Summary
تركيبات المخدرات التآزري صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً لتحديد تجريبيا. هنا، نحن تصف أسلوب لتحديد والتحقق من صحة التآزري الجزيئات الصغيرة.
Abstract
على الرغم من أن العقاقير المضادة للميكروبات أدى إلى زيادة العمر ونوعية الحياة في القرنال 20، ومقاومة مضادات الميكروبات يهدد مجتمعنا كامل القدرة على علاج العدوى الجهازية. في الولايات المتحدة وحدها، العدوى المقاومة للمضادات الحيوية تقتل ما يقرب من 23 ألف شخص في السنة وتكلفة حوالي 20 بیلیون دولاراً في الرعاية الصحية الإضافية. نهج واحد لمكافحة مقاومة مضادات الميكروبات هو الجمع بين العلاج، ومفيدة بشكل خاص في هذه المرحلة المبكرة الحاسمة من العدوى، قبل إصابة الكائن الحي وصورتها مقاومة المخدرات التي جرى تحديدها. العديد من العلاجات المضادة للميكروبات استخدام العلاجات المركبة. ومع ذلك، معظم هذه التشكيلات قابلة للإضافة، بمعنى أن كفاءة مجتمعة هو نفسه كمجموع لفعالية المضادات الحيوية الفردية. بعض العلاجات المركبة التآزر: كفاءة مجتمعة أكبر بكثير من المواد المضافة. مجموعات تعاونية مفيدة بشكل خاص نظراً لأنها يمكن أن تعوق نمو سلالات مقاومة للعقاقير المضادة للميكروبات. ومع ذلك، هذه التركيبات نادرة ويصعب تحديد. وهذا سبب العدد الضخم من الجزيئات اللازمة لفحصها بطريقة عشوائية: وقد مكتبة 1,000 الجزيئات التوليفات المحتملة 1 مليون. وهكذا، بذلت جهود للتنبؤ بالجزيئات للتآزر. توضح هذه المقالة طريقة الفائق للتنبؤ بأزواج جزيء صغير التآزري المعروفة بتداخل2 الأسلوب (O2M). O2M يستخدم أنماط من مجموعات البيانات الجينية الكيميائية لتحديد طفرات التي شديدة الحساسية لكل جزيء في زوج تآزري ولكن ليس للجزيئات الأخرى. مختبر براون يستغل هذا الاختلاف النمو قبل أداء شاشة الفائق للجزيئات التي تحول دون نمو المسخ ولكن الخلايا لا البرية من نوع. جزيئات العمل سبق تحديدها في المختبر التآزر مع ميثوبريم المضادات الحيوية والفلوكونازول العقاقير المضادة للفطور باستخدام هذه الاستراتيجية. وهنا الكتاب الحالي طريقة إلى الشاشة لتركيبات التآزري الرواية، الذي يمكن تغييره للعديد من الكائنات الحية الدقيقة.
Introduction
البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية تسبب التهابات أكثر من 2 مليون و 23,000 حالة وفاة سنوياً في الولايات المتحدة وفقا لمركز السيطرة على الأمراض1. وتلزم علاجات جديدة للتغلب على هذه الالتهابات. وتشمل استراتيجيات لتحديد هذه العلاجات الجديدة تطوير أدوية جديدة مضادة للميكروبات أو repurposing الجزيئات الصغيرة التي وافقت على الشروط الأخرى لعلاج العدوى الميكروبية2،،من34. ومع ذلك، يتم اكتشاف الأدوية الجديدة باهظة التكاليف وتستغرق وقتاً طويلاً. Repurposing المخدرات قد لا تحدد الرواية العقاقير أو المخدرات يستهدف5،6. لدينا مختبر يركز على استراتيجية ثالثة المعروفة بالعلاجات المركبة تآزرية. تركيبات التآزري تحدث عندما يكون اثنين من الجزيئات الصغيرة معا فعالية أكبر من تأثير المضافة على حدة بلغت7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون تركيبات التآزر فعالة ضد مقاومة الممرض إلى واحدة من الجزيئات الصغيرة في زوج بالإضافة إلى وجود أقل آثار خارج الهدف غير مرغوب فيها، مما يجعلها كبيرة محتملة8،9، 10.
أزواج التآزري نادرة، تحدث في 4-10% تقريبا من المخدرات تركيبات11،،من1213. وهكذا، التقنيات التقليدية مثل شاشات العشوائية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً، مع آلاف تركيبات المحتملة من مكتبة صغيرة من الجزيئات مائة. وعلاوة على ذلك، تفاعلات تآزرية عادة لا يمكن التنبؤ من نشاط مركبات14. غير أن المؤلفين وضع نهج الفائق إلى الشاشة لأزواج تآزرية، يسمى التداخل2 الأسلوب (O2M)12. يسمح هذا الأسلوب, الموضحة هنا، لتحديد الهوية أسرع وأكثر كفاءة من هذه الأزواج المتآزر. O2M يتطلب استخدام زوج تآزري معروفة ومجموعة بيانات الكيميائية-علم الوراثة. يتم إنشاء مجموعات البيانات الكيميائية-علم الوراثة عند مكتبة طفرات خروج المغلوب يزرع حضور العديد من الجزيئات الصغيرة المختلفة. إذا كان جزيء واحد في زوج تآزري معروفة الحث نفس النمط الظاهري من متحولة خروج المغلوب خاصة كجزيء التآزري الثانية، أي جزيء الصغيرة الأخرى الذي يتسبب النمط الظاهري من هذا المسخ نفسه ينبغي أيضا التآزر مع كل الأعضاء المعروفة زوج تآزرية. وقد استخدمت هذا الأساس المنطقي في مختبر براون تحديد أزواج المضادات الحيوية تآزري فعال ضد الإشريكيّة القولونية () وأزواج العقاقير المضادة للفطور تآزري فعال ضد الفطريات المسببة للمرض بين المرسلة (جيم المرسلة)11،12. O2M ليست قابلة للتكيف لمسببات الأمراض المختلفة فحسب، ولكن يسمح لفحص مكتبات كبيرة من الجزيئات لتحديد أزواج التآزر بسهولة وسرعة. الفرز مع المسخ الوراثية التي حددتها O2M يسمح لنا بالتحقق من صحة تلك الجزيئات الصغيرة وتوقع للتآزر. وهكذا، اختبار مكتبة جزيء 2,000 بيرويس سيستغرق شهرا، بينما إذا كان هناك فقط 20 الجزيئات في تلك المكتبة وتوقع للتآزر، اختبار للتآزر الآن يستغرق بضعة أيام. O2M لا تتطلب مهارات البرمجة، والمعدات المطلوبة متوفرة في معظم مختبرات أو المرافق الأساسية. بالإضافة إلى الباحثين المهتمين في تركيبات العقاقير، تحليل O2M لمصلحة أي شخص الذين قد أكملت شاشة المخدرات ويريد توسيع يضرب بهم عن طريق تحديد التفاعلات الهامة للمخدرات-المخدرات. أدناه هو بروتوكول لتحديد الجزيئات الصغيرة تآزرية في البكتيريا، فضلا عن التحقق من صحة التفاعلات التآزر المتوقعة في فحوصات معروفة15،16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحديد التآزر التنبؤ بطفرات من Dataset الكيميائية-علم الوراثة بواسطة الأسلوب2 التداخل (O2M)
ملاحظة: هذا هو الأسلوب لتحديد التآزر طفرات التنبؤ باستخدام مجموعة البيانات المنشورة من نيكولز وآخرون. 17 في كولاي. ومع ذلك، يمكن أن يتم ذلك في أي مجموعة البيانات الكيميائية-علم الوراثة والكائنات الدقيقة. هذه المجموعات من البيانات تحتوي على مكتبة طفرات خروج المغلوب ازداد حضور أكثر من 100 من الجزيئات الصغيرة، إعطاء درجة نمو كمي لكل متحولة في كل جزيء صغير. يجب أن تعرف زوج التآزري واحد، وينبغي أن يكون هناك عشرات النمو لكل الجزيئات الصغيرة المدرجة في مجموعة البيانات.
-
حساب نقاط النمو المتوسط والانحراف المعياري لجميع طفرات ازداد حضور تركيز واحد لكل جزيء صغير.
ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك باستخدام أي برنامج جدول بيانات. مختبر براون يستخدم Excel والوظائف =AVERAGE(B3:B3981) و =STDEV(B3:B3981) لحسابات كل عمود من جزيء صغير.- حساب الوسائل والانحرافات المعيارية من كل عمود من الجزيئات الصغيرة، على الرغم من أن هذا الاتجاه قد تختلف في حالة استخدام إحدى وحدات dataset مختلفة.
- حساب الدرجات Z لكل تركيز الجزيئات الصغيرة باستخدام نفس مجموعة البيانات من نيكولز وآخرون. 17 في برنامج جدول بيانات. لهذا، سيكون إحراز z السلبية Z(2.5) = يعني-2.5 * الانحراف المعياري، وإحراز z الإيجابية ستكون Z(2.5) = يعني + 2.5 * الانحراف المعياري.
- تحديد الجينات التي تحتوي على طفرات كبيرة إحراز Z في الجزيئات الصغيرة التي تقوم بإنشاء زوج التآزري المعروفة، يجري التأكد من أن ننظر في تركيزات جميع تلك الجزيئات. إذا كان النمو درجة متحولة أقل من Z السلبية (2.5) نقاط أو أكبر من نقاط Z (2.5) الإيجابية لتلك الجزيئات الصغيرة، يعتبر كبيرا.
- تحديد إذا كان أي من طفرات الجينات كبيرة تنتمي إلى مشغل.
ملاحظة: يوصي المؤلفون كولاي، التحقق من "ويكي Ecoli" للحصول على معلومات بشأن إذا كان يتم نسخها الجينات كجزء من بوليسيسترونيك الجيش الملكي النيبالي. - تحديد طفرات الجينات/مشغل الشائعة لمعظم الجزيئات الصغيرة ذات الاهتمام بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال-، وعندما تبحث عن تحديد الجزيئات التي التآزر مع المضادات الحيوية ميثوبريم، المسوخ التي تظهر Z كبيرة نقاط عندما ازداد حضور ميثوبريم وشركائها التآزري المعروفة مثل سولفاميثيزولي أو سلفاميثوكسازول). هذه طفرات التنبؤ التآزر المفترضة.
2-التنبؤ سينيرجيزيرس داخل Dataset الكيميائية-علم الوراثة قبل O2M
- وبالعودة إلى dataset17، تحديد تركيز كل من جزيء الصغيرة التي يتسبب درجة نمو كبير من المسخ التنبؤ التآزر. ويتم ذلك من خلال النظر في عشرات Z المحسوبة لكل تركيز الجزيئات الصغيرة. مرة أخرى، على درجة كبيرة من نمو أقل من درجة Z السلبية أو أكبر من نقاط ض إيجابية لأن تركيز الجزيئات الصغيرة.
ملاحظة: إذا يظهر جزيء واحد حتى في التركيزات، يعتبر الجزيء سينيرجيزير المتوقعة. أي جزيء التي لا تحظى بدرجة كبيرة من نمو سينيرجيزير غير المتوقعة.
3-التحقق تفاعلات التآزر المتوقعة
- العثور على أدنى تركيز المثبطة (MIC) سينيرجيزيرس المتوقعة.
- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها كولاي في الإعلام M9 الحد الأدنى عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن زراعتها أي ثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة محددة بشكل مناسب للكائن الحي للفائدة. لا يوصي بمختبر براون وسائط غنية مثل رطل أو YPD. M9 أدنى وسائل الإعلام يتكون من 10.5 جرام/لتر مرق M9، الأحماض كاسامينو 0.2%، 0.1 م كاكل2، الجلوكوز 0.4 في المائة، م 1 مجسو4، حمض النيكوتينيك 0.25% والثيامين 0.33% H2o. - إذا لا توجد بيانات هيئة التصنيع العسكري ليتم العثور على ممرض فائدة في الأدب عند استلام الجزيئات الصغيرة، تذوب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) بتركيز عالية (> 10 ملغ/مل).
- باستخدام لوحة 96، حسنا، إضافة 100 ميليلتر من M9 وسائل الإعلام لكل بئر. إضافة ميليلتر 100 إضافية وسائط M9 في العمود 1 حيث يحتوي على ما مجموعة 200 ميليلتر.
- إضافة مبلغ تعسفي (~ 10 ميليلتر) حل جزيء صغيرة تتركز في العمود 1. جزيء صغير واحد كل بئر عمود 1 (8 جزيئات صغيرة للوحة الواحدة).
ملاحظة: هذه هي الجزيئات الصغيرة ذات الاهتمام، والتي من المتوقع للتآزر. ويضيف مختبر براون عموما 10 ميليلتر من حل جزيء صغيرة مركزة للغاية، وما يقل مقدار 100% [دمس] التي يمكن أن تمنع كولاي. - حالما تتم إضافة جزيئات صغيرة، يؤدي إلى تمييع الجزيئات الصغيرة عبر المحور س اللوحة. تأخذ 100 ميليلتر من حل من العمود 1، ضع في العمود 2 ومزيج. تأخذ 100 ميليلتر من العمود 2، ضع في العمود 3 ومزيج. تستمر هذه العملية حتى يتم وضع 100 ميليلتر في العمود 11. مزيج العمود 11، ثم تأخذ 100 ميليلتر من هذا العمود وتجاهل. اترك العمود 12 مع وسائل الإعلام فقط لتطبيع البيانات.
- تطعيم اللوحة. الحصول على الكثافة البصرية (OD600) من ثقافة بين عشية وضحاها. تعد حلاً للثقافة والإعلام M9 ل التطوير التنظيمي600 من 0.002 (أو المناسبة تركيز يمثل 500 خلايا/ميليلتر للكائن المطلوب من الاهتمام). "الماصة؛" 2 ميليلتر من حل الثقافة في كل من اللوحة جيدا حتى تكون هناك خلايا 1,000 كل بئر.
- بلطف يهز اللوحة والحصول على OD600 ح 0 القراءة. تسمح لوحة تنمو في 37 درجة مئوية ل 24 h. الحصول على OD600 ح 24 قراءة.
ملاحظة: استخدام المناسبة ينمو شروط للكائنات الحية الأخرى ذات الاهتمام. - حساب النمو الصافي لكل جيدا باستخدام برنامج جدول بيانات.
- متوسط صافي نمو العمود 12 للحصول على المتوسط أي نمو للمخدرات. تطبيع الآبار الأخرى إلى متوسط النمو المخدرات لا استخدام برامج جداول بيانات. ابحث عن أي بئر بأقل من 10% النمو للتعرف MIC90. أي يدل النمو جيدا مع أقل من 50% في MIC50. حساب تركيز الجزيئات الصغيرة في تلك الآبار.
- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها كولاي في الإعلام M9 الحد الأدنى عند 37 درجة مئوية.
- لوح شطرنج فحوصات للتفاعلات التآزري
- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها كولاي في الإعلام M9 الحد الأدنى قبل.
ملاحظة: استخدام المناسبة ينمو شروط للكائنات الحية الأخرى. - إضافة 100 ميليلتر من M9 وسائل الإعلام لكل بئر من صفيحة جيدا 96 وميليلتر 100 إضافية في العمود 1.
- إضافة جزيء صغير الاختبار (~ 8 × هيئة التصنيع العسكري) إلى كل الخير في العمود 1 وإضافة ضعف التركيز (~ 16 × هيئة التصنيع العسكري) إلى A1 جيدا (اختبار جزيء صغير واحد للوحة الواحدة).
ملاحظة: هذا المبلغ يتحدد من قبل اختبار أنجزت هيئة التصنيع العسكري، ويختلف بالنسبة لكل سينيرجيزير المحتملة. - إنشاء إضعاف تدرج على المحور السيني بأخذ 100 ميليلتر من العمود 1 ونقل إلى العمود 2. متابعة هذه العملية حتى يتم إضافة 100 ميليلتر للعمود 11. مزيج، ثم تأخذ 100 ميليلتر من العمود 11 والتصرف فيها. لا تقم بإضافة أي دواء للعمود 12 (الشكل 1A).
- إعداد التدرج المخدرات الثانية عبر المحور الصادي للمخدرات الإدخال. إضافة 100 ميليلتر من الوسائط التي تحتوي على 2 × هيئة التصنيع العسكري جزيء الإدخال في الصف مزيج أ وتمييع قبل، مع أخذ ميليلتر 100 من الصف A ووضع في متابعة باء حتى يتم وضع 100 ميليلتر في صف المزيج زاي، تأخذ 100 ميليلتر والتصرف فيها، ضمان عدم إضافة أي دواء الإدخال في الصف ه. يسمح هذا الصف ح والعمود 12 تحتوي على فرادى البلدان المتوسطة الدخل من زوج المخدرات اختبار (الشكل 1B).
- تطعيم اللوحة. إضافة 2 ميليلتر لثقافة كولاي OD600 0.002 لكل بئر (الخلايا 1,000 كل بئر).
- قياس القطر الخارجي600 من كل بئر في لوحة للقراءة 0 ح.
- احتضان اللوحة عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- قياس القطر الخارجي600 من كل بئر في 24 ساعة.
- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها كولاي في الإعلام M9 الحد الأدنى قبل.
- حساب مؤشر التركيز المثبطة كسرية (فيسي) من مهاد
- حساب النمو الصافي لكل بئر من اللوحة عن طريق طرح OD600 في ح 0 من OD600 في 24 ساعة في برنامج جدول بيانات.
- تطبيع النمو في البرنامج بتقسيم كل H12 ببئر، الذي يحتوي على لا جزيء صغير.
- العثور على MIC90 جزيء الإدخال في العمود 12 و MIC90 من مؤازر المحتملة في صف ه.
- ابحث عن جميع الآبار التي تمنع 90 في المائة نمو.
- حساب FICI90 للبئر التي هي أما أدنى أدناه (التآزر) أو أعلى أعلاه (معادية) كل قيم MIC90، باستخدام المعادلة:
- تنظر أي فيسي ≤ 0.5 التآزر وفيسي ≥ 4 كمعادية (الشكل 2).
ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم ذلك مع MIC50 (تثبيط نمو 50 ٪) للحصول FICI50 على أساس تلك القيم هيئة التصنيع العسكري.
- والرزن الاستقلال بليس
ملاحظة: يتم تشغيل بليس الاستقلال مع أي مؤازر المحتملة التي لم تكن هيئة التصنيع العسكري بمفردها.- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها كولاي في وسائل الإعلام M9 في 37 درجة مئوية، كما كان من قبل.
ملاحظة: مرة أخرى، ظروف النمو المناسبة للكائنات الحية الأخرى التي تهم يمكن استخدام في هذه الخطوة. - إعداد لوحات 96-جيدا لاختبار الجزيء التآزر المحتملة وجزيء الإدخال والتركيبة وعنصر تحكم غير المعالجة.
- إنشاء لوحة مؤازر المحتملة عن طريق إضافة 50 ميليلتر من M9 وسائل الإعلام لكل بئر. إضافة 50 ميليلتر من الوسائط التي تحتوي على تركيز مجموعة (10 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) من مؤازر المحتمل لكل بئر من صف. اختبار الجزيئات 8 للوحة الواحدة.
- إنشاء لوحة جزيء الإدخال عن طريق إضافة 50 ميليلتر لوسائل الإعلام لكل بئر. إضافة 50 ميليلتر تحتوي على 4 x هيئة التصنيع العسكري المخدرات الإدخال لكل بئر في العمود 1. إنشاء إضعاف تدرج على طول المحور السيني مماثلة إلى لوحات هيئة التصنيع العسكري، وأخذ 50 ميليلتر من العمود 1 وتشتيت وخلط في العمود 2. تستمر هذه العملية حتى العمود 12، التخلص منها 50 ميليلتر من العمود 12. إضافة ميليلتر 50 إضافية لوسائط الإعلام لكل بئر حتى يكون المجموع نهاية لكل بئر 100 ميليلتر.
- إنشاء لوحة تركيبة باستخدام لوحة جيدا 96، إضافة 50 ميليلتر لوسائل الإعلام لكل بئر. إضافة 50 ميليلتر تحتوي على 4 x هيئة التصنيع العسكري المخدرات الإدخال لكل بئر في العمود 1. يضعف على طول المحور السيني مماثلة إلى لوحات هيئة التصنيع العسكري، وأخذ 50 ميليلتر من العمود 1 وتشتيت وخلط في العمود 2. مواصلة هذا الطريق كله إلى عمود 12، التخلص منها 50 ميليلتر من العمود 12. إضافة 50 ميليلتر من الوسائط التي تحتوي على مؤازر المحتملة في 10 ميكرومتر أو 100 ميكرون لكل بئر من صف. مرة أخرى، ينبغي أن يكون هناك تركيز أو المخدرات في الصف الواحد.
- إنشاء عنصر تحكم غير المعالجة عن طريق إضافة 100 ميليلتر من M9 وسائط الإعلام لجميع الآبار اللوحة.
- تطعيم جميع لوحات بإضافة 2 ميليلتر لثقافة البكتيرية مع OD600 0.002 أو خلايا 1,000 لكل بئر قبل.
- قياس القطر الخارجي600 من كل بئر على 0 و 24 ساعة.
- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها كولاي في وسائل الإعلام M9 في 37 درجة مئوية، كما كان من قبل.
- حساب درجة الاستقلال بليس
- حساب النمو الصافي لكل بئر من اللوحة عن طريق طرح OD600 في ح 0 من النمو في 24 ساعة باستخدام برنامج جدول بيانات.
- تطبيع الآبار إلى أن متوسط النمو من لوحة المخدرات لا في برنامج جدول بيانات.
- باستخدام برنامج جداول البيانات، حساب التثبيط بطرح نمو صاف من 1.
- متوسط الأعمدة الموجودة في لوحة التحكم التي تحتوي على فقط التدرج الإدخال في برنامج جدول بيانات.
- حساب نقاط بليس لكل بئر بالمعادلة:
نقاط بليس = (X جيدا + الإدخال العمود X) – جنبا إلى جنب X جيدا - ابحث عن عشرات السلبية في الآبار تحت MIC90 المدخلات.
ملاحظة: النقاط السلبية عبر تجمعات متعددة تشير إلى وجود تفاعل تآزري.
4-الفائق الشاشة مع طفرات التنبؤ بالتآزر لتحديد أزواج التآزري رواية
-
تحديد طفرات التنبؤ التآزر
ملاحظة: حدد الخطوة 1.5 طفرات التنبؤ التآزر المفترضة. هنا، علينا أن نحدد أي من هذه المسوخ سوف تعمل أفضل في شاشة الفائق للمخدرات تآزرية. ونحن إجراء هذا التحليل في جهاز Bioscreen، ولكن 96 لوحة جيدا القراء ينبغي أن يكون مقبولاً أيضا.- تنمو كل طفرات التنبؤ التآزر المفترضة والبرية من نوع الخلايا في M9 أدنى وسائل الإعلام.
- كذلك العسل مجموعة تصل 100 لوحة (أو لوحة جيدا 96) مع المتوسطة النمو المناسبة، المتوسطة النمو + إدخال المخدرات، والمتوسطة النمو + شريك التآزري المعروفة لإدخال المخدرات، والمتوسطة النمو + المخدرات غير تآزرية المعروفة. تأكد من تضمين عناصر التحكم المركبة.
ملاحظة: نوصي بتكرار أربعة آبار لكل سلالة/المخدرات/التركيز. - تلقيح خلايا 1,000 الواحد جيدا، بما في ذلك الآبار عنصر التحكم فارغاً.
- تنمو 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع الهز، وقراءة OD600 كل 20 دقيقة.
- تحديد نقطة تركيز ووقت المخدرات الذي يظهر الفرق نمو أكبر بين البرية من نوع والتآزر خلايا متحولة التنبؤ بحضور المخدرات الإدخال وشركائها التآزري المعروفة. نقطة الوقت الأمثل وتركيز، لا ينبغي نمو الكثير من الفرق بين البرية من نوع والتآزر التنبؤ متحولة الخلايا عندما ازداد حضور المخدرات المعروفة عدم التصرف تآزر مع المخدرات الإدخال (الشكل 3).
-
الشاشة الفائق للمخدرات التآزري
- تنمو البرية من نوع الخلايا والتآزر التنبؤ خلايا متحولة في M9 أدنى وسائل الإعلام.
ملاحظة: استخدم متوسط النمو المناسبة للكائن الحي للفائدة. - إضافة الأدوية من المكتبة لوسائل الإعلام كل ذلك التي تحتوي على 100 ميليلتر الوسائط مع جزيئات صغيرة في تعيين التركيز الذي تم تحديده في الخطوة السابقة. وتشمل الآبار فارغة (بدون الخلايا) والآبار مع عناصر التحكم المركبة (ه.g.، [دمس]) لحساب أي إعاقة النمو بالسيارة تمييع المخدرات.
- إعداد مالا يقل عن أربعة آبار مراقبة مركبة كل لوح، مثالي المتناثرة عبر لوحة لمراعاة الآثار الموقف جيدا. إذا كانت فحوصات متغير، ثم تشمل مراقبة مركبة واحدة على الأقل كذلك كل صف/عمود واستخدام كل صف/عمود عنصر تحكم فضلا عن عنصر التحكم لحساب الدرجات Z لكل صف/عمود بدلاً من لوحة أكمله (الخطوة 4.2.5).
- إضافة 2 ميليلتر للثقافة إلى كل فضلا عن قبل. (لوح واحد للبكتيريا نوع البرية ولوحة واحدة للبكتيريا متحولة التآزر المتوقعة).
- تقييم OD600 في 0 وح 18 كولاي أو 48 ساعة جيم-المرسلة.
- باستخدام برنامج جداول البيانات، حساب النمو الصافي بطرح OD600 فارغة بئرا من آبار مراقبة المركبات. تحديد الآبار Z-النقاط-2.5 (نقاط Z = يعني-2.5 * الانحراف المعياري). هذه الآبار تحتوي على جزيء صغير مؤازر محتملة.
- التحقق من صحة يضرب الشاشة باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوة 3.
- تنمو البرية من نوع الخلايا والتآزر التنبؤ خلايا متحولة في M9 أدنى وسائل الإعلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فحوصات رقعة الداما طريقة شبه كمي لقياس التفاعلات تآزرية. يحدد فيسي، والنتيجة النهائية الإخراج، إذا كان الجمع بين المخدرات يعتبر التآزري (فيسي ≤0.5)، غير-التفاعل (0.5 < فيسي < 4)، أو معادية (فيسي ≥4.0). ويبين الشكل 1 كيفية إعداد التدرجات المخدرات في مقايسة رقعة الداما. ويبين الشكل 2 النتائج المشتركة. النظر في النمو (الآبار الأرجواني) الذي عرض أقل من تثبيط نمو بنسبة 90%. بعد قياس OD600 من كل بئر في صفيحة، نحن تطبيع كل شيء لمكافحة المخدرات ليس جيدا. أي شيء مع قيمة مسواة > 0.1 (10% OD600 عنصر التحكم جيدا) وهو سجل "النمو". يمكن أن تختلف درجات فيسي اعتماداً على التي يتم انتقاء جيدا؛ علينا تحديد البئر الذي يعطي فيسي أدنى لكل لوحة. في الشكل 2 ألف، الذي سيكون جيدا F9 (أعمدة مرقمة، الصفوف اﻹكبار)، مع فيسي = 0.07. في الشكل 2، يحسب فيسي من C3 جيدا (فيسي = 1.0). للتفاعلات معادية، ابحث عن فيسي أعلى درجة ممكنة. في الشكل 2، يحسب فيسي من A1 جيدا، التي تعطي فيسي 8.0.
شروط الفحص الأمثل إلى منع عدد كبير من إيجابيات كاذبة من الشاشة، مما يوفر الوقت والمال. عندما نحن الأمثل طفرات التنبؤ بالتآزر للفطريات بين المرسلة، ونحن اختبار المخدرات الإدخال (الفلوكونازول) وأربعة المخدرات غير تآزرية المعروفة (الكافيين، كليمبازولي، ميثوبريم، وبريفالدين A)، وخمسة من الفلوكونازول الشركاء التآزري (ريفاميسين، ميريوسين، نيجيريسين، ربمسن، و FK506، كل ما نوقش في كريموو، س. et al. 18). حيث اكتشفنا هذه الجزيئات من خلال تحليل O2M (المادتان 1 و 2)، وكنا نتوقع سينيرجيزيرس المعروفة تمنع نمو الخلايا متحولة التنبؤ التآزر ولكن لا البرية من نوع الخلايا بشكل انتقائي. لتحقيق أقصى قدر من النمو المتوقع الفرق، قمنا باختبار مجموعة من تركيزات لكل جزيء صغيرة، معظمها من سوبينهيبيتوري.
وتظهر نتائج المثال في الشكل 3. جزيء لا يتصرف تآزر مع الفلوكونازول، بريفالدين أ، وتحول دون البرية من نوع والتآزر التنبؤ متحولة النمو إلا بشكل طفيف، وتقريبا بنفس المبلغ. كانت تحول دون ريفاميسين (الشكل 3B)، نمو المسخ التنبؤ التآزر (cnag_03917Δ)، ولكن نمو الخلايا البرية من نوع لم يكن. وكان الفرق أكبر نمو بين 32 و 49 ح بعد انتهاء التلقيح، حيث كان تيميبوينت للفحص في هذا النطاق. منحنيات النمو للجزيئات الأخرى غير تآزرية والتآزر تشبه تلك ريفاميسين وبريفالدين، على التوالي.
الشكل 1 : تصوير "المقايسة الشطرنج" من الخطوة 3- اختبار المخدرات وإدخال المخدرات التدرجات موضحة في A و B، على التوالي. يجب أن تظهر لوحة الفحص النهائي كما هو الحال في جيم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : رسوم بيانية نتائج "فحص رقعة الداما". الرسوم التوضيحية للتآزر، لا شيء، ويصور التفاعلات معادية في ألف، وباء وجيم، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : نموذج البيانات لتحديد وقت الفحص. (أ) البرية من نوع (الأخضر) والتآزر التنبؤ المسخ (أزرق) المرسلة جيم- ازداد حضور بريفالدين أ، جزيء صغيرة المعروفة عدم التآزر مع الفلوكونازول. البرية من نوع عنصر التحكم (أخضر داكن) وتعامل بالمخدرات (الضوء الأخضر) وقد فرق مماثلة في نمو التآزر التنبؤ متحولة التحكم (أزرق داكن) والمخدرات تعامل (أزرق فاتح). (ب) نوع البرية والتآزر التنبؤ المسخ ازداد حضور ريفاميسين، جزيء صغيرة المعروفة التآزر مع الفلوكونازول. البرية من نوع عنصر التحكم (أخضر داكن) وتعامل بالمخدرات (الضوء الأخضر) وقد فارق نمو أصغر من التآزر التنبؤ متحولة التحكم (أزرق داكن) والعقاقير المعالجة (أزرق فاتح). ويلاحظ الفرق أكبر في 48 ساعة للجزيء التآزري المعروفة والفرق مشابهة في هذه النقطة الزمنية للجزيء غير تآزرية المعروفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أزواج جزيء صغير التآزر يمكن أن تكون أداة قوية في علاج العدوى الميكروبية، إلا أنهم لم يبلغوا إمكاناتهم الكاملة السريرية نظراً لأزواج التآزري تحديا لتحديد. وتصف هذه الورقة أسلوباً لتحديد أزواج التآزري أسرع بكثير من تركيبات عشوائية بسيطة. باستخدام مجموعات البيانات الكيميائية-علم الوراثة، يحدد O2M طفرات بالضربة القاضية الجينات التي يمكن استخدامها كقراءات للمكتبات الشاشة الكبيرة من الجزيئات الصغيرة بغية التنبؤ بأزواج التآزري. القدرة على التنبؤ بالجزيئات الصغيرة يسمح بقابلية عالية للشاشات، والذي بدوره يجعل لتحديد الشركاء التآزري والازيغ. بعد تحديد أزواج تآزرية، أحد توضيح التفاعلات التآزري الأساسية الآلية الجزيئية، ثم المعقول تصميم إضافية أزواج التآزري11.
O2M يتطلب مجموعة بيانات جينية كيميائية وزوج تآزري معروفة. لحسن الحظ، مجموعات البيانات الكيميائية-علم الوراثة المشترك لمجموعة متنوعة من الميكروبات19،،من2021. سابقا أثبت المختبر براون أن O2M يمكن بنجاح البحث عن أزواج تآزرية في11، C. المرسلة و كولاي12. وهذا يدل على أن له أثر واسع O2M كأسلوب لتحجيم التي تنطبق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية. ويمكن تغيير كافة الخطوات المذكورة هنا للنمو للكائنات الدقيقة المختلفة مع نتائج مماثلة نسبيا، مما يجعل O2M أداة قيمة للتعريف العام لأزواج تآزرية. عدة مجموعات أخرى هي تحديد التآزري مزيج من مجموعات البيانات الكيميائية-علم الوراثة بطرق تحليلية مختلفة، على الرغم من أن O2M يتطلب المعرفة البرمجة أقل من أي من هذه الأساليب. ويحدد كل أسلوب مجموعات مختلفة من التآزري المضادات الحيوية أو انتيفونغلس 18،،من2223،24، مما يشير إلى بقاء عدد كبير من أزواج التآزري اكتشافها. O2M وغيرها من أساليب التنبؤ بالتآزر أيضا التي يمكن تطبيقها لنظم الثدييات، بما في ذلك تحديد تركيبات المخدرات مرض السرطان.
وخلاصة القول، يصف هذا الأسلوب طريقة سريعة للشاشة لأزواج التآزر من مجموعة بيانات الكيميائية-علم الوراثة. هذا الأسلوب والبعض الآخر مساعدة أزواج التآزري تصبح خياراً أكثر جدوى علاج في العيادات. بالإضافة إلى ذلك، طريقة سريعة والمعمم O2M ليثبت ذلك أداة قيمة عند البحث عن أزواج جزيء صغير تآزرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل بمنحه بدء تشغيل من إدارة علم الأمراض، جامعة ولاية يوتا إلى J.C.S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al.
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
