Summary
Vi presenterer en protokoll for funksjonell vurdering av omfattende single-site metning mutagenese biblioteker av proteiner utnytte high-throughput sekvensering. Viktigere, bruker denne tilnærmingen ortogonale primerpar å multiplekse bibliotek konstruksjon og sekvensering. Representative resultater ved hjelp av TEM-1 β-laktamase valgt på en klinisk relevant dosering av ampicillin er gitt.
Introduction
Mutagenese har lenge vært ansatt i laboratoriet for å studere egenskapene til biologiske systemer og deres utvikling, og å produsere mutante proteiner eller organismer med forbedrede eller nye funksjoner. Mens tidlige tilnærminger avhengig av metoder som produserer tilfeldige mutasjoner i organismer, bruk av rekombinant DNA-teknologi aktivert forskerne å innføre enkelte endringer i DNA i en stedsspesifikk måte, ie., Seterettet mutagenese 1,2. Med dagens teknikker, typisk ved hjelp av mutagene oligonukleotider i en polymerase kjedereaksjon (PCR), er det relativt lett å lage og vurdere et lite antall mutasjoner (f.eks., Punktmutasjoner) i et gitt gen 3,4. Det er langt mer vanskelig men når målet nærmer seg, for eksempel etablering og vurdering av alle mulige enkeltsted (eller høyere orden) mutasjoner.
Selv om mye har blitt lært fra tidlige studier som forsøker å vurdere et stort antall mutations i gener, de teknikker som ble brukt var ofte arbeidskrevende, for eksempel krever vurdering av hver mutasjon uavhengig ved hjelp nonsense suppressor-stammer 5-7, eller var begrenset i sin evne til kvantitativt på grunn av den lave sekvense dybden av Sanger-sekvensering 8. Teknikkene som brukes i disse studiene har i stor grad blitt erstattet av metoder som benytter high-throughput sekvenseringsteknologi 9-12. Disse konseptuelt enkle fremgangsmåter innebærer å lage et bibliotek som omfatter et stort antall mutasjoner, underkaste biblioteket til en skjerm eller et valg for funksjon, og deretter dyp-sekvensering (f.eks., Av størrelsesorden> 10 6 sekvense leser) biblioteket erholdt før og etter valget. På denne måte de fenotypiske eller egnethet virkningen av et stort antall mutasjoner, fremstilt som endringen i populasjonen frekvensen for hver mutant, kan vurderes samtidig og mer kvantitativt.
Vi har tidligere innført en enkel og effekt(., dvs. hel-protein metning mutagenese biblioteker) le metode for vurdering av biblioteker av alle mulige enkeltaminosyrer mutasjoner i proteiner, som gjelder for gener med en lengde lenger enn det sekvense lese lengde 11,13: For det første er hver aminosyre posisjon randomisert ved seterettet mutagene PCR. Under denne prosessen blir genet delt inn i grupper bestående av sammenhengende stillinger med en total lengde opptas av sekvenseringsplattformen. De mutagene PCR-produktene for hver gruppe blir deretter kombinert, og hver gruppe uavhengig underkastet seleksjon og high-throughput-sekvensering. Ved å opprettholde en korrespondanse mellom plasseringen av mutasjoner i sekvensen og sekvenselese lengde, har denne tilnærmingen fordelen av å maksimere sekvense dybde: mens man kunne bare sekvensere slike biblioteker i korte vinduer uten å splitte opp i grupper (for eksempel ved en standard hagle. sekvense metoden), mest leser erholdt ville være villtype og dermed majority av sekvense gjennomstrømning til spille (dvs. for et hel-protein metning mutagenese-bibliotek fra et 500 aminosyreprotein sekvensert i 100 aminosyre (300 bp) vinduer, ved minst 80% av leser vil være vill-type-sekvensen).
Her blir en protokoll presentert som anvender high-throughput-sekvensering for den funksjonelle vurderingen av hel-protein metning mutagenese biblioteker, ved hjelp av ovennevnte metode (beskrevet i figur 1). Viktigere, innfører vi bruk av ortogonale primere i biblioteket kloningsprosess til å strekkode hver sekvens gruppe, som tillater dem å bli multiplekset inn ett bibliotek, utsettes samtidig til screening eller utvalg, og deretter de-multiplekset for dyp sekvensering. Siden sekvens grupper ikke utsettes for valg uavhengig, dette reduserer arbeidsmengden, og sikrer at hver mutasjon opplever det samme nivået av utvalget. TEM-1 β-laktamase, et enzym som gir høyt nivå resistens motβ-laktam-antibiotika (f.eks. ampicillin) i bakterier er brukt som et modellsystem 14-16. En protokoll er beskrevet for vurdering av en hel-protein metning mutagenese bibliotek av TEM-1 i E. coli etter valg med en omtrentlig serumnivå for en klinisk dose av ampicillin (50 ug / ml) 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Se figur 1 for omrisset av protokollen. Flere trinn og reagenser i protokollen krever sikkerhetstiltak (indikert med "FORSIKTIG"). Størst sikkerhetsdatablad før bruk. Alle protokoll trinn utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt.
1. Forbered Kultur Media og Plates
- Fremstille og sterilisere ved autoklavering 1 l renset vann, 100 ml Super Optimal Broth (SOB, tabell 1), en L-Luria-Bertani-medium (LB, tabell 2), og en L LB-agar (tabell 3). Forbered separat og sterilisere tre kulturflasker som hver inneholder 1 L LB.
Merk: Gjennom protokollen "vann" refererer til autoklav-sterilisert renset vann; SOB, LB og LB-agar refererer til autoklaven-sterilisert løsninger. - Fremstille en 12 mg / ml lager i Tet ved å oppløse 0,12 g tetracyklin-hydroklorid i 10 ml 70% etanol. Steriliser ved hjelp av en 0,2 mikrometer filter og butikkved 4 ° C beskyttet mot lys.
- Kul LB-agar til 50 ° C og deretter tilsett 1 ml Tet lager (sluttkonsentrasjon på 12 ug / ml Tet). Hell over i petri plater og kjølig på RT beskyttet mot lys. Oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys.
2. Byggingen av Whole-genet metning Mutagenese Library
Merk: Grunning; fullførte PCR, restriksjonsfordøyer og ligations; og rensede DNA-prøver kan oppbevares ved -20 ° C.
- Designing mutagenese primere
- Å mutagenisere hver aminosyre stilling til alle mulige aminosyrer, designe et par av komplementære mutagenese primere (følelse / forover og antisense / bakover) for hver aminosyre stilling med følgende retningslinjer:
- Erstatte kodonet som tilsvarer den aminosyre som skal mutageniseres ved NNS (hvor N er en blanding av alle fire nukleotidbaser og S er en blanding av cytosin (C) og guanin (G)) og senter i den primer flankert av omtrent 15 nukleotider på hver side.
- Sørge for at den 5 'og 3' ender avsluttes i C eller G, og at smeltetemperaturen (T m) er ca. 70 ° C 3. Bruk beregningsskript NNS_PrimerDesign.m (Se tilleggskode File) for å utforme NNS mutagenese primere i henhold til disse retningslinjene.
- Bestill primere fra en kommersiell kilde. For enkel bruk, er disse syntetisert i 96-brønners plateformat og pre-fortynnet i vann til 50 pM, med ett sett med plater inneholdende sanse mutagenese primere og en annen antisense-primere.
- Fyll en pipette vask med vann og bruke en multikanal pipette for å overføre 95 ul til 263 brønner i løpet av tre 96-brønners plater. Fortynn av primerne 20-fold til 2,5 pM ved anvendelse av en multikanal pipette for å overføre 5 ul fra de 96-brønners plater inneholdende de forstand mutagenese primerne til de beslektede brønnene på platene som inneholdt vann.
- Gjentaprotokollen trinn 2.1.3 vanne ut anti mutagenese primere.
- Å mutagenisere hver aminosyre stilling til alle mulige aminosyrer, designe et par av komplementære mutagenese primere (følelse / forover og antisense / bakover) for hver aminosyre stilling med følgende retningslinjer:
- Syntese av NNS sub-bibliotek for hver aminosyre stilling ved hjelp av to-trinns PCR seterettet mutagenese
- Utfør første runde mutagene PCR. For hver mutagenese primer, utarbeide en 25 ul PCR-reaksjon ved hjelp pBR322_AvrII plasmid som mal og primere AatII_F eller AvrII_R (følelse mutagenese primere forbundet med primer AvrII_R, og antisense mutagenese primere paret med primer AatII_F, totalt 526 PCR). Se tabell for material for AatII_F og AvrII_R sekvenser.
- Forbered en PCR "master mix" ved å legge til reagenser fra tabell 4 til en 15 ml konisk tube. Overføring til en pipette bassenget. Bruk en multikanal pipette til å overføre 15 ul til 263 brønner over tre 96-brønners PCR-plater. Bruke en multikanal pipette for å overføre 10 ul fra 96-brønners plater inneholdende de fortynnede forstand mutagenese primere til beslektede brønnene in PCR plater.
- Dekke hver PCR-plate med en 96-brønns plate tetning. Sentrifuger ved 200 xg i 2 min.
- Overfør PCR-plater til termo og kjøre følgende program: 98 ° C i 30 sekunder; 20 sykluser: 98 ° C i 10 sek, 55 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 1 min; 72 ° C i 2 minutter; hold ved 4 ° C.
- Gjenta protokollen trinn 2.2.1.1 - 2.2.1.3 for 96-brønners plater som inneholder utvannet antisensprimere mutagenese primere.
- Utfør andrerunde mutagene PCR. For hver aminosyre posisjon, utarbeide en 25 ul PCR-reaksjon ved bruk av primere AatII_F og AvrII_R, og blandet og fortynnet første runde mutagene PCR-produkter som en mal (totalt 263 PCR).
- Fyll en pipette vask med vann og bruke en multikanal pipette for å overføre 198 ul til 263 brønner i løpet av tre 96-brønners plater.
- Kombiner og fortynn 100 ganger den mutagene PCR-produktene for hver aminosyre stilling ved hjelp av en multikanal pipette tilførste overførings 1 ul fra de 96-brønners PCR-plater inneholdende PCR-produktene som resulterer fra den forstand mutagenese primerne til de beslektede brønnene på platene som inneholdt vann. Deretter gjenta overføringen for PCR produktene som følge av anti mutagenese primere.
- Forbered en PCR "master mix" ved å legge til reagenser fra tabell 5 til en 15 ml konisk tube. Overføring til en pipette bassenget. Bruk en multikanal pipette til å overføre 24 mL til 263 brønner over tre 96-brønners PCR-plater. Bruke en multikanal pipette for å overføre 1 pl av 96-brønners plater inneholdende det blandede og fortynnede første runde mutagene PCR-produktene til de beslektede brønnene i PCR-plater.
- Dekke hver PCR-plate med en 96-brønns plate tetning. Sentrifuger ved omtrent 200 x g i 2 min. Overfør platene til termo og kjøre samme program som i protokollen trinn 2.2.1.3.
- Analyser resultatene fra andrerunde mutagene PCR ved gel elektroforese.Sørg for at alle produktene er av riktig størrelse og fraværende av forurensende produkter.
- Tilsett 2 ml av 2x gel lasting fargestoff til en pipette vask og deretter bruke en multikanal pipette til å overføre 6 mL til 263 brønner over tre 96-brønners plater. Bruke en multikanal pipette for å overføre 6 pl fra 96-brønners PCR-plater inneholdende de andre rundt mutagene PCR-produktene til de beslektede brønnene av 96-brønners plater inneholdende fargestoff.
- Tilbered en 1,5% agarosegel med 0,2 mikrogram / ml etidiumbromid (OBS).
- Load DNA stigen i første og siste kjørefelt i hver rad. Deretter bruker en flerkanals pipette for å laste 10 mL av prøver fra protokollen trinn 2.2.3.1.
- Kjør gelen ved 100 V i 40 minutter og bilde på en UV-transilluminator.
- Gjenta protokollen trinn 2.2.3.2 - 2.2.3.4 før alle prøvene er analysert.
- Måle konsentrasjonen av hver NNS sub-bibliotek PCR-produktet ved bruk av en dsDNA kvantifisering reagens.
- Overføreomtrent 15 ml EB-buffer til en pipette bassenget. Bruk en multikanal pipette til å overføre 49 mL til 263 brønner over tre 96-brønners sorte vegger, klare bunnanalyseplater.
- Bruke en multikanal pipette for å overføre 1 mL av hver andre-trinns PCR-produkt (protokoll trinn 2.2.2) til de beslektede brønnene av 96-brønners analyseplater.
- Forbered en DNA-konsentrasjon standardkurve ved å fortynne lambda fag-DNA til 2 ng / mL i 300 mL EB buffer og deretter gjøre ti to ganger fortynninger (for totalt 11 konsentrasjoner). Overfør 50 ul til første elleve kolonner i en rad med en av de 96-brønners analyseplater fra det foregående trinn som ikke inneholder noe prøven; til den tolvte kolonne legge til 50 mL av EB buffer (Reagens blank).
- Forbered dsDNA kvantifisering reagens ved å tilsette 75 mL av reagens (se tabell of Materials) til en 15 ml konisk rør, legg deretter til 15 ml EB buffer. Bland ved å snu røret og deretter overføre til en pipette bassenget. Beskytt reagens mot lys.
- Bruke en multikanal pipette for å overføre 50 ul klare for dsDNA kvantifisering reagens til hver brønn i analyseplater. Bland ved pipettering opp-og-ned. Inkuber platene ved romtemperatur i 5 min beskyttet mot lys.
- Måle fluorescens av hver prøve ved anvendelse av en mikroplateavleser og standard-fluorescein-bølgelengder (eksitasjon 485 nm, emisjon 520 nm; 0,1 sek).
- Trekk fra fluorescensen verdien av reagens-blind fra alle prøvene. Generere en standardkurve fra fluorescensmålinger av lambda fag-prøver. Beregne konsentrasjonen av hver prøve ved hjelp av deres respektive fluorescensmålinger og standardkurven.
- Utfør første runde mutagene PCR. For hver mutagenese primer, utarbeide en 25 ul PCR-reaksjon ved hjelp pBR322_AvrII plasmid som mal og primere AatII_F eller AvrII_R (følelse mutagenese primere forbundet med primer AvrII_R, og antisense mutagenese primere paret med primer AatII_F, totalt 526 PCR). Se tabell for material for AatII_F og AvrII_R sekvenser.
- Kloning av NNS under bibliotekene i utvalgs vektorer
- Bland 100 ng av hver NNS sub-bibliotek PCR-produkt i fem NNS sub-bibliotek grupper. Etter produsentens instruksjoner, rydde opp prøver ved hjelp av en DNA rensing kit og deretter måle konsentrasjonen ved hjelp av en dsDNA kvantifisering reagens.
Merk: Hver gruppe består av omtrent 53 sammenhengende aminosyrer stillinger adskilt langs TEM-1-sekvensen (NNS sub-bibliotek gruppene 1 - 5 består av posisjonene 26-78, 79-132, 133-183, 184-236, og 237-290, henholdsvis nummerering ifølge Ambler et al 19).. - Lag kloning vektorer for hver NNS sub-bibliotekgruppen.
- Forbered fem 100 ul PCR i henhold til tabell 6, ved hjelp av primere AvrII_F og AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, og plasmider pBR322_OP1-5 som mal (AatII_OP1_R paret med pBR322_OP1, etc.).
- Overføring til termo og kjøre følgende program: 98 ° C i 30 sekunder; 25 sykluser: 98 ° C i 10 sek, 55 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 1,5 min; 72 ° C i 2 minutter; hold ved 4 ° C. Se T stand for material for sekvenser av AatII_R og AvrII_F.
- Forbered en 1% agarosegel med 0,2 mikrogram / ml etidiumbromid (OBS).
- Tilsett 20 ul 6x gel lasting fargestoff til hver PCR-prøve. Legg den første kjørefelt av gelen med DNA stigen; laste hele volumet av hver prøve, hopper over minst en brønn mellom prøver.
- Kjør gel ved 100 V i 50 min.
- Visualiser gel ved hjelp av en lang bølgelengde UV-lys (OBS). Avgifts skiver inneholder PCR-produktet på ~ 3500 bp; overføre å skille mikrofugerør. Gel skiver kan oppbevares ved -20 ° C.
- Etter produsentens instruksjoner, rense prøver ved hjelp av en gel utvinning kit og måle konsentrasjonen ved hjelp av et dsDNA kvantifisering reagens.
- For begge de NNS sub-bibliotek grupper (protokoll trinn 2.3.1) og kloningsvektorer (protokoll trinn 2.3.2), satt opp restriksjonsspaltninger med Aatll og Avrll enzymer i henhold til T stand 7. Inkuber ved 37 ° C i 1 time. Etter produsentens instruksjoner, rydde opp prøver ved hjelp av en DNA rensing kit og deretter måle konsentrasjonen ved hjelp av et dsDNA quantitasjon reagens.
- Sett opp ligation reaksjoner etter tabell 8 for hver restriksjon-fordøyd NNS sub-bibliotek gruppe med beslektede restriksjonsfordøyd kloningsvektor (NNS sub-bibliotek gruppe 1 med pBR322_OP1, etc.). Inkuber ved RT i 1 time. Rydd opp reaksjoner ved hjelp av en DNA rensing kit i henhold til produsentens anvisninger; elueres DNA med 20 ul vann.
- Transform helheten av de rensede ligation reaksjoner i bibliotek-effektiv E. coli-celler ved elektroporering.
- Thaw elektrokompetente E. coli-celler og deretter plassere celler og rensede Rings reaksjoner på is.
- Overfør 10 mL tint celler til hver renset ligation reaksjon og deretter overføre til electroporation kyvette. Electroporate på 1,8 kV.
- Gjenopprette celler ved resuspending i 1 ml SOB. Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
- Resuspender 10 mL av hver bedring kultur i 990 pl LB; spredt 100 pl på LB-agar plater containing 12 ug / ml Tet. Inkuber platene O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C.
- For hver utvinning kultur, utarbeide en 250 ml kultur kolbe med 50 ml LB og 50 ul Tet lager. Overføring til kolbe de resterende ~ 1 ml utvinning kultur. Inkuber O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C med kraftig risting (-200 opm).
- Telle antall kolonier på hver plate. Beregn antall vellykkede trans som
, hvor 
er antallet kolonier 
er utvinning kultur volum (1000 mL) og 
er volum av gjenvinnings kulturen platet (1 ul).
Merk: For å sikre full dekning av alle mutasjoner, som en tommelfingerregel antall vellykkede trans bør være ≥100 ganger over antall forventede mutasjoner. Hvert NNS sub-biblioteket har ~ 53 stillinger, så forventet antall mutasjoner er 53 stillinger × 32 kodon / stilling ≈ 1,7 × 10 3; for å gi et bibliotek størrelse ≥100-fold (≥1.7 x 10 5) det bør være ≥170 kolonier på hver plate. - Ifølge produsentens instruksjoner, isolere plasmid DNA fra kulturer som bruker et plasmid rensing kit og deretter måle konsentrasjoner ved hjelp av et dsDNA kvantifisering reagens. Blande sammen 100 ng av hvert plasmid. Dette skaper den endelige hel-protein metning mutagenese bibliotek.
- Bland 100 ng av hver NNS sub-bibliotek PCR-produkt i fem NNS sub-bibliotek grupper. Etter produsentens instruksjoner, rydde opp prøver ved hjelp av en DNA rensing kit og deretter måle konsentrasjonen ved hjelp av en dsDNA kvantifisering reagens.
, hvor 
er antallet kolonier 
er utvinning kultur volum (1000 mL) og 
er volum av gjenvinnings kulturen platet (1 ul). 3. Valg av TEM-1 Hel-protein Saturation Mutagenese Bibliotek for antibiotikaresistens
- Utarbeidelse av pre-utvalget kultur.
- Fortynn plasmidet fra protokollen trinn 2.3.7 til 0,5 ng / mL i vann og overføre 20 ul til et mikrosentrifugerør. Utfør transformasjon, recovery, plating og O / N vekst som tidligere beskrevet i protokollen trinn 2.3.5, bortsett fra overførings 1 mL av utvinningen SOB kultur til 999 pl LB.
- Telle antall kolonier. For å sikre full dekning av alle mutasjoner det skal være ≥100 kolonier, noe som indikerer ≥10 seks vellykkede trans (100 × 263 stillinger × 32 kodon / stilling ≈ 10 6).
- Måle konsentrasjonen av 50 ml O / N kultur.
- Forbered en LB tomt ved å legge en ml LB til et spektrofotometer kyvette. Mål OD600 på et spektrofotometer.
- Fortynn O / N kultur 10 ganger ved resuspending 100 pl i 900 mL LB. Mål OD600. Trekk OD600 avlesning av emnet og multipliseres med 10 for å gi en OD600 på O / N kultur.
- Forvarme de tre kulturflasker fra protokoll trinn 1,1 til ~ 30 minutter ved 37 ° C. Fortynn O / N kultur til OD600 = 0,1 og tilsett 1 ml til en kolbe (endelig OD600 = 0,001). Thans er "pre-utvalget kultur".
- Inkuber "forvalg kultur" ved 37 ° C med kraftig risting (200 rpm). Periodisk å overvåke vekst ved å måle OD 600 som i protokollen trinn 3.1.3 (det er ikke nødvendig å fortynne kulturen 10 ganger) inntil OD600 = 0,1 (~ 2,5 timer).
- Overfør 100 ml av pre-utvalget kultur til to 50 ml koniske rør. Sentrifuger ved 4000 x g i 6 minutter ved 4 ° C. Fjerne det meste av supernatanten og kombineres til en enkelt 15 konisk tube. Gjenta sentrifugering og fjerne all supernatant. Oppbevar ved -20 ° C.
- Seleksjon for ampicillinresistens.
- Mens forhåndsvalg kultur ruger, utarbeide en 50 mg / ml lager av Amp i vann ved oppløsning av 0,5 g natrium ampicillin i 10 ml vann. Steriliser ved hjelp av en 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Til de to andre kolber, legger Tet til en sluttkonsentrasjon på 12 ug / ml og et volum av forhåndsvalg kultur slik tha t den endelige OD600 = 0,001. Til en kolbe, tilsett 1 ml Amp, for en endelig konsentrasjon på 50 ug / ml - dette er "valg kultur".
- Inkuber kulturene ved 37 ° C med kraftig risting (200 rpm). Overvåke vekst av kulturen som ingen ampicillin ble tilsatt i det foregående trinn, inntil OD600 = 0,1 (~ 2,5 timer). På denne tiden, også måle OD 600 på det merkede kulturen.
- Del OD600 av utvalget kultur inn 0,1 og multiplisere med 100 ml. Overføre dette volum (~ 400 ml) til 50 ml koniske rør og sentrifugeres ved 4000 xg i 6 min ved 4 ° C. Fjerne det meste av supernatanten og kombineres til en enkelt 15 konisk tube. Gjenta sentrifugering og fjerne all supernatant.
- Ifølge produsentens instruksjoner, isolere plasmid DNA fra pre-utvalget (protokoll trinn 3.1.6) og seleksjon (protokoll trinn 3.2.4) kultur celle pellets og deretter måle konsentrasjoner ved hjelp av et dsDNA kvantifisering reagens.
- Fremstilling av prøver for high-throughput sekvense
- Forbered 25 mL PCRs å de-multiplekse NNS sub-bibliotek grupper med ortogonale primere
- Forbered en PCR mester blanding henhold til tabell 9; overføre 23 mL ti PCR-rørene.
- Tilsett 1 mL av 0,5 ng / mL renset plasmid DNA fra pre-utvalget kultur til PCR-rørene 1 - 5 og fra utvalget kultur til rør 6-10.
- Bland sammen 50 ul 50 M frem ortogonale primere OP1_F - OP5_F med den respektive omvendt ortogonale primere OP1_R - OP5_R. I samme rekkefølge, overføre en fil til PCR-rør 1 - 5 og 6 - 10. Se tabell for material for sekvenser av OP1_F - OP5_F og OP1_R - OP5_R.
- Overfør PCR rør for å thermocycler. Kjør følgende program: 98 ° C i 30 sekunder; 20 sykluser: 98 ° C i 10 sek, 55 °C i 20 sekunder, 72 ° C i 1,5 min; 72 ° C i 2 minutter; hold ved 4 ° C.
- Forbered 25 mL PCRs å isolere hver av NNS sub-bibliotek grupper
- Fortynnet 100 ganger de ti PCRs fra protokollen trinn 4.1.1.4 ved å overføre 1 mL av hver for å skille PCR rør og tilsette 99 mL vann. Mix, deretter pipette ut 99 mL og kast.
- Bland sammen 50 ul 50 M fremover primere Group1_F - Group5_F med respektive motsatte primere Group1_R - Group5_R. I samme rekkefølge, for å overføre 1 mL PCR-rørene 1-5 og 6 - 10. Se tabell for material for sekvenser av Group1_F - Group5_F og Group1_R - Group5_R.
- Forbered en PCR mester blanding henhold til tabell 9, overføre 23 mL til hver PCR-rør. Overfør PCR rør for å thermocycler; kjøre samme program som i protokollen trinn 2.2.1.3.
- Utfør de endelige 25 mL PCRs å legge indeksering sekvenser
- dilutt 100 ganger de ti PCRs fra protokollen trinn 4.1.2.3 ved å overføre 1 mL av hver for å skille PCR rør og tilsette 99 mL vann. Mix, deretter pipette ut 99 mL og kast.
- Forbered en PCR mester blanding henhold til tabell 9, overføre 23 mL til hver PCR-rør.
- For rør med mal som stammer fra NNS sub-bibliotek grupper 1-5, overføre 0,5 mL per rør forover primere 501_F - henholdsvis 505_F. For rør med mal som følge av de pre-utvalg og utvalgs kulturer, overføre 0,5 mL per rør reverse primere 701_R og 702_R hhv. Se tabell for material for sekvenser av 501_F - 505_F, og 701_R og 702_R.
- Overfør PCR-rør til thermocycler og kjøre programmet fra trinn 2.2.1.3.
- Bland og rense prøver
- Mål konsentrasjoner ved hjelp av et dsDNA kvantifisering reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Bland 100 ng av hvert PCR-produkt intoa enkelt mikrosentrifugerør.
- Forbered en 2% agarosegel med 0,2 mikrogram / ml etidiumbromid (OBS).
- Legg 6x gel lasting fargestoff til den blandede PCR-produkter prøven. Legg den første kjørefelt av gelen med DNA stigen; laste hele volumet av prøven.
- Kjør gel ved 100 V i 50 min. Visualiser gel ved hjelp av en lang bølgelengde UV-lys (OBS). Vesenet skive inneholder PCR-produktet på ~ 360 bp; overføre til mikrosentrifugerør. Gelstykket kan oppbevares ved -20 ° C.
- Etter produsentens instruksjoner, rense prøve å bruke en gel utvinning kit og måle konsentrasjonen ved hjelp av et dsDNA kvantifisering reagens. Dette er den siste prøven for high-throughput-sekvensering.
- Sekvens på en high-throughput sekvense plattform (se tabell over Materialer for plattformen som brukes i denne protokollen).
- Beregn prøvekonsentrasjon i nM som
er konsentrasjonen av prøven i ng / mL og 
er sekvensen lengden av prøve-DNA (~ 360 bp). Fortynn prøve til 4 nM i EB buffer. - Følg produsentens instruksjoner for å denaturere prøve og fortynn til 21:00 i hybridisering buffer.
- Load 600 ul prøve i reagensforpakningen. Sequence følge produsentens instruksjoner og meldingene på skjermen.
- Beregn prøvekonsentrasjon i nM som
- Forbered 25 mL PCRs å de-multiplekse NNS sub-bibliotek grupper med ortogonale primere
- Analyse av sekvensdata
- Last ned Flash (Fast Lengde justering av korte leser) 20, plasser i mappen sammen med fastq.gz filer hentet fra sekvensering.
- Bruk Flash for å delta i fastq.gz filer som tilsvarer den parvise end leser for hvert par av indekser (forover og bakover leser for hver NNS underbibliotekgruppen for forvalg og utvalgs kulturer).
- Etter at han begynte hvert par av lyder, plassere out.extendedFrags.fastq utdatafilen i egne mapper for resultatene fra de forvalg eller utvalgs kulturer. Endre navn på out.extendedFrags.fastq utdatafilen henhold til NNS sub-bibliotek gruppe som det tilsvarer (ie., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
- Kjør beregningsskript NNS_DataAnalyzer.m (Se tilleggskode File) fra hver mappe til å beregne teller for hver enkelt aminosyre mutasjon, og teller for villtype, for hver NNS sub-bibliotekgruppen.
- Beregn treningseffekten
av hver mutasjon som basis ti logaritmen av forholdet mellom tellinger oppnådd i seksjonen (
) Versus forhåndsvalg ( 
) Tilstand, i forhold til villtype: 
.
er konsentrasjonen av prøven i ng / mL og 
er sekvensen lengden av prøve-DNA (~ 360 bp). Fortynn prøve til 4 nM i EB buffer. 
av hver mutasjon 
) Versus forhåndsvalg ( 
) Tilstand, i forhold til villtype: 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasmidet kart for de fem modifiserte pBR322-plasmider inneholdende ortogonale grunningssider (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) er vist i figur 2A. For å teste hvorvidt de ortogonale primerne er spesifikke, PCR ble utført ved bruk av hvert par med ortogonale primere enkeltvis, sammen med alle fem pBR322_OP1-5 plasmider, eller med alle plasmider minus plasmidet som samsvarer med ortogonale primerpar. Det korrekte produkt ble bare oppnådd når det samsvarende plasmidet ble inkludert, og intet produkt i alle størrelser som ble oppnådd i dens fravær (figur 2B).
Et representativt eksperiment ble utført ved å følge protokollen som er beskrevet i denne teksten (figur 1). Etter behandling (protokoll pkt 4.2), 6.2 × 10 6 leser fra pre-utvalget tilstand og 6,3 × 10 6 leser fra 50 ug / ml ampicillin utvalg Kondisjonevidere ble oppnådd. Resultatene oppnådd for hver teller aminosyre mutasjon fra pre-utvalget tilstand vise en karakteristisk log-normalfordeling (figur 3A) 13. Minst en telling fra sekvensering av forhåndsvalg kultur for 98,9% av mutasjoner (58 hadde ingen tellinger), og større enn 100 tellinger for 91,2% (465 hadde mindre enn 100 tellinger) ble oppnådd. 3B viser den relative treningseffekten () for hver mutasjon i hver posisjon av TEM-1; fordelingen er vist i figur 3C. Under utvalg på 50 ug / ml ampicillin, de fleste mutasjoner har en nøytral eller nesten nøytral-treningseffekt (≈ 0, svarende til hvite bildeelementer i figur 3B, og den store topp i figur 3C). En liten fraksjon av mutasjoner ved denne konsentrasjonen ha betydelige virkninger på trenings (<< 0, svarende til blå bildeelementer i figur 3B, og den venstre halen på figur 3C); exp ectedly, disse inkluderer mutasjoner innenfor svært konserverte aktive språk rester (S70, K73, S130, D131, N132, K234 og G236) 13,14. I motsetning til dette, noen mutasjoner betraktelig øke kondisjon over at av TEM-1 (>> 0, svarende til rød bildeelementer i figur 3B), som kan bli ventet siden TEM-1 er svært effektiv ved ampicillin hydrolyse ( 
≈ 10 7 M -1 s -1) 14.
Figur 1. Oversikt over Whole-protein Saturation Mutagenese Protokoll for TEM-1 β-laktamase henhold Ampicillin Selection. Handlinger som beskrevet i protokollen er vist i fet skrift. Nummererte protokoll trinn er vist til venstre, for henvisning til hovedteksten.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Validering av Orthogonal Grunning nettstedet Plasmid vektorer. (A) Plasmid kart for de fem modifiserte pBR322 plasmider som inneholder ortogonale grunning sider (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). Plassering og retning av de ortogonale grunning setene er angitt. Plassering av flere restriksjonssetene er merket; TEM-1 hel-protein metning mutagenese bibliotek (som omfatter hele TEM-1 genet og promoter) er klonet i-mellom Aatll og AvrII restriksjonsseter. Forkortelser: tet tetrasyklinresistensgenet Ori replikasjonsorigo (B) Hvert par av ortogonalt primere (OP1-OP5) ble testet i en PCR som inneholder alle fem pBR322_OP1-5 plasmider (+), eller med alle plasmider minus det respektive plasmidet (. ˗). Vist er en etidiumbromidfarget agarosegel (1% w / v) lastet med hver PCR-reaksjon, størrelse separert ved elektroforese. Den forventede størrelsen Produktet er 1628 bp; den første kjørefelt er en DNA-stigen, størrelser av relevante standarder er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Resultater av TEM-1 β-laktamase Whole-protein metning eksperiment. (A) histogram som viser fordelingen av tellinger for hver aminosyre mutasjon oppnådd fra high-throughput sekvensering av biblioteket fra den forhåndsvalg tilstand. For enkelhets skyld er mutasjoner med null teller (53 mutasjoner) vist med en telling på en. (B) Diett virkninger av alle enkelt aminosyre-mutasjoner i TEM-1 i henhold til valg ved 50 ug / ml ampicillin. Vist er datamatrise som inneholder relative treningseffekt () avbildet kolorimetrisk med blå representerer skadelig effekt, rød en positiv effekt og hvit ingen treningseffekt i forhold til villtype. Mutasjoner som ingen tellinger ble hentet fra den pre-utvalget kultur er farget svart. Rader viser posisjoner langs den primære sekvensen og kolonnene angir mutasjon til en av tyve aminosyrer eller stopp-kodon (angitt med en-bokstavkode, * er stoppkodonet); den sekundære struktur av TEM-1 er indikert ved venstre og flere høyt konserverte motiver innenfor det aktive sete er angitt til høyre. (C) histogram som viser fordelingen av relative egnethet effekter. Vist er resultater for disse mutasjonene med> 100 tellinger hentet fra sekvensering av pre-utvalget kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| reagens | Mass eller Volum | Kommentar |
| Typtone | 2 g | |
| Gjærekstrakt | 0,5 g | |
| Natriumklorid | 0,06 g | |
| Kaliumklorid | 0,02 g | |
| magnesium sulfat | 0,24 g | |
| Renset vann | 100 ml |
Tabell 1. Super Optimal buljong (SOB). Reagent navn og mengder som brukes i forberedelsene 100 ml SOB (Protocol trinn 1.1).
| reagens | Mass eller VolUme | Kommentar |
| Typtone | 10 g | |
| Gjærekstrakt | 5 g | |
| Natriumklorid | 10 g | |
| Renset vann | 1 L |
Tabell 2. Luria-Bertani buljong (LB). Reagent navn og mengder brukt i forberedelsene 1 L LB (protokoll trinn 1.1).
| reagens | Mass eller Volum | Kommentar |
| Typtone | 10 g | |
| Gjærekstrakt | 5 g | |
| Natriumklorid | 10 g | |
| agar | 15 g | |
| Renset vann | 1 L |
Tabell 3. LB-agar. Reagensnavn og mengder som brukes i forberedelsene LB-agar (protokoll trinn 1.1).
| reagens | Volum | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 1,450 mL | |
| additiv PCR | 1,450 mL | |
| 2 mm dNTP | 725 mikroliter | 2 mm hver nucleotide |
| 50 mikrometer AatII_F eller AvrII_R primer | 145 mikroliter | |
| 1 ng / mL pBR322_AvrII plasmid | 145 mikroliter | |
| 2 enheter / ul DNA polymerase | 72,5 mL | |
| vann | 363 mikroliter |
Tabell 4. Første runde Mutagent PCR Master Mix. Reagent navn og mengder for å forberede master mix for første runde mutagene PCR (protokoll trinn 2.2.1). Samlet mengde er tilstrekkelig for 290 25 ul reaksjoner.
| reagens | Volum | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 1,450 mL | |
| additiv PCR | 1,450 mL | |
| 2 mm dNTP | 725 mikroliter | 2 mm hver nucleotide |
| 50 M AatII_F primer | 145 mikroliter | |
| 50 M AvrII_R primer | 145 mikroliter | |
| 2 enheter / ul DNA polymerase | 72,5 mL | |
| vann | 2,973 mL |
Tabell 5. Andre runde Mutagent PCR Master Mix. Reagent navn og mengder for å forberede master mix for andre-runde mutagene PCR (protokoll trinn 2.2.2). Samlet mengde er tilstrekkelig for 290 25 pl reaksjoner.
| reagens | Volum | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 20 mL | |
| additiv PCR | 20 mL | |
| 2 mm dNTP | 10 ul | 2 mm hver nucleotide |
| 50 M AvrII_F primer | 2 pl | |
| 50 mikrometer AatII_OP1_R - AatII_OP5_R primer | 2 pl | en primer per reaksjon, sammen med respektive plasmid |
| 1 ng / mL pBR322_OP1-5 plasmid | 2 pl | en plasmid per reaksjon |
| 2 enheter / ul DNA polymerase | 1 mL | |
| vann | 43 mL |
Tabell 6. Kloning Vector PCR. Reagent navn og mengder for å forberede PCR for å gjøre kloning vektorer (protokoll trinn 2.3.2).
| reagens | Volum | Kommentar |
| 10x restriksjonsenzymbuffer | 5 pl | |
| 4 enheter / mL AvrII | 2,5 mL | |
| 20 enheter / mL AatII | 0,5 ul | |
| DNA til restriksjonskutting | volum for 500 ng | |
| vann | til 50 pl totalt volum |
Tabell 7. Restriction Digest. Reagensnavn og mengder for restriksjonsspaltninger av kloning vektorer og NNS sub-bibliotek grupper (protokoll trinn 2.3.3).
| reagens | Volum | Kommentar |
| 10 x T4 DNA-ligasebuffer | 5 pl | |
| renset begrensning-fordøyd NNS sub-bibliotek gruppe DNA | volum for 48 ng | |
| renset begrensning-fordøyd kloningsvektor DNA | volum for 52 ng | |
| 400 enheter / pl T4 DNA-ligase | 1 mL | |
| vann | 20 fil totalvolum |
Tabell 8. Liger Reagent navn og mengder for ligations kloning vektorer med restriksjonsfordøyd NNS sub-bibliotek grupper i et 1: 3. Vektor: sett molarforhold (protokoll trinn 2.3.4).
| reagens | Volum | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 55 mL | |
| additiv PCR | 55 mL | |
| 2 mm dNTP | 27,5 mL | 2 mm hver nucleotide |
| 2 enheter / ul DNA polymerase | 2,75 mL | |
| vann | 113 mikroliter |
Tabell 9. PCR reagenser for å forberede prøver for High-throughput sekvensering. Reagent navn og mengder for å forberede PCR Master Mix brukes til de-multipleksing med ortogonale primere (4.1.1), isolere NNS sub-bibliotek grupper (protokoll trinn 4.1.2) og legge indeksering sekvenser (protokoll trinn 4.1.3). Samlet mengde er tilstrekkelig for 11 25 pl reaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her en protokoll er beskrevet for utførelse av funksjonell vurdering av hel-protein metning mutagenese biblioteker, ved hjelp av high-throughput sekvenseringsteknologi. Et viktig aspekt ved fremgangsmåten er bruken av ortogonale primere under kloningsprosessen. I korthet, blir hver aminosyre stilling randomisert av mutagene PCR, og blandet sammen i grupper av stillinger som kombinert sekvenslengde opptas av high-throughput-sekvensering. Disse gruppene er klonet inn i plasmidvektorer inneholdende par av ortogonale grunnings områder, blandet sammen og underkastet seleksjon, og deretter de-multiplekset ved hjelp av de ortogonale primere, og deretter dyp sekvensert. Ettersom mutasjoner er begrenset innenfor sekvenser lese lengdebegrensningen, maksimerer denne tilnærmingen antall nyttige lesninger inneholdende mutasjoner i gener som er av størrelse lengre enn sekvense lese lengde. I tillegg gir denne teknikken for samtidig eller "en-sats" utvalg av hele mutational bibliotek, noe som reduserer arbeidsbelastningen, så vel som muligheten for at mutasjoner oppleve forskjellige nivåer av utvalget. Praktisk talt, de kritiske trinn i protokollen hovedsak dreie seg om organiseringen: under kloning prosessen (protokoll trinn 2.3) må man sikre riktig blanding av mutagene PCR-produkter inn i grupper og deres påfølgende kloning i riktig ortogonale priming nettstedet vektor; under fremstillingen av prøven for sekvensering (protokoll trinn 4.1), til de riktige ortogonale primere, så vel som primere isolere hver av de NNS sub-bibliotek grupper og legge til indekserings sekvenser, må brukes.
De tre viktigste trinnene i protokollen - bibliotek konstruksjon, valg, og sekvense - kan endres i flere aspekter. Under bibliotek konstruksjon man kunne innføre mutasjoner ved hjelp av en rekke forskjellige teknikker, for eksempel ved å utsatt for feil PCR, eller ved å konstruere genet ved å bruke oligonukleotider syntetisert ved å dope i en liten brøkdel av alternative nukleotids 21. Man kunne konstruere biblioteket for å inkludere doble eller høyere orden mutasjoner innenfor segmenter av protein (dvs. NNS sub-bibliotek grupper), eller i alternative genotype bakgrunn 22. Viktigere, alle modifikasjoner av biblioteket konstruksjonstrinnet bør imidlertid oppfylle det kriterium som korrespondansen mellom plasseringen av mutasjoner i sekvensen og sekvensering lese lengden opprettholdes. Dette kriteriet utelukker derfor anvendelse av protokollen til omfattende studier av multiple mutasjoner på tvers av et protein. Endringer til den andre delen av protokollen omfatter alternative valg betingelser: (. F.eks, temperatur, næringsinnhold) ulike β-laktam typer (eller kombinasjoner) og konsentrasjoner, ytre stressforhold, host type (for eksempel ulike typer bakterier), eller forskjellige prøvetakings ganger (timer til dager). For eksempel, i tidligere arbeid undersøkte vi fitness effekten av alle enkelt aminosyre mutasjoneri TEM-1 under ulike konsentrasjoner av ampicillin, og under den tredje generasjons cefalosporin cefotaksim 13. Med hensyn til det tredje trinnet av protokollen som vi ikke anbefaler å avvike fra valg av sekvense plattformen som brukes her (se tabell for material). Mens sekvense lese lengder er faktisk for tiden lenger i andre plattformer, leser antall oppnåelig er for tiden langt lavere; Generelt nøyaktigheten til hvilken virkningen av en mutasjon kan bestemmes er proporsjonal med antallet av lesninger oppnådd (se ligning i protokollen trinn 4.2.5).
I stor grad for enkelthets skyld bruker protokollen TEM-1 β-laktamase som et modellsystem, men metoden beskrevet her kan utvides til andre systemer der en high-throughput utvalg eller screening-analyse er på plass. Bygging av slike analyser er imidlertid ofte ikke-triviell: Først må det etableres en strategi for compartmentalization av genet (mutasjon) og protein sammen, For eksempel innenfor en celle, væskedråper (som i en MicroFluidics plattform), eller ved fag-display. For det andre, og viktigst, en kvantitativ sammenheng mellom protein funksjon og en valgbar fenotype, eller fitness, må etableres. For enzymer involvert i metabolisme eller antibiotikaresistens, er evnen av celler til å vokse i nærings drop-out eller antibiotiske media ofte en direkte funksjon av enzymatisk aktivitet. En mer syntetisk tilnærming kunne brukes i andre systemer, for eksempel ved å koble protein-proteinbindende affinitet til rapportørgenet (f.eks., Fluorescerende protein) ekspresjon i bakterier eller gjær 11,23, eller ved hjelp av et fluorogent enzymsubstrat i et MicroFluidics system 24 . Til slutt, må en slik assay være skalerbare, for å ta opp størrelsen av en hel-protein mutagenese-bibliotek.
Oppsummert en high-throughput sekvensebasert tilnærming for funksjonell vurdering av hel-protein metning mutagenese biblioteker er descrIbed her. Sentralt i tilnærmingen er konstruksjonen av mutagenese-bibliotek i segmenter langs genet, og utnyttelse av ortogonale primer strekkoder for å kode hver segment for multipleksing og de-multipleksing biblioteket. Vi forventer at denne protokollen kan lett brukes til andre proteiner som en passende høy gjennomstrømming valg eller skjermen har blitt utviklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
