Summary
מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.
Abstract
בתרבית של המיוזה היא תהליך התפתחותי דינמי כי מתרחשת בתאי הנבט, ניתן ללמוד מאופיין. באמצעות שיטה כדי להפיץ את הגרעינים על פני השטח של שקופיות (ולא לזרוק אותם מגובה), נדגים שיטת אופטימיזציה על העכבר spermatocytes אשר תוארה לראשונה בשנת 1997. בשיטה זו נעשה שימוש נרחב במעבדות ללמוד בתרבית של המיוזה כי זה מניב שפע של גרעינים איכותיים שעברו substages של prophase אני וכמה בקוריאנית ממוקמים תחילה בתמיסה היפוטוניק להתנפח spermatocytes. ואז spermatocytes משתחררים אל פתרון סוכרוז ליצירת השעיה תא, גרעינים פזורים על גבי מדרון זכוכית ספוג מקבע. בעקבות immunostaining, מגוון של חלבונים שהם נוגעים לתהליכים meiotic יכולים להיבדק. לדוגמה, חלבונים של המתחם synaptonemal, מבנה התלת-צדדי המחבר בין כרומוזום הצירים/הליבות של homologs יחד, ניתן בקלות לאבחן. רקומבינציה meiotic חלבונים, אשר מעורבים תיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית, יכול להיות גם immunostained כדי להעריך את ההתקדמות של prophase אני. כאן אנחנו מתארים ומדגימים בפירוט טכניקה בשימוש נרחב ללמוד בתרבית של מיוזה ב spermatocytes של נער או מבוגר זכר עכברים.
Introduction
עכברים הם בשימוש נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מיוזה ביונקים. ניתן להעריך תהליכים התפתחותיים רגילים והן פגמים להתרחש במהלך המיוזה. ניתן לאפיין את ציר הזמן ואת ההתקדמות של תכונות בולטות להתרחש במהלך prophase ו- substages, כמו גם שפע של חלבונים ספציפיים המעורבים בתהליכים מכריע רגולציה של מיוזה פראי סוג ועכברים מוטנטים. מספר תהליכים מיוחדים המתרחשים במהלך המיוזה שניתן יהיה ללמוד בפירוט (נבדקה הנדל ו Schimenti1). אלה כוללות מערך כפול-strand break (DSB) ה-DNA ותיקון, רקומבינציה, היווצרות קומפלקס synaptonemal, ו כרומוזום סגרגציה.
היבט חשוב של הלומדים תהליכים meiotic הוא היכולת לבחון גרעינים המכילים כרומוזום הומולוגי הנפתרות חזותי, שטיחות טוב יותר להבחין ולזהות את substages של prophase אני Prophase אני מורכבת 5 substages זה מאופיינים בתכונות ספציפיות, כולל הקמת המתחם synaptonemal (SC). SC הוא חלבון ה-tripartite לגרדום המאפשר שיוך ו DNA כפול-strand break לתקן של homologs. במהלך leptonema, homologs ישר כפי צירית יסודות SC ברורים. אז מצורף של אלמנטים מרכזיים למתחם synaptonemal במהלך zygonema מקלה על שיוך ופיזית חיבור (synapsis) בין זוגות של homologs. במהלך pachynema, synapsis של homologs הופך מוחלט, הדי ג'יי ג'יי אברהמס נוצרות מתוך תיקון של אוכלוסיה בחירה של מעברי כפול-גדיל DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. SC פירוק במהלך diplonema, ומאפשר homologs desynapse אבל יישארו מצורפים centromeres שלהם ועל אתרים של הדי ג'יי ג'יי אברהמס. בסופו של דבר במהלך diakinesis, homologs recondense ומתרחשת המעבר מפה של1.
מבחינה היסטורית, השמת השטח של כרומטין meiotic הניב כמה גרעינים, במיוחד אלה של שלבים המוקדמים של prophase אני2. כתוצאה מכך, שונו שיטות אלה כדי לשפר את ההפרדה של תאים ברקמות (קרי testis או שחלה), בטכניקה של כרומטין meiotic מתפשטת, את התשואה של גרעינים meiotic באיכות גבוהה עבור הערכה2,3, 4. בנוסף, שיטה זו הוכיחה להיות שימושי בשימור גרעינית, כרומטין כרוך חלבונים גרעינים meiotic כפי שמגלה immunolocalization שפורסמו טכניקות5,6,7. לכן, השיטה בתחילה מתוארת על ידי פיטרס2 והפגינו כאן תשואות הרבה גרעינים spermatocyte פרץ נפרד המכיל homologs שעברו את substages leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ו diakinesis של prophase אני.
בטכניקה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים (נקרא גם ניתוח התפשטות כרומטין) נעשה שימוש נרחב ללמוד מיוזה בתחומי ביולוגיה הרבייה של התא. שקופיות המכילה השטח-התפשטות הגרעינים ניתן לאחר מכן immunostained עם נוגדנים חלבונים עניין או נתון צביעת כסף, ולאחר מכן נותחו עם מיקרוסקופ. השיטה זו דומה עבור עכברים גם זכר וגם נקבה, למרות השינויים שתוארו עבור עכברים הנשי2. חשוב להימנע overmince וכמה בקוריאנית. הגרעינים חייב גם להיות להתפשט כך בעקבות immunostaining homologs, חלבונים הקשורים נראים בבירור עם מיקרוסקופ. השטח-התפשטות הגרעינים ניתן מוכן תוך שעות ספורות גם immunostained מיד או המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שבועות לפני מפשיר ו- immunostaining. עם זאת, תוצאות אופטימליות מתקבלים בצורה הטובה ביותר עבור חלבונים מסוימים אם immunostaining מתבצע באופן מיידי או בתוך 2 שבועות של הכנת השטח-התפשטות גרעינים. שקופיות יכול להיות immunostained עם פרוטוקול תקני באמצעות נוגדנים חלבונים של עניין, ואחריו הדגירה עם חלבונים מצומדת כדי פלורסנט נוגדנים משניים או צבע, ולאחר מכן עם תמונה עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ8. ב 21-15 יום לאחר הלידה יש רקמות מספיקות לכל זוג של האשכים פראי סוג להניב שקופיות 6-10, עכברים בוגרים (כולל מבוגרים) תניב עוד שקופיות. עם זאת, פראי סוג עכברים 6 שבועות של גיל ומעלה גם תניב התאים יותר פוסט-meiotic (קרי spermatids) בשקופיות בעקבות immunostaining. בנוסף, כל substages של prophase אני יכול להיות שנצפו בעכברים לנוער ומבוגרים. האשכים מן הזכרים כמחנכת ימים 10 15 תניב הרבה יותר תאים leptotene ו- zygotene. עכברים שגילם יום כמחנכת 14 עד 15 תניב יותר גרעינים pachytene ו- diplotene.
כאן אנחנו מתארים ומדגימים שיטה בשימוש נרחב של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות מעורבים עכברים מנוצל אתיות גבוהה וסטנדרטים רווחה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל.
1. הכנה של פתרונות וכלים הדרושים
- להכין היפוטוניק החילוץ מאגר לייצוגית ב 50 מ של מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית, pH 8.2-8.4 (טבלה 1). להפוך את הפתרון טרי כל הזמן, לשמור על הקרח, והשתמש בתוך 2 h הכנת כפולות; הדבר נחוץ למטב את הפחתת ואת פרוטאז עיכוב פעילות של DTT ושל PMSF, בהתאמה. השתמש 10 מ"ל של מצגת עבור כל זוג של העכבר האשכים.
- להכין פתרון סוכרוז 100 מ מ (טריים בכל פעם) על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז 10 מ"ל של הנדסה גנטית מעבדה כיתה מים. להתאים את ה-pH ל 8.2
- להכין פתרון מקבע (1% paraformaldehyde (PFA), 0.15% טריטון X-100, pH להתאים ל- 9.2 עם 1 N HCl או 1 N NaOH) חודשי טריים ומאגר זה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לדלל 16% זמינים מסחרית PFA המוצא מניה עד 4% ב- PBS 1 X לשימוש כמו מניה עבודה ולאחר מכן לאחסן 4% aliquots ב-20 ° C.
- כדי להכין את הפתרון מקבע, להוסיף 10 מ של פתרון PFA 4% ו- 600 µL של 10% טריטון X-100 30 מ של 1 X PBS, מערבבים היטב, ולהתאים את רמת ה-pH ל 9.2 עם 1 N HCl או 1 N NaOH. אחסן את הפתרון מקבע צינור חרוטי 50-mL עטוף בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר (עבור לא יותר מ 4 שבועות).
- להכין פתרונות כביסה (בעוד שקופיות מתייבשים על 30 דקות האחרונות) עם תמונה-פלו 200: 0.4% צילום-פלו 200/PBS (320 µL של צילום-פלו 200 ב- 80 מ של 1 X PBS) ו- 0.4%, פלו צילום 200/dH2O (160 µL של צילום-פלו 200 ב 40 מיליליטר מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית). השתמש צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם 40 מ"ל של פתרונות כדי לשטוף את שקופית 10 או פחות בכל פעם.
- הכנת הכלים הבאים: 1. זוג מספריים כירורגיים (כדי פצעים וחתכים בעור), 1 זוג עצה בסדר מספריים כירורגיים (כדי פצעים וחתכים של הצפק), 2 זוגות של קצה ישר בסדר מלקחיים (לנתח את כל testis), 1 שוליים ישרים גילוח (כדי פצעים וחתכים כל testis), 2 זוגות של מעוקלים עצה מלקחיים (כדי לשתק כל testis) לסחוט בקוריאנית וכמה, צנצנות Coplin 50 מ ל, טפלון מודפס 3 מגלשות טבעת, האיזמל 1 עם להב מידה 11, תא humidified, צלחות פטרי 100 x 15 מ מ, סמן קבוע בסדר עצה או עיפרון, ו- a שאכר מסתובב פלטפורמה.
- המקום פרימיום לא טעונים precleaned שקופיות זכוכית חלבית סוף זקוף בתוך צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם מקבע פתרון עד השימוש.
הערה: עיפרון היא עדיפה אם השקופיות ישמש לאחר מכן בהליכים הדורשים אתנול, כגון קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה.
- המקום פרימיום לא טעונים precleaned שקופיות זכוכית חלבית סוף זקוף בתוך צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם מקבע פתרון עד השימוש.
2. spermatocyte גרעינים מתפשטת
- המתת חסד עכבר זכר בהתאם להנחיות מוסדיים (למשל צוואר הרחם פריקה עם או בלי חנק2 CO).
- שימוש P10 - P20 הזכרים כדי להעריך את התאים meiotic הגל הראשון של יצירת זרע; אנו משתמשים באופן שגרתי P15 - זכרים P17 להשיג תאים של כל substages של prophase ט האשכים למבוגרים תספק תאים מחלון prophase אני יותר מדי, אבל הם גם תניב תאים postmeiotic יותר, כמו spermatids.
- הקציר ולשקול את האשכים (להקליט את המשקולות מזווג); ואז למקם אותם לתוך צלחת פטרי המכילות מספר טיפות של מצגת קר כדי לשמור על לחות.
- להחזיק בזרמה בתחתית קערה עם קצה מעוגל מלקחיים ולהשתמש תער שוליים ישרים לעשות חתך קטן קו האמצע האנכי באמצעות הקפסולה של בזרמה. בעודו מחזיק בזרמה בתחתית קערה עם מלקחיים אחד, השתמש קבוצה שנייה של קצה מעוגל מלקחיים או שוליים ישרים גילוח לסחוט בעדינות את בקוריאנית וכמה מן בזרמה.
- מקם את בקוריאנית לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מצגת קר, מקפיד להימנע לשים את החלקים של הקפסולה לתוך הצינור. חזור על שלבים אלה עם בזרמה השני.
- דגירה בקוריאנית וכמה את decapsulated בצינור חרוט המכילים מצגת על קרח למשך 30-60 דקות, בהתאם לגודל של האשכים. דגירה בקוריאנית וכמה מכל זוג של האשכים במשקל של 30 מ"ג או פחות במשך 30 דקות, בקוריאנית מזוג האשכים במשקל 31-50 מ"ג במשך 30-45 דקות, ועל האשכים גדולים יותר עבור 60 דקות. לא תשנה את זמני עבור מבחן יחיד.
הערה: זמן הדגירה אופטימלית עשוי להשתנות בהתאם החוויה של הנסיין, ריאגנטים המשמש העכברים שעוברים ניתוח. - בעוד בקוריאנית וכמה הם המקננת במצגת, השתמש הסמן או עיפרון לתייג את הקצוות עמומה של שקופיות precleaned עם העכבר מספר, מספר שקופית ותאריך. ואז למקם את השקופיות מראש נקי בתוך צנצנת Coplin המכיל את הפתרון מקבע.
- בעקבות דגירה, שופכים בקוריאנית, מצגת לתוך צלחת פטרי נקי, בקוריאנית נפרד לתוך כ 3 מ מ קוטר גושים. כל סבך מניב 2 מגלשות, מספר השקופיות הניב תלוי בגודל של האשכים.
הערה: אנו משיגים 8 שקופיות של פראי סוג ושקופיות 6 מ- subfertile Chtf18-null P16 האשכים (שהם קטנים יותר עקב ירידה מספרים של תאי נבט meiotic ו mitotic8). Testis מבוגר אחד במשקל של 100 מ ג או יותר יהיה צפוי להניב שקופיות 16. - 23 מקום µL של 100 מ מ פתרון סוכרוז לתוך טבעת אחת ציפוי טפלון מודפס, 3 טבעת שקופיות ולהוסיף אחד קווצת בקוריאנית וכמה הטבעת. ולאחר מכן שימוש מעוקל עצה מלקחיים להחזיק את סבך, מינצ בעדינות את בקוריאנית עם תער 11 גודל עד הפתרון הופך מעוננים.
הערה: לא overmince כמו התוצאה תהיה כרומוזומים מפוצלים. שימו לב כי הכרומוזומים מפוצלים יכול להיות גם מעידה על הפנוטיפ המוטנטי. - הסרת לכלוך, להוסיף עוד 23 µL של סוכרוז פתרון ולהשתמש micropipette כדי בעדינות pipette את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לסייע להפריד את התאים ההשעיה.
- הסר שקופית תטבול את הצנצנת Coplin המכילה מקבע פתרון, להטות את השקופית מעל הצנצנת אז זה droplet נדיב אחד אוסף בפינה התחתונה של השקופית.
- Pipet 20 µL של סוכרוז השעיה תא מטבעת של השקופית המודפסת טבעת 3 טפלון לתוך ה-droplet מקבע על פרמיה מזוגג שקופיות זכוכית, pipet המתלים לאורך 2 - 3 פעמים.
הערה: ה-droplet מקבע צריך להיות גדול מספיק באמצעי אחסון כך תוספת של 20 μL של התליה תא סוכרוז אליו מאפשרת כיסוי על פני השקופית כולה כאשר התערובת היא התפשטה (ראה 2.11 להלן).
- Pipet 20 µL של סוכרוז השעיה תא מטבעת של השקופית המודפסת טבעת 3 טפלון לתוך ה-droplet מקבע על פרמיה מזוגג שקופיות זכוכית, pipet המתלים לאורך 2 - 3 פעמים.
- לאט לאט להטות את השקופית לצד מול ה-droplet כדי להפיץ את התליה תא לאורכו של השקופית. ואז לאט לאט להטות את השקופית בחזרה כדי להפיץ את התליה תא לרוחב השקופית כדי לכסות את זה לחלוטין. הימנע שמתפשטת ההשעיה באותו האזור של השקופית יותר מאשר פעם אחת אחרת שהתאים יחפוף אחד עם השני.
- מיד למקם שקופית שטוח בתוך תא humidified, חזור על השלבים 2.8 ל 2.11 עד כל גושים של בקוריאנית וכמה שימשו כדי להפוך את שקופיות. חשוב לא להעביר תא humidified במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע קורע חופפים תאים.
- לאפשר שהשקופיות דגירה בתוך תא humidified מכוסה בטמפרטורת החדר במשך 2.5 h כך הם יבש לאט, לא לגמרי. לחות גבוהה, ייבוש איטי בשלב זה הם חשובים להבטיח הפצה נאותה של כרומטין. לאחר מכן להסיר את הכיסוי של התא, לאפשר את השקופיות מילה נהדרת לחלוטין מינימום 30 נוספים.
- מקום שקופיות (גב אל גב או בתבנית זיגזג) בתוך צנצנת Coplin המכיל פתרון צילום-פלו 200/1 X PBS 0.4% לשטוף את השקופיות פעמיים, 5 דקות כל אחד, על-ידי בעדינות לזעזע את Coplin ג'אר על פלטפורמה מסתובבת שאכר. להשתמש בפתרון טריים עבור כל כביסה, למנוע שקופיות שונים עכברים בצנצנות נפרדות עבור כל אחד שוטף.
- לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin המכיל 200/dH2O 0.4% צילום-פלו לפתרון 5 דקות פעם תוך כדי לזעזע.
- הסר שקופיות מחלוקה Coplin ג'אר (שטיפה אחרונה), בזהירות לנגב את הקצוות ואת תחתית של השקופיות כדי להסיר עודפי נוזלים, ולמקם שקופיות במיקום זווית, כמעט זקוף יבש. נסיינית אשר בקיא בכל טכניקה זו ניתן לעבד ולהכין השטח-התפשטות גרעינים של 4 או 5 עכברים ביום אחד.
- פעם יבש (15-20 דקות), לעבד שקופיות מיד immunofluorescence מכתים או חנות ב-80 מעלות צלזיוס בתוך קופסת השקופיות סגורים היטב מוגן מפני אור לכל היותר 3 שבועות (בהתאם החלבונים היעד חישובו; תוצאות אופטימליות ניתן להשיג אם מוכתם באותו יום או תוך שבועיים).
- אם מאוחסן ב- 80 ° C, ואז אפשר שקופיות לבוא לטמפרטורת החדר, לשטוף בצנצנת Coplin המכיל 1 X PBS או בלוק במשך 5 דקות לפני צביעת.
הערה: פרוטוקולים רבים מוכתמים immunofluorescence שונים תספק תוצאות טובות; מתייחסים אל ברקוביץ ואח עבור פרוטוקול immunostaining8.
- אם מאוחסן ב- 80 ° C, ואז אפשר שקופיות לבוא לטמפרטורת החדר, לשטוף בצנצנת Coplin המכיל 1 X PBS או בלוק במשך 5 דקות לפני צביעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת של שיטה זו לספק מספר רב של השטח להפיץ גרעינים המכילים homologs שלם תלוי בשלושה גורמים עיקריים: 1) זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה במאגר היפוטוניק (דהיינו האם) כדי להשיג שלמאחה מתנפח spermatocyte הגרעינים פרץ, אך לא מתפוררות מ ממושך דגירה של מצגת, 2) micropipetting טיפות סוכרוז של תאים כדי לקבל השעיה מופרדים של גרעינים זה לא מקובצים יחד ו- 3) הטיית כל מקבע מצופה לשקופיות בכיוון אחד בכל פעם לא אחורה וקדימה. לאחר התפשטות מוכן, משטח גרעינים יכול להיות immunostained עם נוגדנים fluorescently שכותרתו חלבונים עניין, אז עם תמונה עם מיקרוסקופ (נציג דוגמאות מוצגות באיור 1 ו- 2 איור. איור 1 מציג דוגמאות של גרעינים pachytene פראי סוג טוב פרוסים (א), גרעינים המכילים לצר immunostained, קרועים ובלויים homologs המופיעים עקב הדגירה מצגת ארוך מדי (B), לקוי להפיץ חופפים גרעינים (ג), וגרעינים המכילים homologs מפוצלים בשל "overmincing" של וכמה בקוריאנית (D). כאשר הטכניקה מבוצע היטב, שפע של רב-קוטבי המייצג את substages 5 הראשי של prophase אני ניתן להשיג. איור 2 מדגים את שלבי leptotene ', ' zygotene ', ' pachytene ', diplotene, diakinesis prophase. אני בתוך הגרעינים של פראי סוג spermatocytes של גברים ילדותיים.
איור 1: משטח להפיץ את הגרעינים של spermatocytes פראי סוג של עכברים לנוער.
הגרעינים spermatocyte pachytene היו מוכתמים אנטי-SYCP3 (ירוק), אשר כתמי גרעינים אלמנטים מפוח/לרוחב של המתחם synaptonemal (א) להתפשט. (ב) גרעינים מ בקוריאנית וכמה מודגרות ב מצגת יותר מדי זמן. (ג) לקוי להתפשט גרעינים חופפים. (ד) homologs מפוצלים בשל "overmincing" של וכמה בקוריאנית (ראשי חץ לציין שני קטעים homolog קטן). סולם בר הוא 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמאות של גרעינים של substages של prophase אני.
Spermatocytes פראי סוג מן הזכרים ילדותי היו מוכתמים סרום קרסט (אדום), אשר כתמים centromeres, ו- anti-SYCP3 (ירוק), אשר כתמי האלמנטים מפוח/לרוחב של המתחם synaptonemal. שלבי prophase leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ו- diakinesis, בהתאמה, מוצגים. סולם בר הוא 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | כמות | ריכוז סופי |
| מ' 1 טריס-קלרנית (pH 8.2) | 1.5 mL | 30 מ מ |
| סוכרוז | 0.85575 g | 50 מ מ |
| וגופרית והרכבו ציטראט trisodium | 0.25 g | 17 מ"מ |
| 0.5 EDTA מ' | 500 ΜL | 5 מ מ |
| Dithiothreitol (DTT) | 0.00385 g | 0.5 מ מ |
| 0.2 מ' Phenymethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) | 25 ΜL | 0.1 מ מ |
טבלה 1: מתכון החילוץ היפוטוניק מאגר (מצגת).
הוסף ריאגנטים המעבדה הנדסה גנטית 50 מ ל כיתה מים ולהתאים את ה-pH 8.2-8.4 (אם יש צורך להשתמש פתרון N NaOH 1 או 1 N HCl). הכנת מצגת טרי כל הזמן, לשמור על הקרח, ולהשתמש בתוך שעתיים של הכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לקבל מספר גבוה של איכות להפיץ. ובכן, טוב spermatocyte גרעינים, השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה לכלול זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה מצגת, המתאימה הא של וכמה בקוריאנית, והעסיק הטכניקה כדי התפזר התליה תא סוכרוז השקופיות מצופה מקבע. אנחנו דגירה בקוריאנית וכמה מן האשכים של הזכרים פראי סוג החל היום לאחר הלידה 15 לבגרות במצגת למשך 45 דקות, תוך האשכים מ וזהובה בגילאי Chtf18-עכברים null מודגרת למשך 30 דקות בלבד כי האשכים בגודל חצי ומכילים באופן משמעותי פחות בתאי הנבט8. מניסיוננו, דגירה של Chtf18-null האשכים עבור יותר מ 30 דקות פוגעת השלמות של התאים, וכתוצאה מכך homologs לקוי נפתרה. בקוריאנית וכמה הם טחון רק כדי לקבל השעיה תא סוכרוז מעונן, כל שקופית להכיל droplet נדיב של מקבע לפני הפצת (ראה 2.10). שקופיות הם מוטה בכיוון אחד בכל פעם, לא אחורה וקדימה. השיטה היא האידיאלית ללמוד מיוזה הכל מוגבל במידה רבה substages של prophase אני. עם זאת, גרעינים בשלב S premeiotic, מפה של I ו- II יכול להיות שנצפו, היה דיווח7,9.
זוהי שיטה ישירה המחייבת להתאמן כדי להרוויח את היכולות ואת התוצאות הטובות ביותר. תוצאות שיוצרת יכול להתרחש ממספר סיבות שונות. גרעין האטום עשוי לא להיות להתפשט, וכתוצאה מכך באשכולות או חופפים תאים. הדבר יכול להתרחש אם התליה תא סוכרוז לא pipetted כראוי או אין מספיק לשבועיים על השקופית כדי להפיץ את הגרעינים היטב. אם השקופיות מצופות לא מספיק מקבע שיורית או התליה תא אינה על פני השקופית בכיוון אחד חלקה או שוב ושוב להתפשט אחורה וקדימה, התאים חופפים, להתאחד. אם בקוריאנית וכמה הם "overminced" homologs עלולה להיות מקוטעת או מופיעים במידה מסוימת מגורר. מאחר האשכים המוטציות עשוי להיות קטן, מכילים פחות spermatocytes, להיות רגישים יותר "overmincing" או פיצול של וכמה בקוריאנית, מומלץ להתאמן מספר פעמים על האשכים שליטה (למשל סוג הפרוע) קודם כדי למטב את הטכניקה הידיים של טירון.
הכנת משטח התפשטות הגרעינים היא טכניקה הבסיסית המשמשת לבחון צעדים רגולטוריים מפתח והתקדמות של מיוזה, כמו גם לאפיין פנוטיפים meiotic בעכברים. לכן, אנו להשתמש בשיטה זו בהרחבה, ללמד כל חברי מעבדה חדשה כיצד לבצע אותו. ברגע בטכניקה זו הוא שולט, מספר עצום של טכניקות אחרות יכול לשמש לאחר מכן, יחד עם זה. לדוגמה, מספר סוגים של immunostaining ו/או מיקרוסקופ כולל widefield או קונאפוקלית עם epifluorescence, או אלקטרון מיקרוסקופ יכול להתבצע. בנוסף למדתי חלבונים ספציפיים מיוזה כגון רכיבים של synaptonemal קומפלקס, אלה אינטראקציה עם SC, כגון cohesins, multiprotein מתחמי המתווכות לכידות, ניתן להעריך (נבדקה 10,11 12). רגולציה של DNA היווצרות מוצלב, עיבוד, ועם בגרות יכול להיות, גם נחקרו עם טכניקה זו13. . In addition, טכניקה זו בוצעה בעקבות השימוש באמצעים להשגת אוכלוסיות ספציפיות של העכבר spermatocytes: 1) בעקבות התרבות של spermatocytes בחומצה okadaic לזירוז התקדמות על מעבר G2/MI, מניב מספר רב יותר של diplotene, diakinesis, ואת כל אני מתפשט14,15 ו- 2) לאחר שיטות השתמשו כדי לבודד אוכלוסיה מועשר pachytene spermatocytes14.
בטכניקה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes תיאר והפגינו שהנה טכניקה פשוטה ושימושי מאוד. . זה תמציתי כל במעבדה לחקר מיוזה שימוש בעכברים כאורגניזם מודל, אך דורשת מעט תרגול והתמדה עדינות כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר את הסיוע הטכני של אביגיל האריס. הם גם מכירים כהן פאולה, קים הולוויי שעזרת כדי למטב את הפרוטוקול של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes. המחברים גם מעריך קריאה ביקורתית של כתב היד על-ידי קארן שינדלר.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM106262 כדי K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
