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Artigo de método

Modelo Câmara fêmur Janela para

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⸱

DOI:

10.3791/54205

⸱

28 de julho de 2016

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Techna Institute, University Health Network

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Resumo

A medula óssea é um órgão complexo que contém várias células hematopoiéticas e não hematopoiéticas. Essas células estão envolvidas em muitos processos biológicos, incluindo hematopoiese, regulação imunológica e regulação tumoral. Métodos comumente usados para entender as ações celulares na medula óssea, como histologia e hemogramas, fornecem informações estáticas em vez de capturar a ação dinâmica de vários componentes celulares in vivo. Para complementar os métodos padrão, um modelo baseado em câmara de janela (WC) foi desenvolvido para permitir imagens seriadas in vivo de células e estruturas na medula óssea murina. Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para instalação da CC no fêmur, a fim de facilitar o acesso óptico a longo prazo à medula óssea femoral. Em particular, para demonstrar sua utilidade experimental, essa abordagem WC foi usada para obter imagens e rastrear neutrófilos dentro da rede vascular do fêmur, fornecendo assim um novo método para visualizar e quantificar o tráfego e a regulação de células imunes na medula óssea. Este método pode ser aplicado para estudar vários processos biológicos na medula óssea murina, como hematopoiese, transplante de células-tronco e respostas imunes em condições patológicas, incluindo câncer.

Introdução

A medula óssea é um órgão importante envolvidos na hematopoiese e regulação imune. É constituída por um componente que contém células germinais hematopoiéticas e progenitoras hematopoiéticas (hspCs), e um componente do estroma contendo células progenitoras não hematopoiéticas que dão origem a células mesenquimais 1. Dois terços da actividade hematopoiética é dedicado à produção de células mielóides 2. Em particular, um grande número de neutrófilos são produzidas na medula óssea, com 1-2 x 10 células 11 gerado por dia num ser humano adulto normal 2. Os neutrófilos são a primeira linha de defesa contra infecções microbianas e muitas vezes são reservados na medula óssea até que o estresse desencadeia a sua mobilização para completar os neutrófilos periféricos 1,3. Em adição aos seus efeitos anti-microbianos, estudos recentes sugerem um papel importante na biologia de neutrófilos cancro, tendo ambos pro- e anti-tumorigénica fenótipos dependendo de crescimento transformantefator beta (TGF-β) de sinalização no microambiente tumoral 4,5. Além disso, estudos demonstraram que os neutrófilos que se acumulam em tumores primários exercer efeitos pró-tumorigénicas e metastáticos através da supressão da função das células T citotóxica 6,7, enquanto que os neutrófilos em circulação exercer um agente citotóxico, efeito anti-metastático 8. Como tal, a investigação de células hematopoiéticas da medula óssea, particularmente os neutrófilos, é crucial para elucidar o seu papel na regulação imune e tumor.

A histopatologia e uma contagem completa do sangue periférico são rotineiramente usadas para avaliar as alterações celulares e estruturais na medula óssea 9. No entanto, estes métodos apenas fornecem informação estática de diferentes populações de células ou de tecidos microestruturas. Longitudinal imagem in vivo pode ser utilizado em combinação com os métodos padrão para avaliar a dinâmica de vários componentes celulares, vasculares e do estroma, bem como célula-a-Cinterações ell de forma longitudinal. Microscopia intravital (IVM), definida como imagem de animais que vivem em microscópica resolução 10, é particularmente útil para avaliar os processos celulares dinâmicas ao longo do tempo na mesma amostra, reduzindo o número de animal experimental necessário. IVM é frequentemente combinada com uma câmara janela cronicamente transplantado (WC) para acessar o órgão de interesse para geração de imagens ao longo de um período de semanas a meses. modelos WC cranianos e dorsal-dobra cutânea tem a mais longa história de uso que remonta a meados de 1990. Mais recentemente, outros modelos WC especificas de órgãos, tais como os de almofada de gordura mamaria e vários órgãos abdominais foram desenvolvidos 11.

A abordagem típica para geração de imagens de medula óssea in vivo tem uma exposição envolvido principalmente da calvária de ratos, onde o osso mais fina permite a visualização direta de células individuais com o mínimo de intervenção cirúrgica 12-14. No entanto, a medula óssea pode b calváriae distinta da de outros ossos, tais como o osso longo, tal como demonstrado por um menor número de hspCs e células hipóxicas em calvárias, o que indica a manutenção e desenvolvimento de hspCs 15 reduzida. Portanto, abordagens alternativas para avaliar os componentes celulares do osso longo têm sido investigados. Estes incluem a exposição direta da medula óssea femoral 16 e transplante ectópica do fêmur divisão na dobra cutânea dorsal WC 17. No entanto, o primeiro é um procedimento terminal que não permite o rastreamento de alterações celulares, estruturais e funcionais durante períodos de tempo mais longos, e este último provavelmente perturba a função normal da medula óssea devido ao transplante de fêmur a um site ectópica no interior do WC dorsal de dobras cutâneas. Um outro método que permite imagens seriadas ortotópico de medula óssea femural ao longo do tempo é o uso de um WC no osso femoral. Um relatório anterior demonstrou imagem latente a longo prazo da microcirculação na medula óssea do fémur usando umfêmur WC em ratos 18. Além disso, os autores demonstraram a visualização de células tumorais no fémur, o que indica a sua utilidade em metástases da medula óssea de monitorização. No entanto, este design WC era limitado pelo seu grande tamanho (1,2 cm de diâmetro) e a área de imagem relativamente pequena (4 mm de diâmetro), o que era apenas adequado para grande ratinhos (26-34 g, 3-6 meses de idade), tornando assim o aproximar-se impraticável para uso rotineiro.

Por conseguinte, um novo WC com um tamanho global menor e maior área de imagem interna foi concebido para a finalidade do presente estudo. O objectivo deste estudo foi o de proporcionar um método para imagiologia de vários tipos de células na medula óssea do fémur. O modelo WC fêmur foi desenvolvido in-house e foi usado para visualizar e acompanhar neutrófilos dentro da rede vascular 3D. Utilizando este modelo, MIV da medula óssea pode ser realizado em série ao longo de 40 dias. Esta abordagem pode ser aplicada a uma variedade de campos para elucidar os processos de hematopoiese, uma regulação imuneo desenvolvimento do tumor nd.

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Protocolo

NOTA: Todos os trabalhos animal foi realizado sob o protocolo nº 2615 aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Rede Universitária de Saúde.

1. Preparação cirúrgica do Rato

  1. Antes da cirurgia, todos os esterilizar instrumentos cirúrgicos e a câmara de janela (CC) em autoclave. Suplemento da água potável com 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina de 2 dias antes da cirurgia. Injectar o rato com 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por via intraperitoneal quatro horas antes da cirurgia.
  2. Anestesiar o rato nu atímicos por injeção intraperitoneal de solução salina 350-400 ul contendo 80 mg / kg de ketamina e 13 mg / kg de xilazina (Nota: Este foi aprovado pela Comissão de Cuidados Institucionais Animal, e nós não ter tido qualquer experiência com efeitos adversos ). Confirmar a anestesia adequada através de testes de reflexo pé. Continue observando para padrão respiratório, a cor das mucosas e do reflexo do pé durante o procedimento.
  3. Executar a pr cirúrgicaocedures sob uma cabine de segurança biológica para manter condições estéreis durante a cirurgia. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento eléctrico coberto com um tecido cirúrgico para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. Executar todos os procedimentos cirúrgicos sob o microscópio estereoscópico.
  4. Aplicar pomada para manter os olhos úmidos durante a cirurgia. Repita se necessário durante o procedimento cirúrgico. Esterilizar a área operacional do mouse limpando com 7,5% iodopovidona, álcool isopropílico a 70% e 10% iodopovidona consecutivamente, e repita este procedimento duas vezes.
  5. Faça um 10 milímetros incisão cutânea longitudinal usando bisturi com lâmina (# 15), aproximando-se do fémur do lado lateral. Expor o fêmur entre os músculos flexores e extensores por dissecção romba usando uma pinça e hemostats para garantir a funcionalidade muscular.
  6. Inserir a barra em forma de U sob o osso, e instalar a CC (Figura 1). Fixe a barra com a janela usando duas porcas, e aperte as porcas com aceps. Encher o espaço entre o osso e o WC com cimento dental.
  7. Triturar o osso cortical numa região de 6 x 2 mm2 com um micro-broca para ganhar acesso óptico para a cavidade medular.
    Nota: Verifique cuidadosamente afinamento do osso cortical sob o microscópio durante a realização deste procedimento. Deixar uma camada de periósteo intacto, quase transparente do osso.
  8. Coloque a lamela 8 mm sobre a janela, e garantir a lamela com um anel elástico para mantê-lo no lugar.
  9. Reajuste a musculatura dos flexores e extensores de volta para seus locais originais usando uma pinça para manter a sua função após a cirurgia. Suturar a derme usando 5-0 sutura e um suporte de agulha.
  10. Monitorar o mouse para a recuperação, até que ele está consciente e é capaz de se mover livremente. Coloque o animal em uma gaiola nova, quando recuperado.
  11. Após a recuperação, realizar a aquisição de imagens sobre o animal no mesmo dia ou nos dias seguintes (ver secção 2). Monitorar o physicondição de cal do mouse diária.
    Nota: Monitorar as condições físicas, tais como rolamento de peso no membro, curvando, respiração rápida ou superficial, inchaço dos membros posteriores, auto-mutilação, celulite e dermatite grave.
  12. Dê injecção intraperitoneal de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por 3 dias, e 1 mg / kg de peso corporal do meloxicam durante 5 dias após a cirurgia para o tratamento da dor pós-operatória e inflamação. Continuar a fornecer a água suplementada com amoxicilina durante 5 dias.
  13. No ponto final experimental, sacrificar o animal por CO 2 narcose seguido por um método secundário (por exemplo, deslocamento cervical).

2. Aquisição de Imagem Usando Combined multi-fótons e microscopia confocal

  1. Antes da imagiologia, anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal de uma solução salina de 350-400 ul contendo 80 mg / kg de cetamina e 13 mg / kg de xilazina. Como alternativa, use anestésico inalável, quando disponível.Aplicar pomada.
  2. Injectar a mistura de corantes intravasculares para a vasculatura rotulagem (0,65 mg de 2 MDa de fluoresceína (FITC) -dextrano) e neutrófilos (4 ug de aloficocianina (APC) anticorpo-Ly6G -anti).
  3. Usar um multi-fotão vertical combinadas e microscópio confocal equipado com um laser multi-fotão variando 705-980 nm para a excitação de dois fotões, bem como lasers de fotões individuais que fornece os comprimentos de onda de excitação de azul para vermelho.
  4. Definir um estágio de imagem feitos sob medida para o microscópio (Figura 1B). Fixe o mouse sobre o palco, fixando as duas extremidades do WC com pinças.
    Nota: Os componentes críticos da fase são: duas pinças para segurar o WC, e um elemento de aquecimento para manter a temperatura fisiológica (37 ° C) do mouse durante o exame.
  5. Ligue o laser de dois fótons e do sistema confocal, e lançar o software de aquisição de imagem, clicando em "Sistema Start". Uma janela com 4 abas (Localize,Aquisição, processamento e manter) será aberta.
  6. Configurar os canais de imagem. Clique em "Configuração Inteligente" sob a guia Aquisição e escolher os corantes que serão utilizados para geração de imagens: FITC (488 nm de excitação, 493-588 nm de emissão) e APC (633 nm de excitação e de emissão 638-743 nm). Escolha "Melhor Signal" e clique em "Aplicar".
  7. Adicionar a geração de segundo harmônico (SHG) imagem canal de aquisição manualmente. Ligue o laser de dois fótons sob a janela "Laser" na guia Acquisition. Sob a janela de Canais, clique no sinal "+" para adicionar uma faixa.
  8. Configure a faixa SHG. Alterar o comprimento de onda de 840 nm sob a janela Canais usando as setas acima e abaixo, e escolher a faixa de detecção para ser 415-425 nm sob a janela "Caminho de Luz", utilizando a barra deslizante.
  9. Clique em "ocular Online" na guia Localizar. Clique FITC sob a configuração de filtro para FITC para visualizar a região de interesse e ajustar o foco manualmente, virando tele concentrar botão do lado do microscópio. Quando a região de interesse está localizado, clique em "ocular off-line", na guia Localizar.
  10. Clique na guia Acquisition. Selecionar a trilha FITC sob a janela Channels e clique em "Live" para visualizar a imagem de FITC-dextrano com objetivo de 5X. Ajuste o foco, se necessário, e clique em "Stop" na guia Acquisition para parar a pré-visualização.
  11. ligar manualmente a 20X objetivo água movendo uma roda por cima das lentes. Ver a imagem novamente para FITC-dextrano com o objetivo 20X, e ajustar Ganho Master e Pinhole sob a janela de Canais para conseguir sinal e um contraste perfeito. Repita o procedimento para outros canais, selecionando faixas de APC e SHG sob a janela de Canais.
  12. Escolha os parâmetros de imagem. Clique em "Modo de Aquisição" para abrir a janela. Defina o tamanho do quadro para ser 1.024 x 1.024 pixels, e média de 4X para obter imagens de alta qualidade.
  13. Adquirir um instantâneo 2D. Selecione todos os canais sob Canais ganhardow e clique em "Snap", na guia Acquisition. Verifique a qualidade da imagem e alterar os parâmetros de imagem, se necessário.
  14. Adquirir imagem time-lapse 2D.
    1. Verifique fora "Séries Temporais" na guia Acquisition para abrir a janela Time Series. Digite 0 sob os intervalos, e 40 para o número total de verificações para levar 40 imagens continuamente, sem intervalo de tempo.
      Nota: 40 scans gera cerca de 5 minutos de tempo-série com uma velocidade de digitalização de 7,5 seg / frame e o tamanho da imagem de 600 mm x 600 mm. Ajuste o intervalo e número de exames, dependendo do microscópio, as configurações de aquisição de imagem ea taxa de quadros da câmera. Um intervalo de tempo fixo (> 0 seg) pode ser utilizado para comparar imagens de lapso de tempo adquiridas em diferentes pontos de tempo. Uma duração de imagem mais lapso de tempo pode ser necessária, dependendo da velocidade média esperada de neutrófilos (ou outras células de interesse) na condição experimental.
  15. Adquirir imagem 3D.
    1. Verifique fora "Z-Stack" na guia Acquisition para abrir a janela Z-Stack. Iniciar o modo de visualização "ao vivo" para FITC-dextrano. Concentre-se no topo da amostra e clique em "Set First", e concentrar-se na outra extremidade da amostra e clique em "Definir Última" na janela do Z-stack.
    2. Defina o intervalo a ser de 10 mm sob a janela do Z-stack. Dependendo da primeira e da última fatia óptico seleccionada na etapa anterior, isso irá gerar 10-20 fatias, com a espessura óptica total de 90-180 uM.
      Nota: O intervalo de Z-pilha é dependente do tamanho do furo de pino, que determina a espessura da fatia óptico. Definir o intervalo a ser menos do que a espessura da fatia óptico.
    3. Clique em "Iniciar Experimento" na guia Acquisition para começar a recolher imagens.
  16. Adquirir imagem time-lapse 3D.
    1. Verifique fora "Séries Temporais" e "Z-stack" na guia Acquisition para abrir o Time Seriese as janelas Z-stack.
    2. Configurar o Time Series e parâmetros de aquisição Z-stack como descrito nos passos 2.14 e 2.15. Clique em "Iniciar Experimento" na guia Acquisition para começar a recolher imagens.
  17. Monitorar o mouse durante o exame para ter certeza que é estável e inconsciente. Se o mouse é instável e / ou consciente durante o exame, remova o mouse do palco, injetar adicionais 100-150 mL da solução anestésica por via intraperitoneal, e continuar de imagem.
    Nota: Os sinais de instabilidade incluem respiração rápida e movimento do mouse, o que pode ser visto como deslocando artefatos em imagens adquiridas.
  18. Após a aquisição da imagem, dê o mouse para fora do palco e devolvê-lo para a jaula. Use uma lâmpada de aquecimento para mantê-lo quente, e monitorar o rato até que ele esteja consciente.

Análise 3. Imagem e quantificação

  1. Usar a imagem de software de análise para analisar os dados em 3D e de séries temporais. Abra o software eadicionar imagens arrastando-os para a tela aberta, que é chamado vista "Arena". Clique duas vezes em um arquivo de imagem para abri-la; a imagem será aberta em vista "Superar".
  2. Criar uma imagem 2D / 3D.
    1. A partir do bar "Mais" encontrado no canto superior direito, clique em "Editar / Show Ajuste Display" para abrir a janela "Display Ajuste". Otimizar a exibição de fluorescência, ajustando os limites para cada canal e tirar um instantâneo para salvar a imagem.
  3. Gerar faixas de objetos a partir de imagens de lapso de tempo.
    1. Abra a imagem a ser analisada sob visão "Superar". Clique no ícone com uma imagem de pontos alaranjados, encontrada abaixo do ícone "Superar". Isto irá abrir uma nova janela "Spots".
    2. Verifique fora "pontos de trilha (com o tempo)" e clique na seta azul para ir para a próxima etapa. Selecione o canal que contém os objetos para rastrear sob "Channel Source", e definir o diamet objeto estimadoer under "diâmetro XY estimado", digitando um número. Clique na seta azul para ir para a próxima etapa.
      Nota: Para o acompanhamento de neutrófilos, seleccionar o canal que contém a APC fluorescência para os neutrófilos e definir o diâmetro do objecto a 12 um com base no tamanho conhecido de neutrófilos.
    3. Na janela, localizar e selecionar o filtro "Qualidade", clicando na seta para baixo. Observe os pontos definidos pelo software e ajustar manualmente o limiar para incluir ou excluir pontos. Uma vez limite é definido, clique na seta azul para ir para o passo "Tracking".
    4. No caso do algoritmo, localizar e selecionar "Motion Algoritmo Autoregressive", clicando na seta para baixo. Digite 10 mm para "Max Distance" e 3 para "Max Gap Size" encontrado em Parâmetros. Verifique fora "preencher as lacunas com todos os objectos detectados" para começar a controlar, e clique na seta azul para ir para a próxima etapa.
      Nota: "algoritmo de movimento Autoregressive" é usado fou objetos que têm direcionado o movimento, uma vez que gera faixas com base na localização prevista do movimento anterior. "Max Distance" e "Max Gap tamanho" pode ser ajustado dependendo da dimensão e velocidade do objeto esperado sendo monitorado, bem como a duração total da imagem time-lapse.
    5. Em Tipo de Filtro, selecione o filtro "Track Duração". Clique na seta verde para finalizar rastreamento, e verificar as faixas que foram gerados. Volte para a etapa anterior se necessário para classificar manualmente as faixas.
  4. Se os desvios imagem lapso de tempo gerados, corrigir o desvio de translação.
    1. Clique no ícone com uma imagem de um lápis. Este é um guia de edição que se abre "Tracks Editar" janela. Examine a imagem de lapso de tempo e encontrar um ponto de referência que não deve estar se movendo para todas as imagens.
    2. No canto superior esquerdo da tela, encontrar "Pointer" janela e verificar fora "Select" para activar o cursor para a selecção de um local. Clique no local de referência.
    3. Clique em "Deriva Correct" na janela "Editar faixas". Verifique fora "Translational tração". O software irá gerar automaticamente a série corrigida de imagens.
  5. Medir o movimento celular definida pelas faixas de objetos em imagens de lapso de tempo.
    1. Sob a janela "Editar faixas", marque "Tracks" e selecione uma faixa que representa o movimento de uma célula. A faixa selecionada será destacada em amarelo na imagem de séries temporais.
    2. Clique no ícone com uma imagem de um gráfico para abrir a janela (guia estatísticas) "Estatísticas".
    3. Em "Selection", selecione "Track Velocidade Média", clicando na seta para baixo para gerar a velocidade em pista significa para a faixa selecionada. Escolha diferentes faixas e repita os passos para medir a velocidade em pista significa para todas as células de interesse.

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Resultados

Medula óssea femural de murino é acessado com sucesso utilizando o WC para permitir a visualização de neutrófilos individuais e redes vasculares. A Figura 1 mostra o instrumento WC e descreve o procedimento cirúrgico, o que envolve a exposição do osso femoral e adelgaçamento do osso cortical para ganhar acesso óptico no interior da osso. A cirurgia é bem tolerada em ratinhos; eles foram avaliados para reações físicas adversas, como inchaço dos membros posteriores, não-pe...

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Discussão

Em tempo real, imagens seriadas dos processos celulares dinâmicos na medula óssea fornece a informação que é de outro modo difícil de obter usando técnicas convencionais tais como a histologia e as contagens sanguíneas totais. O modelo WC fêmur descrito aqui fornece uma oportunidade única para investigar alterações celulares e estruturais na medula óssea ao longo do tempo. Embora um modelo fêmur CC tem sido relatado anteriormente, o nosso design inovador proporciona um campo de imagem de visão maior e menor dimensão glo...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Avançada Microscopia Óptica (www.aomf.ca) na University Health Network para assistência com a microscopia, e o Sr. Jason Ellis do Cancer Center Machine Shop Princess Margaret para o fabrico do WC e do estágio de imagem. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Iris Kulbatski para a edição do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos nus atímicos NRCNU-FTaconicNcr nus8-10 semanas de idade, fêmeas
SalineBaxterJB1302P
Cloridrato de cetaminaBioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529
xilazinaBayer HealthCare, Bayer Inc.Campo cirúrgico DIN 02169592
ProximaDYNJP2405
Almofada de aquecimento elétricaEstereomicroscópio da Marca Life57800827375
LeicaM60
(gel lacrimal)Novartis T296/2
7,5% betadinePurdue Frederick Co67618-151-16
70% álcool isopropílicoGreenFieldP010IP7P
10% betadinePurdue Frederick Co67618-150-05
Cabo de bisturiFine Science Tools10003-12
Lâmina de bisturi (#15)VWR89176-368
Tesoura de mola curvadaFerramentas de Belas Ciências15023-10
Baby-Mixter HemostatFerramentas de Belas Ciências13013-14
Tesouras FinasFerramentas de Belas
Pinça Graefe Extra FinaFerramentas de Belas Ciências11151-10
Halsted-Mosquito HemostáticosFerramentas de Belas Ciências13008-12
Micro-brocaHarvard Apparaus72-6065
Micro-broca rebarbasFine Science Tools19007-14
Câmara de janela de fêmurPMCC oficina de máquinadesign personalizado9,1 mm- 8,5 mm- 7,5 mm (diâmetro externo para interno), 2,16 mm (raio de dois furos), 13,9 mm (distância entre dois furos), 0,7 mm (espessura)
barra em forma de UPMCC oficina de máquinaprojeta13,8 mm (comprimento), 1,6 mm (largura), 3,7 mm (altura)
Tampa de Vidro (8 mm)Warner Instruments HBIO 64-0701 CS-8R
Anel de retenção (8 mm)ACKLANDS GRAINGERUNSPSC #
Porcas (aço inoxidável hexagonal)Fastenal70701
Cimento dental3MRelyX U200
Sutura (5-0 Monosof preto)CovioienSN-5698
Porta-agulha HalseyFerramentas de Ciência Fina12501-13
Buprenorfina (Temgesic)Reckitt BenckiserDIN 0281251
Meloxicam (Metacam)Boehringer IngelheimDIN 02240463
Amoxicilina (Clamavox)PfizerDIN 02027879
FITC-DextranSigma-AldrichFD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) eBioscience17-9668
Microscópio de dois fótons LSM 710Carl ZeissZeiss LSM 710 NLO
Estágio de imagemPMCC design personalizado de oficina de máquina15,9 cm (comprimento), 11 cm (largura), 0,9 cm (altura)
Software Imaris BitplaneImaris 8.0Software de análise de imagem descrito na Seção 3 do Protocolo 
Zen 2012ZeissZen 2012Software de aquisição de imagem descrito na Seção 2 do Protocolo 
Pomada para os olhos Ciências14094-11 31163202

Referências

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