stimulus til en modulering av celle elektrisk aktivitet, har vært foreslått. The Cell Stimulering av Polymer foto-(CSPP) teknikk utnytter mange viktige aktiverer har typisk av organiske halvledere: de er egentlig følsom for lys i det synlige området, 7 de er biokompatible, myk og formbar, og deres mekaniske fleksibilitet tillater en intim grensesnitt med vev både in-vitro og in-vivo 8-10. Bortsett fra det, kan de lett funksjon å bedre tilpasse seg grensesnittet med levende celler, og for å aktivere bestemte eksitasjon, sondering og sensing evner. 11,12 Videre støtter de elektroniske samt ionisk transport, noe som gjør dem ideelle for kombinasjonen av elektronikk annonsen biologi. 13,14 Interessant, kan de jobbe i photovoltaic modus, unngå behovet for å bruke en ekstern skjevhet feller effektiv celle optiske stimulering. 15
Påliteligheten av CSPP teknikken har tidligere blitt vist i flere systemer, inkludert primær nevroner, 15,16 astrocytter, 17 sekundære cellelinjer 18 og eksplanterte retinal vev. 16 I dette arbeidet, alle de nødvendige skritt for å dikte opp en lysfølsom bio-polymer grensesnitt 19 for optisk stimulering av in-vitro-system er beskrevet i detalj. Som en studie tilfelle, en prototypisk organisk fotoelektrisk blanding av region-faste poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), som fungerer som elektrondonor, og fenyl-C61-smør-syre-metylester (PCBM), som virker som den elektron akseptor anvendes. Som det biologiske system, er humane embryonale nyre (HEK-293) celler anvendt. Et eksempel på en protokoll photostimulation med den relative opptak av celleaktivitet via elektrofysiologiske målinger er gitt.
Den beskrevne plattformer imidlertid av generell gyldighet, og det kan lett utvides til anvendelsen av andre konjugerte polymerer (ved riktig justering av løsningen fremstillingsprosessen og avsetningsparametrene), forskjellige celletyper (ved passende å endre celledyrkingsprotokollen, plating prosedyre og tid ønskede for celle seeding og spredning) og ulike stimulerings protokoller (lys bølgelengde, stimuli hyppighet og varighet, foto-tetthet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av fotoaktive Underlag
- Tilbered en P3HT: PCBM-løsning (1: 1 w / w) i klorbenzen ved en P3HT konsentrasjon på 20 g / l. Blande oppløsningen med en magnetisk rører i minst 4 timer ved 60 ° C. Betrakt et volum på 150 ul oppløsning for hvert substrat som skal fremstilles.
- Rene ITO-belagte glassplater (R s = 10 Ω / kvadrat, 18x18 mm 2, tykkelse 170 pm) med påfølgende bad av avionisert vann, aceton og isopropanol i en sonikator (10 min for hvert trinn). Tørk Dekk med nitrogen pistol. Sett prøvene i en plasma-vasker ved 100 W effekt i 10 min.
- Avsette en tynn film av det aktive laget på de rensede substratene via spin-coating.
- Med en diamant spissen, klippe et mikroskop glass slide, (tykkelse ≈ 1 mm) til de samme side dimensjonene av ITO-belagte substrater. Fjern P3HT: PCBM løsning fra kokeplaten og la den avkjøles til romtemperatur.
- Sett en to-steps spin-coater program: i) 30 sek ved 800 rpm; ii) 30 sek ved 1600 rpm. Plasser lysbildet på chuck av spin-coater og starte vakuum for å fikse det. Sett en dråpe aceton på lysbildet og deretter rengjøres underlaget, med ITO-belagt side vendt oppover. Start spin-coater rotasjon for å bli kvitt overflødig aceton.
- Sett 150 ul P3HT: PCBM løsning på underlag og starte på nytt spin-belegger (bruke samme protokoll beskrevet i 1.3.2).
- Etter spin-coater er ferdig, tar prøven og forsiktig løsne belagt substrat fra glass lysbilde. Rengjør iden av underlaget med et renrom dott dyppet i aceton.
Merk: fotoaktive underlag kan lagres for noen dager i en mørk boks til det brukes. For lengre perioder, holde dem i et hanskerom med inert gass.
2. Utarbeidelse av cellekulturmedium og elektrofysiologi Solutions
- Klargjør komplett vekstmedium (CGM) forHEK-293-celler: Dulbeccos Modified Eagle 's Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ikke varme-inaktivert, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Sterilisere medium med en 0,2 mikrometer filtreringssystem og oppbevares ved 4 ° C.
- Forbered ekstracellulære løsningen i ultrarent vann (konsentrasjoner i mm): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 Hepes, 10 glukose, 1,8 CaCI2, en MgCI2. Juster pH til 7,4 med NaOH. Sterilisere løsning med en 0,2 mikrometer filtreringssystem og oppbevares ved 4 ° C.
- Fremstille den intracellulære løsning i ultrarent vann (konsentrasjoner i nM): 12 KCl, 125 K-glukonat, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Merk at ATP-Na 2 er varmefølsomt og legge den siste. Juster pH til 7,4 med NaOH. Sterilisere løsning med en 0,2 mikrometer filtreringssystem, delmengde i 1 ml rør og oppbevares ved -20 ° C.
3. plating HEK-293 cellerpå den aktive Underlag
- Plasser den fotoaktive substratet i et glassbeger tildekket med aluminium eller en lukket petriskål og satt i en ovn ved 120 ° C i 2 timer for sterilisering. Fra dette øyeblikk og fremover, utføre alle operasjoner i sterile forhold. Sett prøvene i en steril hette og la dem avkjøles.
- Belegge den fotoaktive substratet med et klebesjikt for å redusere overflate hydrofobisitet og for å fremme celleadhesjon.
- Plasser de aktive substrater i en P35 petriskål eller en 6 multiwell plate. Gitt hydrofobisiteten til den konjugerte polymerlaget, gjør en polydimetylsiloksan (PDMS) vel for å løse prøven og begrenser løsningene.
- Bland PDMS og katalysator i et 10: 1 forhold med en glasstav for å oppnå en viskøs slurry.
- Helle oppslemmingen i et 6 flerbrønn plate, utlevering av en mengde som er tilstrekkelig til å dekke halvparten av hver brønn.
- Vent til PDMS polymerisering ved RT.
- Skjær speke PDMS i midten for obtaining en firkantet form på den samme dimensjonen av polymerprøve.
- Steriliser PDMS brønner ved neddykking i en 70% etanol-vann-blandingen i minst 30 min.
- Ved hjelp av PDMS godt, riper i fotoaktive lag langs hele grensen av brønnen med spisse pinsett, for å unngå løsgjøring av hele laget ved fjerning av PDMS godt etter celledyrking.
- Dekker hele overflaten av hver prøve med en fibronektin-oppløsning (2 mg / l i PBS). Et volum mellom 500-750 mL per prøve er vanligvis tilstrekkelig dersom en PDMS godt brukes (klar overflaten av brønnen: 15x15 mm 2). Uten PDMS vel, ca 2 ml fibronektinet løsning er nødvendig å fullstendig fordype prøven; være oppmerksom på at substratet ikke flyter under tilsetning av oppløsningen. Prøvene inkuberes ved 37 ° C i minst 1 time.
- Fjerne fibronektin løsning med en glasspipette og vask en gang med 2 ml PBS.
- Plasser de aktive substrater i en P35 petriskål eller en 6 multiwell plate. Gitt hydrofobisiteten til den konjugerte polymerlaget, gjør en polydimetylsiloksan (PDMS) vel for å løse prøven og begrenser løsningene.
- Plspiste HEK-293-celler på fibronektin-behandlede prøver ved en tetthet på 15.000 celler / cm2 i fullstendig vekstmedium. Bruke et volum på 750-1,000 ul av kontinuerlig glukosemåling for hver prøve hvis en PDMS godt benyttes, ellers 2-3 ml av kontinuerlig glukosemåling er nødvendig. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24-48 timer.
4. Optisk Stimulering protokoll og elektrofysiologiske målinger
- Sett ekstracellulære løsningen i et vannbad ved 37 ° C for å thermalize; tine den intracellulære løsning, legg den i en 1 ml sprøyte med en 34 gauge nål og holde den i kontakt med is for å unngå degradering av ATP.
- Ta en celle-belagt substrat fra inkubatoren, nøye fjerne PDMS godt hvis tilstede. Fjern vekstmedium med en glasspipette og skyll prøven med ekstracellulær løsning. Fortsett sakte for å unngå celle avløsning.
- Sett enheten inn i prøve-innehaveren av elektro stasjon med ekstracellulært løsning;n og referanseelektroden. Forberede ferske glass mikropipetter for patch-clamp med en avtrekker (ideell motstand er i området 2-4 Megohm). Fyll halvparten av pipette med intracellulære løsning og montere den på mikromanipluatoren.
- Se etter en frisk celle å lappe på enheten. For å unngå uønsket magnetisering av fotoaktive substratet ved å bruke IR-belysning for avbildning, å plassere en lang bølgelengde pass filter (for eksempel kan et kutt bølgelengde λ = 750 nm kan brukes for polymerer som absorberer i det synlige) foran mikroskopet illuminator.
- Patch den valgte cellen og anvende den ønskede optiske protokollen for stimulering ved å levere lys til prøven via fluorescenseksitasjon banen til mikroskop (figur 1). En detaljert beskrivelse av patch-clamp protokoll kan finnes i referanse 20.
- Plasser plasteret pipette i umiddelbar nærhet til cellemembranen med en micrometric manipulator. Under posisjonering, gjelder overpressure til pipetten for å unngå at smuss setter seg fast på spissen. Pipetten skal få mikrometer over cellen.
- Begynne å senke pipetten mot cellemembranen mens kontrollere pipette motstand på lappen kontroll programvare. Når pipetten motstanden har øket omtrent 1 Megohm, fjerne overtrykket fra pipetten, mens bruk av en svak suge, for å danne gigaseal mellom pipette og cellemembranen (dvs., bør den målte motstand øke til verdier som er større enn en GΩ) .
- Anvende et negativt potensial til pipetten nær den forventede cellehvilepotensialet (for HEK293 celle et potensial på -40 mV kan benyttes) for å bidra til å stabilisere tetningen. Kompensere de kapasitive transienter på grunn av pipetten kapasitans med de relative kommandoene på plasteret forsterker og / eller lappen kontrollprogramvare.
- Bryte membranen for å tillate elektrisk aksess til cellecytoplasmaet ved å bruke en kort og intens sugeimpulsentil pipetten. Still patch clamp forsterker til strømmodus (I = 0, det vil si, uten noen strøm som injiseres inn i cellen) for å spore cellemembranpotensialet. Vent i noen minutter for å se om den cellepotensialet er stabil.
- Bruke den ønskede belysnings protokollen til cellen og registrere effekten på membranpotensialet.
Merk: belysning kan leveres til prøven, enten fra bunnen eller fra toppen, avhengig av mikroskop-arkitektur.- Velg en eksitasjonsbølgelengde som absorberes godt av det aktive materiale; for P3HT: PCBM blanding, kan en bølgelengde på 450-600 nm range brukes. Egnede foto-densiteter ligger i området 10-100 mW / mm 2.
Merk: Korte pulser av lys (under 10-20 msek) resultat i en forbigående depolarisering av cellen, mens med langvarig belysning (hundrevis av millisekunder eller lengre pulser) en vedvarende hyperpolarization er observert før lyset er slått av.
- Velg en eksitasjonsbølgelengde som absorberes godt av det aktive materiale; for P3HT: PCBM blanding, kan en bølgelengde på 450-600 nm range brukes. Egnede foto-densiteter ligger i området 10-100 mW / mm 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler kan lett dyrkes på P3HT: PCBM underlag, forutsatt at et passende klebesjikt er avsatt (som fibronektin benyttet i trinn 3.2 i den beskrevne protokoll). P3HT: PCBM optisk absorpsjonstopper i den grønne delen av det synlige spekteret; men andre lysfølsomme konjugerte polymerer kan velges i henhold til den foretrukne photostimulation bølgelengder område (figur 2). Biokompatibilitet av disse substrater er blitt demonstrert ikke bare med cellelinjer 18,21 som HEK-293, men også med primære kulturer av neuroner og astrocytter 17 15 En typisk mikrofotografi av sunne HEK-293-celler dyrket på et P3HT. PCBM film er vist i Figur 3. Optisk stimulering av celler formidlet av de fotoaktive substrater kan resultere i forskjellige virkninger på cellemembranen, avhengig av varigheten av lyset stimulus. 18 Ved start av lyspulsen, enfast pigg (med en intensitet på omtrent 3 mV og en varighet på omtrent 1 millisekunder) kan observeres i cellemembranen potensielle opptak (figur 4). Dette signalet er på grunn av en kapasitiv ladning av polymer / elektrolytt-grensesnittet ved ladningsdannelse i det aktive materiale.
Etter denne innledende rask spiking, er en transient depolarisering (med en intensitet på omtrent 1 mV og en varighet av størrelsesorden titalls millisekunder) observert i cellen (figur 4). For korte pulser av lys, som lyset er slått av, er en motsatt oppførsel observert. Disse signalene har blitt tilskrevet en variasjon i membran kapasitans på grunn av lokal oppvarming følgende lysabsorpsjon.
For langvarig belysning, men viser den innledende depolarisering under lyspulsene inn i en cellehyperpolarisering (figur 5). Dette fenomenet har enfå en termisk opprinnelse, men i dette tilfellet er det relatert til en variasjon av membranlikevektspotensialet på grunn av en endring i ionekanaler konduktiviteter induseres av øket temperatur.
Figur 1. Skisse av den fotoaktive substratet. De fotoaktive grensesnitt som brukes for cellenes optiske stimulering er laget av en tynn film av organiske halvledere avsatt på en ITO-belagt glass substrat. Celler kan dyrkes direkte på overflater enheten etter at den har blitt behandlet med en egnet vedheft lag (f.eks fibronektinet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Absorp sjon spektra av forskjellige konjugerte polymerer. kan Bruken av tynne filmer av organiske halvledere tillate stor tunability i eksitasjonsbølgelengden og samtidig beholde en delvis transparens av substratet. Som et eksempel, absorpsjon spektra av ulike konjugerte polymerer som vanligvis brukes i solceller blir rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. HEK-293-celler dyrket på et fotoaktivt substrat. Typiske mikrofotografi av HEK-293-celler dyrket på overflaten av et fotoaktivt substrat etter 24 timers inkubering. Scale bar, 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Optisk stimulering av HEK-293-celler med 20 msek lyspulser. Variasjon av membranpotensialet i en HEK-293 celle-fremkalt ved en 20 ms puls av lys. En innledende fast pigg ved utbruddet av lyset er etterfulgt av en depolarisering av cellen i løpet av pulsen. Som lyset er slått av, en motsatt atferd er observert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Optisk stimulering av HEK-293-celler med 200 msek lyspulser. Variasjon i membranpotensialet i en HEK-293 celle-fremkalt ved en 200 ms puls av lys. Den innledende depolarization observert for kort Illumination er bare et forbigående fenomen, som etter noen titalls millisekunder av langvarig belysning blir til en hyperpolarisering av cellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn av den rapporterte protokoll for in vitro-optiske stimulering av celler i hovedsak dreier seg om valget av lys-følsom polymer, det termiske steriliserings parametere, intensiteten og varigheten av lys stimuli. En P3HT: PCBM tynn film ble valgt her, siden det garanterer god tidsmessig og elektrokjemisk stabilitet. Imidlertid bør man legge merke til at ikke alle lysfølsomme polymerer kan tilby analoge forestillinger, 22 mer spesifikt ved belysning. I tillegg, i dette tilfellet valgte varmesterilisering parametre ikke fører til betydelig forringelse av polymer optiske egenskaper; se men som, i tilfelle steriliseringsmetoden eller den termiske behandlingsparametre endres, mulige virkninger på polymeregenskapene bør vurderes nøye. Det er kjent, for eksempel, raskt fører at UV eksponering for irreversible polymer bleking og nedbrytning på grunn av konjugering tap. Videre annerledes glødingtemperaturer og varighet kan føre til ulik morfologisk rekkefølgen av polymer overflaten, med negative effekter på de elektriske ladetransportegenskaper. Parametrene av foto-protokollen bør vurderes nøye også: eksitasjon tettheter over 100 mW / cm 2, og / eller langvarig stimuli, kan lett føre til polymer degradering og svikt i photostimulation protokollen. En annen kritisk trinn i protokollen består i bruk av et protein klebesjikt, på grunn av den høye graden av hydrofobisitet P3HT: PCBM overflate. Hvis ingen klebesjikt anvendes i realiseringen av bio-polymer-grensesnitt, celle såing og spredning kan bli alvorlig svekket.
Innenfor de ovennevnte kritiske trinn og begrensninger, men den rapporterte protokollen kan oversiktlig endret, i henhold til de spesifikke eksperimentelle behov og målsettinger. Andre stabile, lysfølsomme polymerer kan bli funnet, 7 fra flere comkommersiell leverandører eller ved riktig syntetisere nye forbindelser. Dette tillater bruk av forskjellige eksitasjonsbølgelengdene, som spenner fra blå til rød og NIR-serien. Videre er polymerdeponeringsteknikk ikke begrenset til anvendelsen spinnbelegging. Faktisk kan andre metoder som sikrer god homogenitet og egnet filmtykkelse tenkes, for eksempel blekk-jet utskrift, spray belegg, eller skøyter Virkningene av langvarig kontakt med celledyrkingsmedier og av steriliseringsmetode bør vurderes for hvert nytt materiale tatt i betraktning. Selv om bruken av proteinklebesjikt er nødvendig for å oppnå god cellekulturer på toppen av polymeroverflater, den spesifikke bruken av fibronektin, som rapportert her, er ikke obligatorisk. Forskjellige proteinklebesjikt kan anvendes, også i samsvar med cellelinjen for å vokse, 21 for eksempel, neuronale celler er vanligvis dyrket på en poly-L-lysin lag. Endelig kan belysnings protokoller endres og tilpasses specific behov, i forhold til bølgelengde, punktstørrelse, strømtetthet eksitasjon, tid stimuli varighet og hyppighet, lys som faller retning (fra substratet eller fra elektrolyttbadet). Som kort nevnt ovenfor, bør imidlertid definisjonen av protokollparameterne ta hensyn til polymeren optiske absorpsjon rekkevidde og eventuelle nedbrytende virkninger, som kan variere mye fra tilfelle til tilfelle.
Den begrensede tidsmessige og elektrokjemisk stabilitet av enkelte lysfølsomme polymerer faktisk representerer de viktigste begrensninger av teknikken. I tillegg kan bruk av kommersielle polymerer uten noen ytterligere rensing fører i noen tilfeller til begrenset repeterbarhet av resultater mellom ulike satser av det materiale som, på grunn av forskjellig renhetsgrad.
Vi merker også at de nøyaktige mekanismene ved foten av fototransduksjonskaskade effekt i CSPP protokoller fortsatt trenger å bli ytterligere belyst og karakterisert. Termiske, elektriske og kjemiske phenomena er muligens er involvert, i forskjellig grad i forskjellige biologiske modeller. En fullstendig forståelse vil være nøkkelen til å utnytte teknikken. Spesielt bør forekomsten av varme-mediert fenomener i tilfelle av in vivo anvendelser vurdert som en begrensning av teknikken, fordi det kan neppe kontrolleres, og kan føre til lokal overoppheting effekter, spesielt. En spesifikk implementering av anordningen, med sikte på å kontrollere varmen diffusjon i det ekstracellulære miljøet ved riktig konstruksjon av varmeledende baner, kan avdekke nødvendig i det neste fremtiden for den fulle utnyttelse av teknikken.
I litteraturen forskjellige teknikker som bruker optiske pulser for temperatur-mediert stimulering av celler og vev, både in-vitro og in-vivo kan bli funnet. I disse studiene, er absorpsjon av IR-laserstråler av vann vanligvis brukt som et transduksjons-mekanisme. 23-25 Med hensyn til infrarødNeural Stimulering har CSPP mekanismen forskjellige fordeler, spesielt for in-vitro-forsøk. CSPP er basert på lys i det synlige området og av moderat intensitet, slik at stimuleringen kan tilveiebringes ved eksitasjon banen til et standard fluorescensmikroskop. Tvert imot, krever vannabsorpsjon bølgelengder i IR (hovedsakelig rundt 1,45 um og 1,93 um), som må leveres til prøven via eksterne kilder som optiske fibre micromanipulated i nærhet av preparatet, siden det optiske tog av et standard mikroskop kan ikke brukes ved slike bølgelengder. I tilfelle av CSPP, kan lampemønstrene som oppnås med laserskannesystemer, så vel som de romlige lysmodulatorene være direkte koplet til det optiske tog av de fleste mikroskoper. På denne måten kan photostimulation substrater basert på organiske halvledere gjør det mulig å oppnå stimulering av flere celler i synsfeltet uavhengig av hverandre, med både høy tidsmessig en nd romlig oppløsning.
En annen svært verdifullt alternativ for optisk stimulering tilbys av genetiske metoder, basert på målrettbar uttrykk av genetisk photoactivatable sonder i cellene. Optogenetics tilbyr i dag enestående tidsmessig og romlig oppløsning, med typiske belysningsintensitetene i størrelsesorden noen få titalls mW / mm 2, kan både eksitere og inhibere elektrisk aktivitet, og kan være genetisk målrettes mot spesifikke undergrupper av spesifikke hjerneregioner av interesse. Men fortsatt presenterer det noen problemer som må løses. Spesielt sikkerhetsmessige bekymringer angående bruk av virus for genuttrykk, spesielt hos mennesker, og å oppnå stabil og kontrollert langsiktig heterologe protein uttrykk fremdeles representerer store utfordringer. CSPP teknikk gjør det mulig å omgå behovet for genoverføring, og alle relaterte sikkerhetsproblemer, som er spesielt relevant for in-vivo-applikasjoner.
jove_content "> Alt i alt, tilbyr CSPP metoden flere fordeler med hensyn til endogene photostimulation teknikker. Siden det ikke er invasiv, kan det være lett kobles til eksisterende elektroarbeidsstasjonen, og det krever ikke komplekse laserkilder eller genetisk transfeksjon, mens opprettholde høy romlig og tidsmessig selektivitet. Av disse grunner har CSPP løfte om å bli en utfyllende verktøy i nevrovitenskap in-vitro undersøkelser, og å åpne nye perspektiver i in-vivo-applikasjoner. Men en stor innsats fra materialvitenskap, fysikk og ingeniørfag lokalsamfunn er ventet i de kommende årene, for å avgrense, optimalisere og utnytte teknikken.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M.
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G.
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G.
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
