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Biology

पूरे प्रोटीन संतृप्ति mutagenesis पुस्तकालय के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च throughput अनुक्रमण

Published: July 3, 2016 doi: 10.3791/54119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

हम उच्च throughput अनुक्रमण के उपयोग प्रोटीन का व्यापक एकल साइट संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। महत्वपूर्ण बात है, इस दृष्टिकोण orthogonal प्राइमर जोड़े का उपयोग करता पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण मल्टीप्लेक्स। मंदिर-1 β-lactamase एम्पीसिलीन की एक चिकित्सकीय प्रासंगिक खुराक पर चयनित का उपयोग कर प्रतिनिधि परिणाम प्रदान की जाती हैं।

Introduction

Mutagenesis लंबे जैविक प्रणालियों और उनके विकास के गुणों का अध्ययन करने के लिए, और बढ़ाया या उपन्यास कार्यों के साथ उत्परिवर्ती प्रोटीन या जीवों का उत्पादन करने के लिए प्रयोगशाला में नियोजित किया गया है। जबकि प्रारंभिक दृष्टिकोण तरीकों जो जीवों में यादृच्छिक म्यूटेशन उत्पादन पर भरोसा किया, पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के आगमन के लिए सक्षम शोधकर्ताओं ने एक साइट विशेष ढंग से डीएनए के लिए चुनिंदा परिवर्तन, अर्थात्।, साइट निर्देशित mutagenesis 1,2 परिचय। मौजूदा तकनीक, आम तौर पर एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) में mutagenic ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का उपयोग कर के साथ, यह अपेक्षाकृत किसी जीन 3,4 में बना सकते हैं और म्यूटेशन की कम संख्या (जैसे।, बिंदु उत्परिवर्तन) का आकलन करने के लिए सरल है। यह कहीं अधिक कठिन है, लेकिन जब लक्ष्य दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, निर्माण और मूल्यांकन के लिए सभी संभव एकल साइट के (या उच्च आदेश) म्यूटेशन।

जबकि ज्यादा मीटर की बड़ी संख्या का आकलन करने के प्रयास में प्रारंभिक अध्ययन से पता चला हैजीन में utations, तकनीक का इस्तेमाल अक्सर श्रमसाध्य थे, उदाहरण के लिए स्वतंत्र रूप से बकवास शमन का उपयोग कर प्रत्येक उत्परिवर्तन के आकलन की आवश्यकता के लिए 5-7 तनाव, या सेंगर अनुक्रमण 8 की कम अनुक्रमण गहराई के कारण उनकी मात्रात्मक क्षमता में सीमित थे। इन अध्ययनों में इस्तेमाल की तकनीक काफी हद तक उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के उपयोग के तरीकों 9-12 द्वारा supplanted किया गया है। ये धारणात्मक सरल दृष्टिकोण म्यूटेशन की एक बड़ी संख्या को मिलाकर एक पुस्तकालय का निर्माण करना पड़ेगा, समारोह के लिए एक स्क्रीन या चयन करने के लिए पुस्तकालय subjecting, और फिर गहरे अनुक्रमण (अर्थात्।,> 10 6 अनुक्रमण के आदेश पर पढ़ता है) पुस्तकालय से पहले प्राप्त की और चयन के बाद। इस तरह, म्यूटेशन की एक बड़ी संख्या के प्ररूपी या फिटनेस प्रभाव, प्रत्येक उत्परिवर्ती की आबादी आवृत्ति में परिवर्तन के रूप में प्रतिनिधित्व, एक साथ और अधिक मात्रात्मक आकलन किया जा सकता है।

हम पहले एक भोला आदमी की शुरुआत की(। यानी, पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों) प्रोटीन में सभी संभव एकल एमिनो एसिड म्यूटेशन के पुस्तकालयों का आकलन करने, अनुक्रमण से अधिक समय लंबाई के साथ जीन को लागू करने के लिए Le दृष्टिकोण लंबाई 11,13 पढ़ें: पहला, प्रत्येक अमीनो एसिड स्थिति बेतरतीब है द्वारा साइट निर्देशित mutagenic पीसीआर। इस प्रक्रिया के दौरान, जीन कुल लंबाई अनुक्रमण मंच द्वारा समायोजित के साथ सटे पदों से बना समूहों में विभाजित है। प्रत्येक समूह के लिए mutagenic पीसीआर उत्पादों तब संयुक्त रहे हैं, और प्रत्येक समूह के लिए स्वतंत्र रूप से चयन और उच्च throughput अनुक्रमण के अधीन है। अनुक्रम और अनुक्रमण पढ़ें लंबाई में म्यूटेशन के स्थान के बीच एक पत्राचार बनाए रखने से, इस दृष्टिकोण को अधिकतम अनुक्रमण गहराई का लाभ दिया है। जबकि एक बस जैसे समूहों (एक मानक बन्दूक द्वारा में बंटवारे के बिना कम खिड़कियों में इस तरह के पुस्तकालयों अनुक्रम कर सकता है अनुक्रमण दृष्टिकोण), सबसे अधिक प्रकार के जंगली और इस प्रकार मीटर होगा प्राप्त पढ़ताअनुक्रमण throughput व्यर्थ की ajority (जैसे, एक 500 अमीनो एसिड प्रोटीन 100 अमीनो एसिड (300 बीपी) Windows में अनुक्रम की एक पूरी प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय के लिए, कम से कम 80% से कम पढ़ता जंगली प्रकार के अनुक्रम) हो जाएगा।

इधर, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उच्च throughput अनुक्रमण का इस्तेमाल करता है, ऊपर दृष्टिकोण (चित्रा 1 में उल्लिखित) का उपयोग। महत्वपूर्ण बात है, हम प्रत्येक दृश्य समूह है, जो उन्हें एक पुस्तकालय में मल्टिप्लेक्स जा करने के लिए अनुमति देता है, स्क्रीनिंग या चयन करने के लिए एक साथ अधीन बारकोड के पुस्तकालय क्लोनिंग की प्रक्रिया में ओर्थोगोनल प्राइमरों के उपयोग लागू करने, और गहरी अनुक्रमण के लिए तो डी-मल्टिप्लेक्स। चूंकि अनुक्रम समूहों स्वतंत्र रूप से चयन के अधीन नहीं हैं, इस काम का बोझ कम कर देता है और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक उत्परिवर्तन चयन का एक ही स्तर का अनुभव। मंदिर-1 β-lactamase, एक एंजाइम है जो करने के लिए उच्च स्तरीय प्रतिरोध प्रदानβ-lactam एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे।, एम्पीसिलीन) बैक्टीरिया में एक मॉडल प्रणाली 14-16 के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। एक प्रोटोकॉल ई में मंदिर-1 की एक पूरी प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय के आकलन के लिए वर्णन किया गया है एम्पीसिलीन की एक चिकित्सीय खुराक (50 माइक्रोग्राम / एमएल) 17,18 के लिए एक अनुमानित सीरम स्तर पर चयन के तहत कोलाई।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल की रूपरेखा के लिए चित्रा 1 देखें। कई कदम और प्रोटोकॉल में अभिकर्मकों सुरक्षा उपायों ( "चेतावनी" के साथ संकेत दिया) की आवश्यकता होती है। उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डाटा शीट से परामर्श करें। सभी प्रोटोकॉल कदम आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक कि अन्य संकेत दिया।

1. संस्कृति, मीडिया और प्लेटें तैयार

  1. तैयार है और 1 एल शुद्ध पानी, 100 मिलीलीटर सुपर इष्टतम शोरबा (सिसकी, 1 टेबल) autoclaving द्वारा बाँझ, 1 एल Luria-Bertani शोरबा (पौंड; तालिका 2) और एल 1 लेग अगर (3 टेबल)। अलग से तैयार है और तीन संस्कृति बोतल बाँझ प्रत्येक युक्त 1 एल पौंड
    नोट: के दौरान प्रोटोकॉल "पानी" संदर्भित करता है आटोक्लेव निष्फल शुद्ध पानी; सिसकी, पौंड और लेग-अगर आटोक्लेव निष्फल समाधान के लिए देखें।
  2. 70% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में 0.12 जी टेट्रासाइक्लिन हाइड्रोक्लोराइड भंग द्वारा एक 12 मिलीग्राम / मिलीलीटर Tet के शेयर तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग जीवाणुरहित4 डिग्री सेल्सियस प्रकाश से रक्षा की।
  3. 50 डिग्री सेल्सियस और फिर शांत करने के लेग अगर Tet शेयर के 1 मिलीलीटर (12 माइक्रोग्राम / एमएल Tet के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। पेट्री प्लेटें और शांत आरटी पर प्रकाश से सुरक्षित में डालो। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रकाश से रक्षा की।

2. पूरे जीन संतृप्ति mutagenesis लाइब्रेरी का निर्माण

नोट: प्राइमर; पूर्ण किए गए PCRs, प्रतिबंध हज़म और ligations; और शुद्ध डीएनए नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

  1. म्युटाजेनेसिस प्राइमरों डिजाइनिंग
    1. सभी संभव अमीनो एसिड के लिए प्रत्येक अमीनो एसिड स्थिति mutagenize करने के लिए, पूरक म्युटाजेनेसिस प्राइमरों की एक जोड़ी डिजाइन (भावना / आगे और antisense / रिवर्स) निम्नलिखित दिशा निर्देशों के साथ प्रत्येक अमीनो एसिड की स्थिति के लिए:
      1. बदलें कोडोन एमिनो एसिड के लिए इसी NNS (जहां एन सभी चार न्यूक्लियोटाइड अड्डों में से एक मिश्रण है और एस (सी) साइटोसिन का एक मिश्रण है और गुआनिन (G) है) रस्मी में और केंद्र द्वारा mutagenized किया जाना हैएर, प्रत्येक पक्ष पर लगभग 15 न्यूक्लियोटाइड से घिरे।
      2. सुनिश्चित करें 5 'और' 3 सी या जी में और है कि तापमान के पिघलने (टी एम) को समाप्त समाप्त हो जाती है कि लगभग 70 डिग्री 3 सी है। इन दिशा निर्देशों के अनुसार NNS म्युटाजेनेसिस प्राइमरों डिजाइन करने के लिए कम्प्यूटेशनल स्क्रिप्ट NNS_PrimerDesign.m (पूरक संहिता फ़ाइल देखें) का प्रयोग करें।
    2. एक वाणिज्यिक स्रोत से आदेश प्राइमरों। इस्तेमाल में आसानी के लिए, उन्हें 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में संश्लेषित है और 50 माइक्रोन के लिए पानी में पूर्व पतला, भावना म्युटाजेनेसिस प्राइमरों और एक अन्य antisense प्राइमरों युक्त प्लेटों में से एक सेट के साथ।
    3. पानी के साथ एक पिपेट बेसिन भरें और तीन 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर 263 कुओं के लिए 95 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। 96 अच्छी तरह प्लेटें पानी युक्त प्लेटों के आत्मीय कुओं को समझ में mutagenesis प्राइमरों युक्त से 5 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्राइमरों पतला 2.5 माइक्रोन के लिए 20 गुना।
    4. दोहरानाप्रोटोकॉल कदम 2.1.3 antisense म्युटाजेनेसिस प्राइमरों कमजोर करने के लिए।
  2. दो कदम पीसीआर साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा प्रत्येक अमीनो एसिड की स्थिति के लिए NNS उप पुस्तकालयों के संश्लेषण
    1. पहले दौर mutagenic PCRs प्रदर्शन करना। (; 526 PCRs की कुल भावना म्युटाजेनेसिस प्राइमरों प्राइमर AvrII_R के साथ रखा, और antisense म्युटाजेनेसिस प्राइमरों प्राइमर AatII_F के साथ जोड़ा) प्रत्येक म्युटाजेनेसिस प्राइमर के लिए, एक 25 μl पीसीआर प्रतिक्रिया टेम्पलेट और प्राइमरों AatII_F या AvrII_R रूप pBR322_AvrII प्लाज्मिड का उपयोग कर तैयार करते हैं। AatII_F और AvrII_R दृश्यों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
      1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तालिका 4 से अभिकर्मकों जोड़कर एक पीसीआर "मास्टर मिश्रण" तैयार करें। एक पिपेट बेसिन पर स्थानांतरण। तीन 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटों पर 263 कुओं के लिए 15 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें। 96 अच्छी तरह से आत्मीय कुओं को पतला भावना म्युटाजेनेसिस प्राइमरों युक्त प्लेटों से 10 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग मैंn पीसीआर प्लेटें।
      2. एक 96 अच्छी तरह से थाली मुहर के साथ प्रत्येक पीसीआर प्लेट कवर। 2 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
      3. thermocycler पीसीआर प्लेटों स्थानांतरण और निम्न कार्यक्रम चलाने: 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 20 चक्र: 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 20 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
      4. दोहराएँ प्रोटोकॉल 2.2.1.1 कदम - 2.2.1.3 96 अच्छी तरह से पतला antisense म्युटाजेनेसिस प्राइमरों युक्त प्लेटों के लिए।
    2. दूसरे दौर mutagenic PCRs प्रदर्शन करना। प्रत्येक अमीनो एसिड स्थिति के लिए, एक 25 μl पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग कर प्राइमरों AatII_F और AvrII_R, और मिश्रित तैयार करने और पतला एक टेम्पलेट (263 PCRs की कुल) के रूप में पहले दौर mutagenic पीसीआर उत्पादों।
      1. पानी के साथ एक पिपेट बेसिन भरें और तीन 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर 263 कुओं के लिए 198 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
      2. गठबंधन और पतला प्रत्येक अमीनो एसिड की स्थिति के लिए mutagenic पीसीआर उत्पाद 100 गुना करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करकेपहले स्थानांतरण 96 अच्छी तरह से पीसीआर पानी युक्त प्लेटों के आत्मीय कुओं को समझ में mutagenesis प्राइमरों से उत्पन्न पीसीआर उत्पादों युक्त प्लेटों से 1 μl। तब antisense म्युटाजेनेसिस प्राइमरों से उत्पन्न पीसीआर उत्पादों के लिए हस्तांतरण दोहराएँ।
      3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तालिका 5 से अभिकर्मकों जोड़कर एक पीसीआर "मास्टर मिश्रण" तैयार करें। एक पिपेट बेसिन पर स्थानांतरण। तीन 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटों पर 263 कुओं के लिए 24 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें। मिश्रित युक्त 96 अच्छी तरह से प्लेटों से 1 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें और पीसीआर प्लेटों में आत्मीय वेल्स को पहले दौर mutagenic पीसीआर उत्पादों पतला।
      4. एक 96 अच्छी तरह से थाली मुहर के साथ प्रत्येक पीसीआर प्लेट कवर। अपकेंद्रित्र में लगभग 200 2 मिनट के लिए XG। स्थानांतरण प्लेटों thermocycler और प्रोटोकॉल कदम 2.2.1.3 के रूप में ही कार्यक्रम चलाने के लिए।
    3. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा दूसरे दौर mutagenic PCRs के परिणामों का विश्लेषण।सुनिश्चित करें कि सभी उत्पादों सही आकार के होते हैं और उत्पादों contaminating के अनुपस्थित।
      1. 2x जेल लोडिंग डाई के 2 मिलीलीटर एक पिपेट बेसिन में जोड़े और फिर तीन 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर 263 कुओं के लिए 6 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। 96 अच्छी तरह से पीसीआर 96 अच्छी तरह से डाई युक्त प्लेटों के आत्मीय कुओं के लिए दूसरे दौर mutagenic पीसीआर उत्पादों युक्त प्लेटों से 6 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
      2. 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड (चेतावनी) के साथ एक 1.5% agarose जेल तैयार करें।
      3. प्रत्येक पंक्ति की पहली और आखिरी गलियों में लोड डीएनए सीढ़ी। तब प्रोटोकॉल कदम 2.2.3.1 से नमूने के 10 μl लोड करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
      4. 40 मिनट और एक यूवी transilluminator पर छवि के लिए 100 वी पर जेल चला।
      5. दोहराएँ प्रोटोकॉल कदम 2.2.3.2 - 2.2.3.4 जब तक सभी नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं।
    4. सही प्रत्येक NNS उप पुस्तकालय पीसीआर उत्पाद एक dsDNA quantitation अभिकर्मक का उपयोग कर की एकाग्रता को मापने।
      1. हस्तांतरणलगभग 15 मिलीलीटर ईबी एक पिपेट बेसिन के लिए बफर। तीन 96 अच्छी तरह से काले रंग की दीवारों, स्पष्ट नीचे परख प्लेटों पर 263 कुओं के लिए 49 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
      2. 96 अच्छी तरह से परख प्लेटों के आत्मीय कुओं के लिए हर दूसरे कदम पीसीआर उत्पाद (प्रोटोकॉल कदम 2.2.2) के 1 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
      3. 300 μl ईबी बफर में 2 एनजी / μl को लैम्ब्डा फेज डीएनए गिराए द्वारा एक डीएनए एकाग्रता मानक वक्र तैयार करें और फिर दस दो गुना dilutions (11 सांद्रता की कुल के लिए) बनाते हैं। पिछले चरण जो कोई नमूना शामिल है से 96 अच्छी तरह से परख प्लेटों में से एक की एक पंक्ति के पहले ग्यारह स्तंभों के लिए स्थानांतरण 50 μl; बारहवें स्तंभ के लिए ईबी बफर के 50 μl (रिक्त अभिकर्मक) जोड़ें।
      4. अभिकर्मक के 75 μl जोड़कर dsDNA quantitation अभिकर्मक तैयार एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (सामग्री की तालिका देखें), तो ईबी बफर के 15 मिलीलीटर जोड़ें। inverting ट्यूब द्वारा मिक्स और फिर एक पिपेट बेसिन के लिए स्थानांतरण। प्रकाश से अभिकर्मक की रक्षा।
      5. परख प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए तैयार dsDNA quantitation अभिकर्मक के 50 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स। 5 मिनट के प्रकाश से सुरक्षित लिए आरटी पर प्लेटें सेते हैं।
      6. एक microplate पाठक और मानक fluorescein तरंग दैर्ध्य (; 0.1 सेकंड उत्तेजना 485 एनएम, उत्सर्जन 520 एनएम) का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने की प्रतिदीप्ति उपाय।
      7. सभी नमूनों से अभिकर्मक खाली की प्रतिदीप्ति मूल्य घटाना। लैम्ब्डा फेज नमूनों की प्रतिदीप्ति माप से एक मानक वक्र उत्पन्न करता है। उनके संबंधित प्रतिदीप्ति माप और मानक वक्र का उपयोग कर प्रत्येक नमूने की एकाग्रता की गणना।
  3. चयन वैक्टर में NNS उप पुस्तकालयों की क्लोनिंग
    1. पांच NNS उप पुस्तकालय समूहों में प्रत्येक NNS उप पुस्तकालय पीसीआर उत्पाद के 100 एनजी मिक्स। 'निर्माताओं के निर्देश के बाद, एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर नमूने को साफ और फिर एक डी एस का उपयोग कर एकाग्रता को मापनेडीएनए quantitation अभिकर्मक।
      नोट: प्रत्येक समूह (NNS उप पुस्तकालय समूहों 1 मंदिर -1 अनुक्रम के साथ स्थान दिया गया है लगभग 53 सन्निहित अमीनो एसिड पदों से बना है - 5 पदों के शामिल हैं 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236, और 237 - 290, क्रमशः; Ambler एट अल 19 के अनुसार) नंबर।।
    2. प्रत्येक NNS उप पुस्तकालय समूह के लिए वैक्टर क्लोनिंग बनाएँ।
      1. टेम्पलेट (AatII_OP1_R pBR322_OP1 के साथ रखा, आदि) के रूप में AatII_OP5_R, और plasmids pBR322_OP1-5 - प्राइमरों AvrII_F और AatII_OP1_R का उपयोग कर तालिका 6 के अनुसार पाँच 100 μl PCRs तैयार करें।
      2. thermocycler और निम्न कार्यक्रम चलाने के लिए स्थानांतरण: 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 25 चक्र: 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 20 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1.5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। टी AatII_R और AvrII_F के दृश्यों के लिए सामग्री के लिए सक्षम देखें।
      3. 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड (चेतावनी) के साथ एक 1% agarose जेल तैयार करें।
      4. प्रत्येक पीसीआर नमूने के लिए 6x जेल लोडिंग डाई के 20 μl जोड़ें। डीएनए सीढ़ी के साथ जेल की पहली लेन लोड; प्रत्येक नमूने की पूरी मात्रा बोझ है, कम से कम नमूने के बीच अच्छी तरह से एक लंघन।
      5. 50 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चला।
      6. एक लंबे तरंगदैर्ध्य यूवी प्रकाशक (चेतावनी) का उपयोग कर जेल कल्पना। आबकारी ~ 3,500 बीपी पर पीसीआर उत्पाद युक्त स्लाइस; microfuge ट्यूबों को अलग करने के लिए स्थानांतरण। जेल स्लाइस -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      7. 'निर्माताओं के निर्देश के बाद, एक जेल निकासी किट और उपाय एकाग्रता एक dsDNA quantitation अभिकर्मक का उपयोग कर का उपयोग कर नमूने शुद्ध।
    3. दोनों NNS उप पुस्तकालय समूह (प्रोटोकॉल कदम 2.3.1) और क्लोनिंग वैक्टर (प्रोटोकॉल कदम 2.3.2), प्रतिबंध की स्थापना के लिए टी सक्षम 7 के अनुसार AatII और AvrII एंजाइमों के साथ हज़म। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 'निर्माताओं के निर्देश के बाद, एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर नमूने को साफ और फिर एक dsDNA quantita का उपयोग कर एकाग्रता को मापनेtion अभिकर्मक।
    4. आत्मीय प्रतिबंध पचा क्लोनिंग वेक्टर (pBR322_OP1 साथ NNS उप पुस्तकालय समूह 1, आदि) के साथ प्रत्येक प्रतिबंध पचा NNS उप पुस्तकालय समूह के लिए तालिका 8 निम्नलिखित सेट अप बंधाव प्रतिक्रियाओं। 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग प्रतिक्रियाओं को साफ; पानी के 20 μl के साथ डीएनए elute।
    5. पुस्तकालय के कुशल ई में शुद्ध बंधाव प्रतिक्रियाओं की सम्पूर्णता रूपांतरण electroporation द्वारा कोलाई कोशिकाओं।
      1. पिघलना electrocompetent ई कोलाई कोशिकाओं और फिर जगह कोशिकाओं और बर्फ पर शुद्ध बंधाव प्रतिक्रियाओं।
      2. स्थानांतरण 10 μl प्रत्येक शुद्ध बंधाव प्रतिक्रिया के लिए कोशिकाओं thawed और फिर electroporation क्युवेट के लिए स्थानांतरण। 1.8 केवी पर Electroporate।
      3. 1 मिलीलीटर सिसकी में resuspending द्वारा कोशिकाओं को ठीक। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      4. 990 μl पौंड में प्रत्येक वसूली संस्कृति के 10 μl Resuspend; पर लेग अगर प्लेट सी 100 μl फैलontaining 12 माइक्रोग्राम / एमएल Tet। प्लेटें सेते हे / एन (~ 16 घंटा) 37 डिग्री सेल्सियस पर।
      5. प्रत्येक वसूली संस्कृति के लिए, 50 मिलीलीटर लेग और 50 μl Tet स्टॉक के साथ एक 250 मिलीलीटर संस्कृति कुप्पी तैयार करते हैं। शेष वसूली संस्कृति का ~ 1 मिलीलीटर कुप्पी के लिए स्थानांतरण। जोरदार झटकों (~ 200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन (~ 16 घंटा)।
    6. एक थाली पर कालोनियों की संख्या की गणना। के रूप में सफल transformants की संख्या की गणना 1 समीकरण , कहा पे 2 समीकरण कालोनियों की संख्या है, 3 समीकरण है वसूली संस्कृति मात्रा (1,000 μl) और 4 समीकरण वसूली संस्कृति की मात्रा चढ़ाया (1 μl) है।
      नोट: अंगूठे का एक नियम सफल transformants की संख्या में होना चाहिए के रूप में सभी म्यूटेशन की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, ≥1उम्मीद म्यूटेशन की संख्या से अधिक 00 गुना। प्रत्येक NNS उप पुस्तकालय ~ 53 पदों पर है, इसलिए परिवर्तन की उम्मीद की संख्या 53 पदों × 32 कोडोन / स्थिति ≈ 1.7 × 10 3 है; एक पुस्तकालय आकार ≥100 गुना (≥1.7 × 10 5) देने के लिए वहाँ एक थाली पर ≥170 कालोनियों होना चाहिए।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग संस्कृतियों से प्लास्मिड डीएनए को अलग और फिर एक dsDNA quantitation अभिकर्मक का उपयोग सांद्रता को मापने। एक साथ मिक्स प्रत्येक प्लाज्मिड के 100 एनजी। यह अंतिम पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय बनाता है।

3. मंदिर-1 पूरे प्रोटीन एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए संतृप्ति mutagenesis लाइब्रेरी का चयन

  1. पूर्व चयन संस्कृति की तैयारी।
    1. पानी में 0.5 एनजी / μl के लिए प्रोटोकॉल कदम 2.3.7 से प्लाज्मिड पतला और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए 20 μl हस्तांतरण। परिवर्तन प्रदर्शन, फिरCOVERY, चढ़ाना और ओ / एन विकास पहले 999 μl लेग करने के लिए प्रोटोकॉल कदम 2.3.5 में वर्णित है, हस्तांतरण को छोड़कर सिसकी वसूली संस्कृति का 1 μl के रूप में
    2. कालोनियों की संख्या की गणना। सभी म्यूटेशन की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए वहाँ ≥100 कालोनियों ≥10 6 सफल transformants (100 × 263 10 6 ≈ × 32 कोडोन / स्थिति पदों) का संकेत होना चाहिए।
    3. 50 मिलीलीटर हे / एन संस्कृति की एकाग्रता को मापने।
      1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर क्युवेट करने के लिए 1 मिलीलीटर लेग जोड़कर एक पौंड खाली तैयार करें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर OD600 उपाय।
      2. 900 μl लेग में 100 μl resuspending द्वारा हे / एन संस्कृति 10 गुना पतला OD600 उपाय। खाली की OD600 पढ़ने घटाएँ और 10 से गुणा हे / एन संस्कृति के OD600 देने के लिए।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 30 मिनट के लिए पूर्व गर्म प्रोटोकॉल 1.1 कदम से तीन संस्कृति बोतल। OD600 = 0.1 हे / एन संस्कृति पतला और एक कुप्पी (अंतिम OD600 = 0.001) को 1 मिलीलीटर जोड़ें। टीअपने 'पूर्व चयन संस्कृति "है।
    5. जोरदार झटकों (200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर "पूर्व चयन संस्कृति" सेते हैं। समय समय पर OD600 प्रोटोकॉल कदम 3.1.3 के रूप में मापने के द्वारा विकास की निगरानी OD600 = 0.1 (~ 2.5 घंटा) तक (यह संस्कृति 10 गुना पतला करने के लिए आवश्यक नहीं है)।
    6. दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए पूर्व चयन संस्कृति की 100 मिलीलीटर स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 4000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला के सबसे निकालें और एक एकल 15 शंक्वाकार ट्यूब में गठबंधन। centrifugation दोहराएँ और सभी सतह पर तैरनेवाला हटा दें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. एम्पीसिलीन प्रतिरोध के लिए चयन।
    1. पूर्व चयन संस्कृति incubating है, वहीं 10 मिलीलीटर पानी में 0.5 ग्राम सोडियम एम्पीसिलीन भंग द्वारा पानी में एएमपी के एक 50 मिलीग्राम / एमएल शेयर तैयार करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग जीवाणुरहित।
    2. अन्य दो बोतल करने के लिए, 12 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता और पूर्व चयन संस्कृति इस तरह था की एक मात्रा के Tet जोड़ने अंतिम OD600 = 0.001 टी। एक फ्लास्क, 1 मिलीलीटर एम्प जोड़ने 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए - इस "चयन संस्कृति" है।
    3. जोरदार झटकों (200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं। संस्कृति जिसके लिए कोई एम्पीसिलीन पिछले चरण में जोड़ा गया है के विकास, OD600 = 0.1 (~ 2.5 घंटा) तक मॉनिटर। इस समय, यह भी चयन संस्कृति का OD600 उपाय।
    4. 0.1 में चयन संस्कृति का OD600 फूट डालो और 100 मिलीलीटर से गुणा करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 4000 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज को यह मात्रा (~ 400 मिलीलीटर) हस्तांतरण। सतह पर तैरनेवाला के सबसे निकालें और एक एकल 15 शंक्वाकार ट्यूब में गठबंधन। centrifugation दोहराएँ और सभी सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, पूर्व चयन (प्रोटोकॉल कदम 3.1.6) और चयन (प्रोटोकॉल कदम 3.2.4) संस्कृति सेल छर्रों से प्लास्मिड डीएनए को अलग और फिर एक dsDNA quantitation अभिकर्मक का उपयोग सांद्रता को मापने।
TLE "> 4। उच्च throughput अनुक्रमण परिवर्तन के स्वास्थ्य प्रभावों का निर्धारण करने के लिए

  1. उच्च throughput अनुक्रमण के लिए नमूनों की तैयारी
    1. 25 μl PCRs डी-मल्टीप्लेक्स के लिए ओर्थोगोनल प्राइमरों के साथ NNS उप पुस्तकालय समूहों तैयार
      1. टेबल 9 के अनुसार एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें; दस पीसीआर ट्यूबों के लिए 23 μl हस्तांतरण।
      2. 10 - 5 और चयन संस्कृति से 6 ट्यूबों के लिए - ट्यूब 1 पीसीआर पूर्व चयन संस्कृति से 0.5 एनजी / μl शुद्ध प्लास्मिड डीएनए की 1 μl जोड़ें।
      3. संबंधित रिवर्स orthogonal प्राइमरों OP1_R साथ OP5_F - - एक साथ मिक्स 50 माइक्रोन के आगे orthogonal प्राइमरों OP1_F के 50 μl OP5_R। उसी क्रम में, स्थानांतरण 1 पीसीआर ट्यूबों के लिए μl 1 - 5 और 6 - OP5_F और OP1_R - - OP5_R OP1_F के दृश्यों के लिए सामग्री के 10 तालिका देखें।
      4. thermocycler पीसीआर ट्यूबों स्थानांतरण। निम्नलिखित प्रोग्राम चलाने: 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 20 चक्र: 10 सेकंड, 55 डिग्री के लिए 98 डिग्री सेल्सियस20 सेकंड के लिए सी, 1.5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    2. NNS उप पुस्तकालय समूहों में से प्रत्येक को अलग-थलग करने के लिए 25 μl PCRs तैयार
      1. पतला 100 गुना प्रत्येक के 1 μl स्थानांतरित पीसीआर नलियों अलग करने के लिए और पानी के 99 μl जोड़कर प्रोटोकॉल कदम 4.1.1.4 से दस PCRs। मिक्स, तो 99 μl बाहर पिपेट और त्यागें।
      2. एक साथ मिक्स 50 माइक्रोन के आगे प्राइमरों Group1_F के 50 μl - संबंधित रिवर्स प्राइमरों Group1_R साथ Group5_F - Group5_R। उसी क्रम में, स्थानांतरण 1 μl नलियों पीसीआर 1 - 5 और 6 - Group5_F और Group1_R - - Group5_R की Group1_F दृश्यों के लिए सामग्री के 10 तालिका देखें।
      3. , टेबल 9 के अनुसार एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए 23 μl हस्तांतरण। thermocycler पीसीआर ट्यूबों स्थानांतरण; प्रोटोकॉल कदम 2.2.1.3 के रूप में ही कार्यक्रम चलाते हैं।
    3. अंतिम 25 μl PCRs बाहर ले अनुक्रमण दृश्यों को जोड़ने के लिए
      1. डिवीणा प्रोटोकॉल कदम 4.1.2.3 से दस PCRs 100 गुना प्रत्येक के 1 μl स्थानांतरित पीसीआर नलियों अलग करने के लिए और पानी के 99 μl जोड़कर। मिक्स, तो 99 μl बाहर पिपेट और त्यागें।
      2. , टेबल 9 के अनुसार एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के लिए 23 μl हस्तांतरण।
      3. 505_F क्रमशः - NNS उप पुस्तकालय समूहों 1-5, से होने वाले टेम्पलेट के साथ ट्यूबों के लिए 501_F प्रति ट्यूब आगे प्राइमरों 0.5 μl हस्तांतरण। पूर्व चयन और चयन संस्कृतियों से उत्पन्न टेम्पलेट के साथ ट्यूबों के लिए, हस्तांतरण ट्यूब प्रति 0.5 μl रिवर्स प्राइमरों 701_R और 702_R, क्रमशः। 501_F के दृश्यों के लिए सामग्री की तालिका देखें - 505_F, और 701_R और 702_R।
      4. thermocycler पीसीआर ट्यूबों स्थानांतरण और कदम 2.2.1.3 से कार्यक्रम चलाते हैं।
    4. मिक्स और नमूनों को शुद्ध
      1. उपाय सांद्रता निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक dsDNA quantitation अभिकर्मक का उपयोग। प्रत्येक पीसीआर उत्पाद int के 100 एनजी मिक्सOA एकल microcentrifuge ट्यूब।
      2. 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड (चेतावनी) के साथ एक 2% agarose जेल तैयार करें।
      3. मिश्रित पीसीआर उत्पादों नमूने के लिए 6x जेल लोडिंग डाई जोड़ें। डीएनए सीढ़ी के साथ जेल की पहली लेन लोड; नमूना की पूरी मात्रा लोड।
      4. 50 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चला। एक लंबे तरंगदैर्ध्य यूवी प्रकाशक (चेतावनी) का उपयोग कर जेल कल्पना। आबकारी ~ 360 बीपी पर पीसीआर उत्पाद युक्त टुकड़ा; ट्यूब microfuge के लिए स्थानांतरण। जेल टुकड़ा -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      5. 'निर्माताओं के निर्देश के बाद, एक जेल निकालना किट का उपयोग नमूना शुद्ध और एक dsDNA quantitation अभिकर्मक का उपयोग एकाग्रता को मापने। इस उच्च throughput अनुक्रमण के लिए अंतिम नमूना है।
    5. एक उच्च throughput अनुक्रमण मंच पर अनुक्रम (इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल मंच के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
      1. के रूप में एनएम में नमूना एकाग्रता की गणना 5 समीकरण है एनजी / μl में नमूने की एकाग्रता और समीकरण 7 नमूना डीएनए (~ 360 बीपी) के अनुक्रम लंबाई है। ईबी बफर में 4 एनएम के लिए नमूना पतला।
      2. नमूना denature और संकरण बफर में 9 बजे तक कमजोर करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
      3. लोड अभिकर्मक कारतूस में नमूने के 600 μl। अनुक्रम निर्माता के निर्देशों और परदे पर संकेत के बाद।
  2. अनुक्रमण आंकड़ों के विश्लेषण से
    1. डाउनलोड फ्लैश (लघु फास्ट लंबाई समायोजन पढ़ता है) 20, अनुक्रमण से प्राप्त fastq.gz फाइलों के साथ फ़ोल्डर में जगह है।
    2. उपयोग फ्लैश fastq.gz बनती अंत करने के लिए इसी फ़ाइलें सूचकांक के प्रत्येक जोड़ी के लिए पढ़ता है (आगे और रिवर्स पूर्व चयन और चयन संस्कृतियों के लिए प्रत्येक NNS उप पुस्तकालय समूह के लिए पढ़ता है) में शामिल होने के लिए। ओपन कमान के तत्काल और परिवर्तन निर्देशिका प्रोटोकॉल कदम 4.2.1 में फ़ोल्डर में। के आदेश का उपयोग पढ़ता प्रत्येक जोड़ी में शामिल हों: फ्लैश <mates1.fastq.gz> <mates2.fastq.gz>, जहां mates1.fastq.gz और mates2.fastq.gz आगे युक्त फाइल कर रहे हैं और पढ़ता रिवर्स, क्रमशः।
  3. पढ़ता के प्रत्येक जोड़ी के शामिल होने के बाद, पूर्व चयन या चयन संस्कृतियों से परिणाम के लिए अलग फ़ोल्डर में out.extendedFrags.fastq आउटपुट फ़ाइल जगह है। NNS उप पुस्तकालय समूह के लिए जो यह मेल खाती है (यानी।, 1.fastq, 2.fastq, आदि) के अनुसार out.extendedFrags.fastq आउटपुट फ़ाइल का नाम बदलें।
  4. कम्प्यूटेशनल स्क्रिप्ट NNS_DataAnalyzer.m भागो, जंगली प्रकार के लिए प्रत्येक एकल एमिनो एसिड उत्परिवर्तन के लिए मायने रखता है, और गिनती की गणना करने के लिए प्रत्येक NNS उप पुस्तकालय समूह के प्रत्येक फ़ोल्डर से (पूरक संहिता फ़ाइल देखें)।
  5. फिटनेस प्रभाव की गणना समीकरण 8 प्रत्येक उत्परिवर्तन की समीकरण 10 चयन में प्राप्त की गिनती के अनुपात के आधार दस लघुगणक (के रूप में समीकरण 11 ) बनाम पूर्व चयन ( समीकरण 12 ) हालत, जंगली प्रकार के सापेक्ष:
    समीकरण 13 ।

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Representative Results

Orthogonal भड़काना साइटों युक्त पांच संशोधित pBR322 plasmids के लिए प्लाज्मिड नक्शा (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) चित्रा 2A में दिखाया गया है। परीक्षण है कि क्या orthogonal प्राइमरों विशिष्ट हैं, PCRs, या व्यक्तिगत रूप से orthogonal प्राइमरों के प्रत्येक जोड़ी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया सभी पांच pBR322_OP1-5 plasmids के साथ साथ सभी plasmids शून्य से orthogonal प्राइमर जोड़ी मिलान प्लाज्मिड के साथ। सही उत्पाद ही प्राप्त हुई थी जब मिलान प्लाज्मिड शामिल किया गया था, और किसी भी आकार का कोई उत्पाद अपनी अनुपस्थिति (चित्रा 2 बी) में प्राप्त हुई थी।

एक प्रतिनिधि प्रयोग प्रोटोकॉल इस पाठ (चित्रा 1) में वर्णित निम्न प्रदर्शन किया गया था। प्रसंस्करण के बाद (प्रोटोकॉल अनुभाग 4.2), 6.2 × 10 6 पूर्व चयन हालत से पढ़ता है और 6.3 × 10 6 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन चयन conditi से पढ़तापर प्राप्त किया गया। मायने रखता है प्रत्येक के लिए प्राप्त की पूर्व चयन हालत से एसिड उत्परिवर्तन एक विशेषता लॉग-सामान्य वितरण (चित्रा 3) के 13 प्रदर्शित एमिनो। म्यूटेशन की 98.9% के लिए पूर्व चयन संस्कृति का अनुक्रमण से कम से कम एक गिनती में (465 था कम से कम 100 मायने रखता है) प्राप्त किया गया 91.2% के लिए, और 100 से अधिक मायने रखता है (58 कोई मायने रखता था)। चित्रा 3 बी रिश्तेदार फिटनेस प्रभाव को दर्शाया गया है () मंदिर-1 की प्रत्येक स्थिति में प्रत्येक उत्परिवर्तन के लिए; चित्रा -3 सी में दिखाया गया है वितरण। 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन पर चयन के तहत, सबसे म्यूटेशन (चित्रा 3 बी में सफेद पिक्सल और चित्रा -3 सी में बड़ी चोटी को इसी ≈ 0) एक तटस्थ या लगभग तटस्थ फिटनेस प्रभाव है। इस एकाग्रता में परिवर्तन का एक छोटा सा अंश (0 << चित्रा 3 बी और चित्रा -3 सी में बाईं पूंछ में नीले पिक्सल के लिए इसी) फिटनेस पर काफी प्रभाव है; ऍक्स्प ectedly, इन अत्यधिक संरक्षित सक्रिय साइट अवशेषों (S70, K73, S130, D131, N132, K234 और G236) 13,14 के भीतर परिवर्तन शामिल हैं। इसके विपरीत, कुछ उत्परिवर्तन काफी मंदिर-1 के उस पर फिटनेस बढ़ाने के लिए, (>> 0 चित्रा 3 बी में लाल पिक्सल के लिए इसी) के रूप में उम्मीद की जा सकती है क्योंकि मंदिर -1 एम्पीसिलीन हाइड्रोलिसिस में अत्यधिक कुशल है ( समीकरण 14 ≈ 10 7 एम -1 एस -1) 14।

आकृति 1
चित्रा 1. एम्पीसिलीन चयन के तहत मंदिर-1 β-lactamase के लिए पूरे प्रोटीन संतृप्ति mutagenesis प्रोटोकॉल की रूपरेखा। प्रक्रिया प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में बोल्ड में दिखाए जाते हैं। गिने प्रोटोकॉल कदम मुख्य पाठ करने के लिए संदर्भ के लिए, बाएँ पर दिखाए जाते हैं।कश्मीर "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. विषयेतर भड़काना साइट प्लाज्मिड वैक्टर के मान्यकरण। Orthogonal भड़काना साइटों (- pBR322_OP5 pBR322_OP1) युक्त पांच संशोधित pBR322 plasmids के लिए (ए) प्लाज्मिड नक्शा। स्थान और orthogonal भड़काना साइटों की दिशा संकेत कर रहे हैं। कई प्रतिबंध साइटों का स्थान चिह्नित कर रहे हैं; मंदिर -1 पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय (जो पूरे मंदिर -1 जीन और प्रमोटर भी शामिल है) AatII और AvrII प्रतिबंध साइटों के बीच में क्लोन है। लघुरूप: tet टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध जीन, प्रतिकृति की उत्पत्ति के मूल (बी) orthogonal प्राइमरों (OP1-OP5) के प्रत्येक जोड़ी एक पीसीआर सभी पांच pBR322_OP1-5 plasmids (+), या सभी plasmids शून्य से संबंधित प्लाज्मिड के साथ युक्त परीक्षण किया गया था (। ˗)। दिखाया एक ethidium ब्रोमाइड हैसना हुआ agarose जेल (1% w / v) प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के साथ भरी हुई, आकार वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग कर दिया। उम्मीद आकार उत्पाद 1,628 बीपी है; पहली लेन एक डीएनए सीढ़ी है, प्रासंगिक मानकों के आकार संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. मंदिर-1 β-lactamase पूरे प्रोटीन संतृप्ति प्रयोग के परिणाम। (ए) हिस्टोग्राम प्रत्येक अमीनो एसिड पूर्व चयन हालत से पुस्तकालय के उच्च throughput अनुक्रमण से प्राप्त उत्परिवर्तन के लिए मायने रखता का वितरण दिखा। सादगी के लिए, शून्य मायने रखता है (53 म्यूटेशन) के साथ म्यूटेशन एक की गिनती होने के रूप में सभी एकल एमिनो एसिड म्यूटेशन (बी) फिटनेस प्रभाव मंदिर -1 में चयन के तहत 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन पर दिखाए जाते हैं।। दिखाया गया डेटा हैरिश्तेदार फिटनेस प्रभाव () नीले रंग का प्रतिनिधित्व करने के हानिकारक प्रभाव से colorimetrically दर्शाया युक्त मैट्रिक्स, जंगली प्रकार के लिए एक सकारात्मक प्रभाव और सफेद कोई फिटनेस प्रभाव रिश्तेदार लाल। म्यूटेशन जिसके लिए कोई मायने रखता है पूर्व चयन संस्कृति से प्राप्त किया गया काले रंग के होते हैं। पंक्तियाँ प्राथमिक अनुक्रम साथ पदों को दर्शाती है और स्तंभों बीस अमीनो एसिड से एक के लिए उत्परिवर्तन से संकेत मिलता है या कोडोन बंद हो (एक अक्षर का कोड ने संकेत दिया, * कोडोन रोक है); मंदिर-1 के माध्यमिक संरचना सक्रिय साइट के भीतर छोड़ दिया और कई अत्यधिक संरक्षित रूपांकनों सही पर संकेत कर रहे हैं पर संकेत दिया है। (सी) हिस्टोग्राम रिश्तेदार फिटनेस प्रभाव का वितरण दिखा। दिखाया> 100 पूर्व चयन संस्कृति अनुक्रमण से प्राप्त की गिनती के साथ उन लोगों के परिवर्तन के लिए परिणाम हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक मास या आयतन टिप्पणी
Typtone 2 जी
खमीर निकालने 0.5 ग्राम
सोडियम क्लोराइड 0.06 छ
पोटेशियम क्लोराइड 0.02 ग्राम
मैग्नीशियम सल्फेट 0.24 छ
शुद्धिकृत जल 100 मिलीलीटर

तालिका 1. सुपर इष्टतम शोरबा (सिसकी)। अभिकर्मक के नाम और मात्रा 100 मिलीलीटर सिसकी (प्रोटोकॉल 1.1 कदम) को तैयार करने में इस्तेमाल किया।

अभिकर्मक मास या खंडUme टिप्पणी
Typtone 10 ग्राम
खमीर निकालने 5 ग्राम
सोडियम क्लोराइड 10 ग्राम
शुद्धिकृत जल 1 एल

तालिका 2 Luria-Bertani शोरबा (पौंड)। अभिकर्मक के नाम और मात्रा 1 एल पौंड (प्रोटोकॉल 1.1 कदम) को तैयार करने में इस्तेमाल किया।

अभिकर्मक मास या आयतन टिप्पणी
Typtone 10 ग्राम
खमीर निकालने 5 ग्राम
सोडियम क्लोराइड 10 ग्राम
आगर 15 ग्राम
शुद्धिकृत जल 1 एल

तालिका 3. लेग अगर। अभिकर्मक के नाम और मात्रा लेग अगर (प्रोटोकॉल कदम 1.1) तैयार करने में इस्तेमाल किया।

अभिकर्मक आयतन टिप्पणी
5x पीसीआर बफर 1,450 μl
पीसीआर एडिटिव 1,450 μl
2 मिमी dNTPs 725 μl 2 मिमी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड
50 माइक्रोन के AatII_F या AvrII_R प्राइमर 145 μl
1 एनजी / μl pBR322_AvrII प्लाज्मिड 145 μl
2 इकाइयों / μl डीएनए पोलीमरेज़ 72.5 μl
पानी 363 μl

तालिका 4. पहले दौर mutagenic पीसीआर मास्टर मिक्स। अभिकर्मक के नाम और पहले दौर mutagenic पीसीआर (प्रोटोकॉल कदम 2.2.1) के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए मात्रा। कुल मात्रा 290 25 μL प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है।

अभिकर्मक आयतन टिप्पणी
5x पीसीआर बफर 1,450 μl
पीसीआर एडिटिव 1,450 μl
2 मिमी dNTPs 725 μl 2 मिमी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड
50 माइक्रोन के AatII_F प्राइमर 145 μl
50 माइक्रोन के AvrII_R प्राइमर 145 μl
2 इकाइयों / μl डीएनए पोलीमरेज़ 72.5 μl
पानी 2973 μl

सारणी 5. दूसरे दौर mutagenic पीसीआर मास्टर मिक्स। अभिकर्मक के नाम और दूसरे दौर mutagenic पीसीआर (प्रोटोकॉल कदम 2.2.2) के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए मात्रा। कुल मात्रा 290 25 μl प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है।

अभिकर्मक आयतन टिप्पणी
5x पीसीआर बफर 20 μl
पीसीआर एडिटिव 20 μl
2 मिमी dNTPs 10 μl 2 मिमी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड
50 माइक्रोन के AvrII_F प्राइमर 2 μl
50 माइक्रोन के AatII_OP1_R - AatII_OP5_R प्राइमर 2 μl प्रतिक्रिया के प्रति एक प्राइमर, संबंधित प्लाज्मिड के साथ जोड़ा
1 एनजी / μl pBR322_OP1-5 प्लाज्मिड 2 μl प्रतिक्रिया के प्रति एक प्लाज्मिड
2 इकाइयों / μl डीएनए पोलीमरेज़ 1 μl
पानी 43 μl

6 तालिका क्लोनिंग वेक्टर पीसीआर। अभिकर्मक के नाम और पीसीआर तैयारी क्लोनिंग वैक्टर (प्रोटोकॉल कदम 2.3.2) बनाने के लिए मात्रा।

अभिकर्मक आयतन टिप्पणी
10x प्रतिबंध एंजाइम बफर 5 μl
4 इकाइयों / μl AvrII 2.5 μl
20 इकाइयों / μl AatII 0.5 μl
प्रतिबंध पचाने के लिए डीएनए 500 एनजी के लिए मात्रा
पानी 50 μl कुल मात्रा

टेबल 7. प्रतिबंध हज़म। क्लोनिंग वैक्टर और NNS उप पुस्तकालय समूह (प्रोटोकॉल कदम 2.3.3) के प्रतिबंध हज़म के लिए अभिकर्मक के नाम और मात्रा।

अभिकर्मक आयतन टिप्पणी
10x टी -4 डीएनए ligase बफर 5 μl
शुद्ध प्रतिबंध पचा NNS उप पुस्तकालय समूह डीएनए 48 एनजी के लिए मात्रा
शुद्ध प्रतिबंध पचा क्लोनिंग वेक्टर डीएनए 52 एनजी के लिए मात्रा
400 यूनिट / μl टी -4 डीएनए ligase 1 μl
पानी 20 μl कुल मात्रा

8 तालिका ligations अभिकर्मक के नाम और एक 1 में प्रतिबंध पचा NNS उप पुस्तकालय समूहों के साथ क्लोनिंग वैक्टर ligations के लिए मात्रा:। 3 वेक्टर: दाढ़ अनुपात (प्रोटोकॉल कदम 2.3.4) डालें।

अभिकर्मक आयतन टिप्पणी
5x पीसीआर बफर 55 μl
पीसीआर एडिटिव 55 μl
2 मिमी dNTPs 27.5 μl 2 मिमी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड
2 इकाइयों / μl डीएनए पोलीमरेज़ 2.75 μl
पानी 113 μl

टेबल 9. उच्च throughput अनुक्रमण के लिए नमूने की तैयारी के लिए। अभिकर्मक के नाम और मात्रा पीसीआर मास्टर घोला जा सकता है तैयार करने के लिए ओर्थोगोनल प्राइमरों (4.1.1) के साथ de-बहुसंकेतन के लिए इस्तेमाल किया, अलग-थलग NNS उप पुस्तकालय समूह (प्रोटोकॉल कदम 4.1.2) पीसीआर अभिकर्मकों और अनुक्रमण दृश्यों (प्रोटोकॉल कदम 4.1.3) जोड़ने। कुल मात्रा 11 25 μl प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है।

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Discussion

यहाँ एक प्रोटोकॉल, पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन प्रदर्शन उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर के लिए वर्णित है। विधि का एक महत्वपूर्ण पहलू क्लोनिंग की प्रक्रिया के दौरान orthogonal प्राइमरों का इस्तेमाल होता है। संक्षेप में, प्रत्येक अमीनो एसिड स्थिति mutagenic पीसीआर द्वारा बेतरतीब, और पदों जिसका संयुक्त अनुक्रम लंबाई उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा समायोजित किया जाता है के समूहों में एक साथ मिलाया जाता है। इन समूहों प्लाज्मिड orthogonal भड़काना साइटों, एक साथ मिश्रित और चयन के अधीन की जोड़ी युक्त वैक्टर में क्लोन कर रहे हैं, तो orthogonal प्राइमरों का उपयोग डी-मल्टिप्लेक्स, और बाद में गहरी अनुक्रम। चूंकि म्यूटेशन लंबाई सीमा पढ़ अनुक्रमण के भीतर ही सीमित हैं, इस दृष्टिकोण उपयोगी की संख्या आकार के जीनों के लिए म्यूटेशन युक्त पढ़ता अनुक्रमण से अधिक समय की लंबाई को पढ़ने के अधिकतम हो। इसके अलावा, इस तकनीक को पूरी mutatio के एक साथ या "एक बैच" चयन के लिए अनुमति देता हैएनएएल पुस्तकालय, काम का बोझ के साथ ही संभावना है कि म्यूटेशन चयन के विभिन्न स्तरों के अनुभव को कम करने। व्यावहारिक रूप से, प्रोटोकॉल काफी हद तक चिंता संगठन में महत्वपूर्ण कदम: क्लोनिंग की प्रक्रिया (प्रोटोकॉल 2.3 कदम) के दौरान एक समूहों में mutagenic पीसीआर उत्पादों का सही मिश्रण है और उनके सही orthogonal भड़काना साइट वेक्टर में बाद में क्लोनिंग यह सुनिश्चित करना चाहिए; अनुक्रमण के लिए नमूने की तैयारी (प्रोटोकॉल 4.1 कदम) के दौरान, सही orthogonal प्राइमरों, साथ ही प्राइमरों NNS उप पुस्तकालय समूहों में से प्रत्येक को अलग-थलग और अनुक्रमण दृश्यों को जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल के तीन मुख्य कदम - पुस्तकालय निर्माण, चयन, और अनुक्रमण - कई पहलुओं में संशोधित किया जा सकता है। पुस्तकालय निर्माण एक तकनीक की एक किस्म का उपयोग कर म्यूटेशन मिलवा सकता है के दौरान, उदाहरण के लिए, त्रुटि प्रवण पीसीआर द्वारा, या जीन विकल्प न्यूक्लियोटाइड का एक छोटा सा अंश में डोपिंग द्वारा संश्लेषित ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का उपयोग कर निर्माण से21 है। एक प्रोटीन के क्षेत्रों (यानी, NNS उप पुस्तकालय समूह), या वैकल्पिक जीनोटाइप पृष्ठभूमि में 22 में भीतर डबल या उच्च आदेश म्यूटेशन शामिल करने के लिए पुस्तकालय का निर्माण कर सकता है। महत्वपूर्ण बात है, पुस्तकालय निर्माण चरण के लिए सभी संशोधनों हालांकि कसौटी अनुक्रम और अनुक्रमण में म्यूटेशन के स्थान के बीच पत्राचार पढ़ा है कि लंबाई बनाए रखा है संतुष्ट करना चाहिए। इस कसौटी इसलिए एक प्रोटीन भर में कई परिवर्तन के व्यापक अध्ययन की दिशा में प्रोटोकॉल के आवेदन शामिल नहीं है। प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के लिए संशोधन वैकल्पिक चयन शर्तें शामिल हैं: (। जैसे, तापमान, पोषक तत्वों का स्तर) विभिन्न β लस्टम प्रकार के (या संयोजन) और सांद्रता, बाह्य तनाव की स्थिति, मेजबान प्रकार (जैसे, बैक्टीरिया के विभिन्न प्रकार के), या अलग नमूना बार (दिनों घंटे)। उदाहरण के लिए, पिछले काम में हम सभी एकल एमिनो एसिड म्यूटेशन की फिटनेस प्रभाव की जांच कीमंदिर-1 एम्पीसिलीन के विभिन्न सांद्रता के तहत, में और तीसरी पीढ़ी के cephalosporin cefotaxime 13 के तहत। साथ प्रोटोकॉल के तीसरे चरण के लिए संबंध है, हम वर्तमान में यहां इस्तेमाल अनुक्रमण मंच के चुनाव से हटने की सिफारिश नहीं है (सामग्री की तालिका देखें)। जबकि अनुक्रमण पढ़ लंबाई अन्य प्लेटफार्मों में वर्तमान में अब वास्तव में कर रहे हैं, की संख्या पढ़ता प्राप्य वर्तमान में काफी कम है; सामान्य में सटीकता जो करने के लिए एक परिवर्तन के प्रभाव से निर्धारित किया जा सकता है की प्राप्त पढ़ता संख्या (प्रोटोकॉल कदम 4.2.5 में समीकरण देखें) के लिए आनुपातिक है।

मोटे तौर पर सादगी के लिए, प्रोटोकॉल एक मॉडल प्रणाली के रूप में मंदिर-1 β-lactamase उपयोग करता है, हालांकि कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित अन्य प्रणालियों जिसके लिए एक उच्च throughput चयन या स्क्रीनिंग परख जगह में है करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। ऐसे assays निर्माण लेकिन अक्सर गैर तुच्छ है: सबसे पहले, एक साथ जीन (उत्परिवर्तन) और प्रोटीन की compartmentalization के लिए एक रणनीति स्थापित किया जाना चाहिए, उदाहरण के एक कोशिका के भीतर, (एक microfluidics मंच के रूप में) तरल छोटी बूंद, या फेज प्रदर्शन के द्वारा। दूसरा, और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रोटीन समारोह और एक चयन फेनोटाइप, या फिटनेस के बीच एक मात्रात्मक कनेक्शन, स्थापित किया जाना चाहिए। चयापचय या एंटीबायोटिक प्रतिरोध में शामिल एंजाइमों के लिए, कोशिकाओं की क्षमता पोषक तत्व ड्रॉप आउट या एंटीबायोटिक मीडिया में विकसित करने के लिए अक्सर enzymatic गतिविधि का एक सीधा समारोह है। एक और अधिक सिंथेटिक दृष्टिकोण प्रोटीन, प्रोटीन पत्रकार जीन आत्मीयता बाध्यकारी जोड़ने के द्वारा, अन्य प्रणालियों में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए (जैसे।, फ्लोरोसेंट प्रोटीन) बैक्टीरिया में अभिव्यक्ति या खमीर 11,23, या एक microfluidics प्रणाली 24 में एक fluorogenic एंजाइम सब्सट्रेट का उपयोग । अन्त में, इस तरह के एक परख एक पूरे प्रोटीन म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय के आकार को संबोधित करने के लिए, स्केलेबल होना चाहिए।

सारांश में, पूरे प्रोटीन संतृप्ति म्युटाजेनेसिस पुस्तकालयों के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक उच्च throughput अनुक्रमण आधारित दृष्टिकोण descr हैयहाँ ibed। दृष्टिकोण के लिए केंद्रीय जीन के साथ खंडों के भीतर म्युटाजेनेसिस पुस्तकालय का निर्माण, और orthogonal प्राइमर बारकोड के उपयोग बहुसंकेतन और de-बहुसंकेतन पुस्तकालय के लिए प्रत्येक खंड टैग करने के लिए है। हम आशा करते हैं कि इस प्रोटोकॉल आसानी से अन्य प्रोटीन है जो के लिए एक उपयुक्त उच्च throughput चयन या स्क्रीन विकसित किया गया है करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Typtone Research Products Intl. Corp. T60060-1000.0
Yeast extract Research Products Intl. Corp. Y20020-500.0
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333-500G
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506-500G
Agar Fisher Scientific BP1423-500
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G
Petri plates Corning 351029
MATLAB  Mathworks http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos 25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrII available upon request pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5 available upon request five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491L includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tube Corning 430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) Eppendorf
PCR plate, 96 well Fisher Scientific 14230232
96 well plate seal Excel Scientific F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler Applied Biosystems 4375786
6x gel loading dye New England Biolabs B7024S
Agarose Research Products Intl. Corp. 20090-500.0
Ethidium bromide Bio-Rad 161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) Fotodyne Inc. http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer Qiagen 19086
96-well black-walled, clear bottom assay plates Corning 3651
Lambda phage DNA New England Biolabs N3011S
PicoGreen dsDNA reagent Invitrogen P7581 dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate reader PerkinElmer
DNA purification kit Zymo Research D4003
Microcentrifuge tubes Corning 3621
Long-wavelength UV illuminator Fisher Scientific FBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction buffer Zymo Research D4001-1-100
AatII New England Biolabs R0117S
AvrII New England Biolabs R0174L
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli Avidity EVB100
Electroporator (E. coli Pulser) Bio-Rad 1652102
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) Amersham Biosciences 80211237
50 ml conical tubes Corning 430828
Plasmid purification kit Macherey-Nagel 740588.25
8 well PCR strip tubes Axygen 321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32854 dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
Qubit fluorometer Invitrogen Q32866
Ampicillin sodium salt Akron Biotechnology 50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) Illumina MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer Illumina http://www.illumina.com/systems/miseq.html alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh software John Hopkins University - open source http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_F GATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_R CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_F CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R ACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R ACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R ACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R ACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_F GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
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Group2_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
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CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
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Group3_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_R CAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_R CAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 113 म्युटाजेनेसिस संतृप्ति म्युटाजेनेसिस अगली पीढ़ी के अनुक्रमण उच्च throughput अनुक्रमण मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ एंटीबायोटिक प्रतिरोध orthogonal प्राइमरों
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Stiffler, M. A., Subramanian, S. K., … More

Stiffler, M. A., Subramanian, S. K., Salinas, V. H., Ranganathan, R. A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (113), e54119, doi:10.3791/54119 (2016).

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