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Artigo de método

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

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DOI:

10.3791/57349

⸱

29 de junho de 2018

 ,  , 
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Resumo

Dados abrangentes sobre relacionamentos de oscilações de rede neural para comportamento e organização de descarga neuronal em todas as regiões do cérebro chamam para novas ferramentas para manipular seletivamente ritmos cerebrais. Aqui nós descrevemos uma abordagem combina optogenetics de projeção específico com eletrofisiologia extracelular para controle de alta-fidelidade de oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A especificidade do arrastamento a optogenetic é conseguida pela segmentação channelrhodopsin-2 (ChR2) à população gabaérgica das células do septo medial, crucialmente envolvidas na geração das oscilações de theta hippocampal, e um local sincronizado ativação de um subconjunto de afferents septal inibitório no hipocampo. A eficácia do controle do ritmo de optogenetic é verificada por um monitoramento simultâneo do campo local potencial (LFP) entre lâmina da área CA1 e/ou de descarga neuronal. Usando esta preparação facilmente implementável mostramos a eficácia de diferentes protocolos de estimulação optogenetic para indução de oscilações de theta e para a manipulação de sua frequência e regularidade. Finalmente, uma combinação do ritmo theta controle com inibição de projeção específico aborda a leitura de aspectos particulares da sincronização hippocampal por regiões eferentes.

Introdução

Atividade neuronal em mamíferos é coordenada por oscilações de rede, que ajudam a transferência de informações dentro e entre regiões cerebrais1,2,3,de4. Ritmos do cérebro incluem oscilações variando de muito lento (< 0,8 Hz) até ultra rápidas frequências (> 200 Hz). Um corpo grande da evidência suporta envolvimento das oscilações de rede em funções cerebrais diversas, incluindo cognição5,6,7,8,9,10 , comportamentos inata11,12 , bem como distúrbios neuropsiquiátricos, tais como a doença de Parkinson e epilepsia de14,13,15. Seletivos e temporalmente precisos métodos para manipulação experimental de oscilações de rede são, portanto, essenciais para o desenvolvimento de modelos fisiologicamente plausíveis de sincronização e para estabelecer nexos de causalidade com o comportamento.

Sincronização de rede é mediada por diversos substratos biológicos e processos, variando de identidade molecular de canais iônicos e sua cinética de neuromodulação da excitabilidade e conectividade de rede. O projeto biológico do ritmo geradores16 foi revelado para muitos ritmos cerebrais, aspectos distintos do qual (por exemplo, frequência, amplitude) são muitas vezes provocada pela dinâmica de redes e tipos de células distintas. Por exemplo, interneurônios inibitórios visando o somata das células principais são os jogadores mais importantes em bandas de frequência e cérebro regiões17,18, incluindo theta19,20, gama20 , 21e ondulação (140-200 Hz)22 oscilações. Por sua vez, sincronização de fase de células distantes é assegurada pelo robusto feed-forward sinalização de células piramidais, que redefine o disparo dos interneurônios. Um parâmetro crucial das oscilações, o tamanho da população neuronal sincronizada, está intimamente relacionado com a amplitude da oscilação LFP medidos e, pelo menos para oscilações rápidas, depende a unidade excitatória sobre interneurônios2. Em contraste, oscilações mais lentas, como delta e theta ritmos, são geradas pelos laços reentrantes de longo alcance, formados por córtico-talâmica23,24 e hippocampal-medial septal projeções25, 26,27, respectivamente. Oscilações em tais circuitos são trazidas pelas interações de atrasos de propagação do sinal, respostas excitáveis e sua preferência de frequência em participantes células28,29,30, 31 , 32. projeções inibitórias gabaérgica parvalbumin (PV)-positivo são células do septo medial (MS) para interneurônios no hipocampo25,33, regiões hipocampal e de córtex entorhinal26 essencial para a geração de oscilações de theta no lóbulo temporal. Assim, os mecanismos fisiológicos de oscilações de rede e sincronização neuronal podem ser manipulados usando optogenetics com uma precisão em tempo real.

Célula tipo específico optogenetic manipulações foram aplicadas para estudos das oscilações hippocampal e cortical em vitro34,35,36,37,38 e vivo em30,39,40,41,42,,43,44,45, incluindo funcional investigações de gama5,12,36,46,47,,48,,49,50, 51,52 e ondulação oscilações40,53,54 e sono fusos55,56. Recentemente nós expressa um vírus ChR2 Cre-dependente no MS, uma região chave para a geração do ritmo theta hippocampal, dos ratos PV-Cre. Usando esta preparação, características das oscilações theta hippocampal (frequência e estabilidade temporal) eram controladas por estimulação optogenetic de projeções inibidoras do MS no hipocampo11. Além disso, a estimulação de optogenetic frequência theta de projeções de displasia septo-hippocampal inibitórias evocado ritmo theta durante imobilidade acordada. O optogenetically arrastado Propriedades do ritmo theta exibido das oscilações de theta espontânea no rato na LFP e níveis de atividade neuronal.

As principais características deste protocolo incluem: (1) utilização de uma via inibitória que é fisiologicamente essencial para oscilações de theta espontânea, evitando efeitos inespecíficos na excitabilidade hippocampal; (2) axonal, ou seja, estimulação de projeção específicas para minimizar uma influência directa na não-hippocampal MS eferentes; (3) local theta-rítmica estimulação de luz, garantindo uma mínima interferência direta com dinâmica de displasia septo-hippocampal theta-rítmica e um arrastamento bilateral global das oscilações de theta; (4) paramétrico controle de frequência de oscilações de theta e regularidade; e (5) quantificação de fidelidade de arrastamento com alta resolução temporal usando LFP para permitir a análise quantitativa de causalidade em comportamento de animais. Uma vez que esta preparação essencialmente capitaliza sobre um papel bem conhecido da displasia septo-hippocampal desinibição em theta geração25,30, permite controle robusto sobre vários parâmetros de oscilações de theta no comportamento de ratos. Estudos onde outros menos caminhos investigados e tipos de células, os circuitos de displasia septo-hippocampal foram manipularam38,39,,47,,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 mais revelar mecanismos do ritmo theta.

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Protocolo

PV-Cre bater-nos ratos masculinos59, 10-25 semanas de idade, foram utilizados. Os ratos foram alojados em condições padrão na instalação de animais e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelas autoridades sanitárias locais (turismo für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. viral injeção

  1. Durante todo o processo, siga as orientações de segurança biológica60. Vestir um jaleco, máscara cirúrgica, uma touca e dois pares de luvas.
  2. Cortar um tubo com um bisturi estéril ou tesouras para aproximadamente 1 m de comprimento, inseri-lo no bloco suporte da bomba de seringa e corrigi-lo.
    1. Encha o tubo inteiramente com óleo de silicone, usando a seringa.
    2. Verifique se as bolhas de ar aparecem na tubulação. Se observam-se bolhas de ar, encha novamente o tubo com óleo.
    3. Corrigi o êmbolo para o bloco do empurrador.
    4. Avance lentamente o empurrador para o bloco de titular de seringa até a ponta do êmbolo toca a tubulação.
    5. Insira a ponta do êmbolo no tubo e automaticamente mover o bloco de empurrador em frente a uma velocidade lenta, selecionando "Infuse" na janela de comando e uma taxa de infusão baixa (por exemplo, 500 nL/min) até que ele atinja o bloco de titular de seringa.
  3. Prepare a agulha de injeção (34G).
    1. Retire o eixo da agulha com um corte limpo, usando um broca de precisão/moedor conectado a um disco de corte. Se necessário, use uma agulha para remover resíduos de metal da superfície recém cortada.
    2. Passe o tubo capilar (3-4 cm de comprimento) através da agulha.
    3. Cola a agulha para a tubagem com super cola.
    4. Conecte a agulha de injeção para a extremidade do tubo, que se conecta à bomba micro-seringa.
  4. Anexe a agulha para o titular estereotáxica.
  5. Retire o ar até uma bolha de ar no tubo transparente acima da agulha é visível.
  6. Anestesia o mouse com isoflurano 1,5-3% de oxigênio. Espere aproximadamente 2-3 min, em seguida, confirme que o mouse é totalmente anestesiado, avaliando sua resposta a uma pitada de dedo do pé. Durante a cirurgia, monitorar a respiração do animal e ajustar a concentração de isoflurano, se necessário.
  7. Posicione o mouse no quadro estereotáxico usando suportes de orelha não-traumáticos.
  8. Protege os olhos do rato com um gel de lipídios.
  9. Injetar lidocaína 0,1 mL por via intradérmica sob a pele cabeça usando um 0,01-1 mL seringa e uma cânula de injeção de 26G.
  10. Depilar e desinfetar a cabeça do rato utilizando solução de etanol. Então alterne três vezes 2% clorexidina com etanol para desinfectar o local da cirurgia.
  11. Realize uma incisão com uma tesoura afiada e bem indo entre a parte de trás das orelhas ao nível dos olhos, para que o bregma e o lambda são visíveis.
  12. Limpe o crânio aplicando aproximadamente 50 µ l de NaCl, usando uma seringa e seque com um lenço de papel e um sopro de ar.
  13. Posicione a cabeça de rato, ajustando o nível do dorso-ventral do grampo do nariz para que o bregma e o lambda são no mesmo nível dorso-ventral (± 0,3 mm).
  14. Faça um furo acima do MS (AP 0,98 e L 0,5 mm em referência o bregma).
  15. Neste ponto, descongele uma alíquota do vírus (deve conter pelo menos 2 µ l de AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente (RT).
  16. Centrifugue a alíquota a aproximadamente 4.000 x g em RT por 1 min.
  17. Pipeta de 2 µ l do vírus em um pedaço de Parafilm; Use o lado anteriormente protegido.
  18. Mergulhe a ponta da agulha da injeção no líquido e Retire cuidadosamente a cerca de 500 nL/min, observando o nível do líquido. Para evitar a aspiração de ar, parar retirada antes que o vírus é totalmente tomado. Ajustar a taxa de retirada de acordo com a viscosidade da solução; uma taxa mais rápida pode facilitar a retirada de um vírus com viscosidade mais elevada.
  19. Limpe a agulha com um lenço de papel.
  20. Verifique se o vírus está contido no tubo e o vírus e o óleo são separados por uma bolha de ar. Marca o nível do vírus no tubo a fim de controlar se o vírus com sucesso é infundida durante a injeção.
  21. Posicione a agulha acima a craniotomia e inseri-lo lentamente no cérebro do primeiro ponto de injeção (AP 0,98, L 0,5, V-5.2, lateral 5,5 °).
  22. Injetar 450 nL do vírus a uma taxa de 100-150 nL/min. espere por 10 min. cuidadosamente mover a agulha até 0,1 mm e esperar mais 5 minutos.
    1. Mover a agulha para o segundo ponto de injeção (AP 0,98, L 0,5, V-4.6) e injetar outro 450 nL em 100-150 nL/min.
    2. Espere novamente por 10 min antes de mover a agulha até 0,1 mm... esperar mais 5 minutos antes de retirar a agulha.
  23. Sutura da incisão com sutura trançada de seda preto usando quadrado knots. Aquecer o animal com uma luz vermelha para acelerar a recuperação. Administre antibióticos (0,3 mL Erycinum (1:4 em NaCl estéril)) e carprofeno i.p. diariamente 2-3 dias após a cirurgia.
  24. Corte o tubo acima da marca que indica o nível do vírus. O tubo pode ser usado para mais injeções. Prepare uma agulha de injeção fresco antes de cada injeção.
    Nota: Esta cirurgia leva cerca de 1-1.5 h. O animal acorda normalmente dentro de 5 min após a cirurgia. Espere um mínimo tempo de 6 semanas para expressão axonal suficiente, mas não mais de 5 meses antes de realizar implantações estereotáxica, como níveis de expressão começam a diminuir cerca de 6 meses após a injeção do vírus.

2. preparação de fibras ópticas (figura 1A)

  1. Use a fibra óptica multimodo (núcleo de 105 µm, vidro revestido com núcleo de sílica, 0.22 at). Revestimento de tira 125 µm do núcleo da fibra usando uma micro-stripper, enquanto a fibra ainda estiver presa no carretel de fibra.
  2. Corte a fibra de um comprimento de aproximadamente 2-3 cm usando uma faca de diamante.
  3. Insira a fibra em uma virola de vara cerâmica zircônia (ID: 126 µm). Aproximadamente 0,5-1 mm da fibra óptica deve sobressair do lado convexo da virola.
  4. Usando uma agulha, aplica uma gota de cola epóxi para ambas as extremidades do ferrolho, mas não para os lados da virola. Como alternativa, use super-cola.
  5. Permitir que a cola secar durante pelo menos 30 min.
  6. Polir o lado convexo da virola usando diamante lapidação fibra polimento filme (grãos de 3 µm).
  7. Teste a fidelidade da transferência de luz usando um medidor de potência óptica.
    1. Defina o comprimento de onda sobre o medidor de energia para o mesmo comprimento de onda como o laser sendo usado.
    2. Posicione o cabo de patch com a ponta virada para o centro do sensor. Potência do laser e ler a saída de luz do medidor de energia. O valor de registro.
    3. Conectar o cabo de remendo através de uma luva de acoplamento da fibra óptica e posicioná-lo com a ponta da fibra virado para o centro do sensor. Potência do laser e ler a saída de luz do medidor de energia. O valor de registro.
    4. Calcular a taxa de transmissão: dividir o segundo valor pelo valor do primeiro. Se a taxa de transmissão for inferior a 0,5, descartar a fibra, caso contrário, usá-lo para implantação.
    5. Teste a taxa de transmissão para cada fibra antes da implantação.
    6. Para experiências posteriores, ajustar a saída de intensidade da luz do laser para a taxa de transmissão da fibra óptica: defina a saída de luz da ponta do cabo de remendo de 5-15, dividido pela taxa de transmissão para obter uma saída de luz final da ponta de fibra de 5-15 mW.
      Nota: Veja também ref. 61 para a preparação de fibras ópticas.

3. preparação do fio de tungstênio matrizes para LFP gravações (figura 1B)

  1. Cola-vários (por exemplo 6) 100 µm guias de tubo de sílica em paralelo ao lado de um pedaço de fita pegajoso. Corte um pedaço, aproximadamente de 4 a 6 mm, para montagem de matriz de um fio.
  2. Fio isolado formvar 45 µm tungstênio os fios através dos tubos de guia usando fórceps.
  3. Tira seis isolados de esmalte bem cobre fios (aproximadamente 5 mm de comprimento) e um fio de aterramento (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) de ligação usando um bisturi para raspar o isolamento em ambas as extremidades. Solda-los aos pinos do nanoconnector.
  4. Conecte cada fio de ligação ao fio de um tungstênio usando uma gota de tinta condutiva prata, respectivamente. Deixe secar pelo menos 30 min.
  5. Aplique uma quantidade mínima de cimento para cobrir os fios. Não aplique o cimento sobre os fios de tungstênio, que serão inseridos no tecido cerebral ou na parte superior da nanoconnector. Deixe o cimento secar durante pelo menos 30 min.
  6. Executar um corte angular (5-20°) dos fios de tungstênio usando tesoura sem corte de aço inoxidável para permitir a implantação confiável de fios abaixo ou acima da zona adjacente ventralmente o estrato pyramidale, onde theta amplitude é demasiado baixa para a estimativa do fidelidade de arrastamento.
  7. Deinsulate da ponta (aproximadamente 2mm) do fio terra, usando um bisturi para raspar o isolamento. Trate com fluxo e presolder.
  8. Seleção de potenciais Cruz-conversações entre eletrodos usando uma digital multímetro. Para isso, conecte os pinos do conector para o multímetro, que deve ser definido como o modo de medição de resistência. Verifique emparelhadas combinações de canais; uma leitura no multímetro abaixo MΩ 5 indica significativa-conversas cruzadas.
  9. Verifique a impedância de cada eletrodo de arame em salina usando um medidor de impedância. Valores de impedância típica estão abaixo de 100 kΩ.
  10. Para facilitar a implantação, cola uma fibra óptica para a matriz do fio para que a ponta da fibra é a nível do fio mais curto e a ponteira de fibra está na proximidade, mas não tocar os fios de tungstênio. Mantenha o ângulo da fibra tão pequena quanto possível para evitar danos no tecido durante a implantação.
    Nota: Veja também ref. 62 para fabricação de matrizes de fio de tungstênio.

4. estereotáxicos implantações

  1. Realize preparações como descrito nos passos 1.6-1.13.
  2. Remover o tecido conjuntivo da parte superior do crânio e aperte os músculos do pescoço completamente por cerca de 2 mm para evitar artefatos musculares durante a gravação.
  3. Limpar o crânio usando um aplicador de ponta de algodão e soro fisiológico e faça 4 furos (2 na frente) e 2 acima do cerebelo, 0,8 mm de diâmetro para colocar parafusos de aço inoxidável de osso (00-96 x 1/16) para chão e estabilização do implante (Figura 1). Posicione o parafuso de terra, ligado a um fio de cobre (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) acima do cerebelo.
  4. Cobrir o chão-parafuso completamente com cimento para evitar artefatos musculares durante as gravações eletrofisiológicas. Construa um anel de cimento conectando todos os parafusos (Figura 1E).
  5. Execute uma craniotomia acima do lado de implantação (hipocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 em referência o bregma). Aplique cerca de 5 µ l de NaCl estéril na superfície do tecido cerebral.
  6. Abaixe lentamente a matriz de arame usando stereotaxis na craniotomia. Para gravações unitárias, implante uma sonda de silicone, em vez de uma matriz de fio63; a fim de evitar artefatos de luz optoelectric, a fibra óptica separadamente no hipocampo do implante com a ponta de fibra não directamente em frente da sonda (Figura 1 -eu). Para a investigação da coordenação do arrastamento entre hemisférios, implante uma fibra óptica adicional na área CA1 hippocampal contralateral.
  7. Aplica aproximadamente 5 µ l de óleo de cera/parafina líquida quente, pré-aquecido a 70 ° C, com uma seringa acima do local de implantação para proteger o tecido cerebral.
  8. Aplique o cimento em torno da matriz do fio e cobrir o crânio com cimento.
  9. Aplique uma gota de fluxo para o fio terra/referência presoldered e o presoldered fio conectado ao parafuso terra usando, por exemplo, uma agulha e fundir os fios usando uma máquina de solda.
  10. Cobrir o fio de terra inteira com cimento.
  11. Administrar 0,3 mL Erycinum (1:4 em estéril NaCl) e i.p. carprofeno (5mg/mL) após a cirurgia e pelo menos dois dias seguintes. O mouse normalmente acorda dentro de 15 min após a cirurgia. Aquecer o animal com uma luz vermelha para acelerar a recuperação.
  12. Monitore o peso do mouse diariamente para a primeira semana após a cirurgia, ou até que o peso está estável. Perda de peso não deve exceder 10% do peso do mouse gravado antes da cirurgia. Para acelerar a estabilização do peso, fornecer o mouse com comida úmida e leite condensado durante os primeiros dias após a cirurgia.
  13. Para gravar a atividade celular hippocampal durante o arrastamento, implante uma sonda de silicone no hipocampo (AP-1.94, 1.4 L, V. 1, com redução posterior) conforme descrito em ref. 62 (Figura 1 -eu). A fibra óptica no hipocampo na AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudal-rostral do implante. Implante uma fibra óptica adicional no MS (AP. +0.98, L 1, 3.9 V, lateral de 15 °), se a estimulação do somata célula é desejada.

5. Optogenetic estimulação e aquisição de dados eletrofisiológicos

  1. Se habituar o mouse para a configuração de gravação (por exemplo, sessões de 15 min, 1-2 sessões por dia durante 3 dias). Examine o comportamento do animal antes de começar com as primeiras experiências. Se o mouse está se movendo na câmara, explorar o ambiente, cheirar, realizando criadouros, etc., inicie a primeira sessão experimental.
  2. Coloque o mouse em uma câmara familiar na ausência de outros animais no mesmo quarto.
  3. Anexe um LED para cabeça-palco usando fita adesiva para rastrear a posição do animal. Certifique-se que o diodo emissor de luz é capturada pela câmera durante todo o período que o animal está explorando a câmara de gravação antes de iniciar os experimentos. Registro no escuro a fim de controlar a luz de LED. Posicione uma câmera acima da câmara de gravação.
  4. Verifique a saída de luz do cabo de remendo. Estime a saída de luz da ponta da fibra depois da conexão, dependendo da taxa de transmissão da fibra implantada. Certifique-se de que a saída de luz da ponta da fibra é entre 5 a 15 mW, para habilitar o arrastamento confiável.
  5. Conecte o pré-amplificador headstage ao conector cronicamente implantado. Conecte o cabo de remendo de fibra óptica para a fibra hippocampal cronicamente implantada para experimentos de estimulação optogenetic. Em experimentos de estimulação luminosa de controle, conecte a fibra óptica para uma manequim virola conectada ao fone de ouvido.
  6. Posicione o mouse na câmara de gravação.
  7. Abra o software para controlar o gerador de estímulo para gerar o protocolo de estimulação.
  8. Selecione o canal que controla o 473 nm laser DPSS. Na primeira linha digite 3.000 mV (coluna 1), tempo 30 ms (2ª coluna), valor 0 mV (coluna 3), tempo ms 112 (coluna 4), row repetição 840 e grupo 1 repetição, para gerar um protocolo para 2 min de estimulação de 7 Hz com pulsos longos de 30 ms. Ajuste o tempo de duração na coluna o 4 e o número de repetições de linha se a estimulação em outra frequência ou uma duração diferente é necessária. No segunda linha Selecione 0 mW (coluna 1), tempo de 500 h (2ª coluna), linha repetir 1 e grupo repetem 1, para garantir que o laser está sendo desligado após o protocolo de estimulação é finalizado.
  9. Clique em "arquivo > salvar como" e salve o arquivo com um nome desejado.
  10. Assegurar que o estimulador TTL saída provocar o laser é ligado para a placa de entrada analógica Digital Lynx para sincronizar a aquisição de eletrofisiológicos e optogenetic dados.
  11. Como alternativa, para regular parametricamente a variabilidade da frequência de oscilação do theta, aplica trens de pulsos de luz em diferentes intervalos de pulso inter, com períodos seguindo uma distribuição gaussiana. Modifica a dispersão do pulso inter intervalos para protocolos diferentes, por exemplo, da etapa 3.2 para 15,1 ms2. Aplica esses protocolos para gerar épocas theta com variabilidade diferente da frequência theta (Figura 6).
  12. Abra o software do sistema de gravação. Clique em "ACQ" para adquirir e "REC" para gravar. Espera, antes do início da estimulação luminosa para registrar o comportamento de linha de base (por exemplo, 2 min para recuperar a velocidade de linha de base ou 30 min para extrair campos de lugar a linha de base).
  13. Abra o software para controlar o gerador de estímulo. Clique em "Arquivo > abrir" e selecione o arquivo de protocolo de escolha. Clique em "Download e Start" para iniciar a estimulação luminosa.
    Nota: O experimento pode ser pesquisado, e a estimulação começou através do controle remoto; Isto exclui a influência da presença do experimentador sobre o comportamento do animal. Dependendo do objetivo do estudo, estimulação pode ser iniciada e encerrada durante a comportamentos específicos.

6. uma abordagem combinada para Optogenetic arrastamento e inibição de projeção específico da saída do hipocampo

  1. Express ChR2 em MS gabaérgica células de camundongos PV-Cre, conforme descrito na seção 1.
  2. Além disso, injetar um total de 2,4 µ l de CamKIIα halorhodopsin dependente (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) em ambos os hemisférios hipocampo dorsais (AP-1.7; L ± 1,05; V-2.05 e - 1,4 mm; AP-1.7; L ± 1,7; V-2.05 e - 1,55 mm; AP-2.3; L ± 1,5; V-2.2 e - 1.3 mm; AP-2.3; L ± 2,2; V-1.65 e - 2.45 mm).
  3. Permitir que 6 semanas de tempo de expressão.
  4. Implante uma matriz de fio de tungstênio com fibra óptica na região CA1 hippocampal, conforme descrito na seção 4. Além disso, implante bilateral ópticas fibras do septo lateral (LS, AP 0.1, L 0,25 V-2,250 mm, AP e 0,5, L-0.3, V-2,70 mm).
  5. Realize experimentos de arrastamento de theta optogenetic conforme descrito nas etapas 5.4-5.5.
    1. Para inibição simultânea da saída do hipocampo para o LS, gerar uma geração de estímulo de protocolo: por exemplo, gatilho do início do canal de saída conectado ao 593 nm DPSS laser 15 s com um pulso contínuo duradoura no total 45 s, antes de acionar a saída de pulsos para o laser DPSS 473 nm.
    2. Conecte as duas fibras no LS através de cabos de remendo usando um acoplador óptico fibra multimodo para um laser DPSS 593 nm.
    3. Iniciar a gravação e download e acionar o protocolo para controlar a geração do estímulo.

7. processamento de dados

  1. Converter os sinais eletrofisiológicos e posicionar o controle de dados com dados neurofisiológicos (ND) gerente para formatos. dat e .pos, respectivamente,64.
  2. Obter a LFP filtragem passa-baixo e baixo-amostragem do sinal de banda larga a 1.250 Hz usando Gerenciador de ND66.
  3. Em cada gravação, selecione o canal com a máxima amplitude de theta oscilações (usando Neuroscope)19.
  4. Detectar os carimbos de hora dos pulsos de laser e das épocas estimulação com um limiar de detecção algoritmo (usando MATLAB função findpeaks.m ou similar)11.
  5. Para importar o arquivo. dat em um software de análise de dados de multi-canal, clique em "Arquivo > importar", selecione "arquivos binários" como o tipo de dados e selecione o arquivo. dat. Na caixa de diálogo de configuração, digite o número correto de canais e uma taxa de amostragem de 1.250 Hz, clique em "okey" e salvar como arquivo de .smr. Traça os espectros de potência selecionando "Análise > novo resultado View > PowerSpectrum". Nas configurações, selecione o canal com a maior amplitude de theta e 16.384 tamanho da FFT, clique em "Novo", define como "Start time", o início da época de estimulação e como "Tempo do fim" o fim da época de estimulação e clique em "Processo".
  6. Calcular a fidelidade de arrastamento como a relação entre a densidade espectral de potência cumulativa (PSD) dentro da faixa de frequência de estimulação optogenetic (estimulação frequência ± 0,5 Hz), para o PSD cumulativo na banda theta (5-12 Hz) com o método multitaper (NW = 3, tamanho da janela 8.192) para 10 épocas de s (por exemplo, toolkit < http://chronux.org/>).
  7. Excluir gravação épocas onde o pico dominante do PSD é ≤ 5 Hz de análise (épocas não-theta, usando MATLAB função find.m).
  8. Traça a varredura dos espectros de potência LFP para todas as épocas gravadas de acordo com a fidelidade de arrastamento computada (usando pcolor.m e sortrows.m de funções do MATLAB). Carregar os espectros de potência e arrastamento fidelidade clicando em "Arquivo > abrir", armazenado potência variável de tipo pol. = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

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Resultados

Direcionamento de ChR2 para células gabaérgica no MS conforme descrito na seção 1 é ilustrado na Figura 2A. Optogenetic estimulação de axônios das células de MS gabaérgica no hipocampo dorsal através de uma fibra óptica que é implantado acima da área CA1 entrains oscilações theta na frequência do estímulo em ipsilateral (Figura 2B) bem como contralateral Hemisfério (Figura 2). Oscilações de Theta pod...

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Discussão

Aqui apresentamos uma metodologia amplamente acessível para arrastar e provocar oscilações theta hippocampal no comportamento animal. Essa abordagem pode ser útil para estudos de funções do ritmo theta no processamento de informações e comportamento. Aspectos críticos deste método incluem: (1) a escolha do opsin e direcionamento de ChR2 de axônios de MS em células do hipocampo, (2) robustas características ópticas e elétricas dos assemblies de matriz fios fibra óptica implantados para garantir estimulação contínua e LFP ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Maria Gorbati para ajuda especializada com análise de dados e Jennifer Kupferman para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; NeuroCure exc 257, TK e AP; Programa prioritário 1665, 1799/1-1(2), programa de Heisenberg, 1799/2-1, AP), a Fundação alemã-israelense de pesquisa científica e desenvolvimento (GIF; Eu-1326-421.13/2015, TK) e o programa de ciência de fronteira humana (HFSP; RGY0076/2012, TK).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos PV-CreO Laboratório JacksonB6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Surgery
StereotaxisDavid Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUAModelo 963Instrumento Estereotáxico Ultra Preciso para Pequenos Animais
Brocas, 0,8 mmBijoutil, Allschwil, Suíça49080HM
Seringa de 0,01-1 mlBraun, Melsungen, Alemanha9161406V
Cânulas de esterilizaçãoBraun26 G, 0,45x25 mm BL/LB
Tesouras finas e afiadasFine Science Tools Inc., Vancouver, Canadá14060-09
FórcepsFine Science Tools Inc.11210-10Dumont AA - Pinça revestida com epóxi
Tesoura de aço inoxidável sem corteFine Science Tools Inc.14018-14
Estação de soldaWeller Tools GmbH, Besigheim, AlemanhaWSD 81
EritromicinaRotexmedica GmbH, Trittau, AlemanhaPZN: 108239321g Pó para solução para infusão
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
Optogenetics
Hamilton pumpPHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USAmodelo 703008PHD Ultra Syringe Pump com mecanismo push/pull
Hamilton 5 µ L Seringa, 26 gaugePHD Ultra, Modelo de Aparelho Harvard75 RN SYR
Hamilton 5 µ L ÊmboloPHD Ultra, Aparelho HarvardModelo 75 RN SYR
TubulaçãoFisher Scientific, Pittsburgh, EUAPE 20Diâmetro interno 0,38 mm (0,015"), Diâmetro externo 1,09 mm (0,043")
Cânulas de esterilizaçãoBraun, Melsungen, Alemanha27 G, 25x0,40 mm, rombo
Furadeira/esmerilhadeira de precisãoProxxon, Wecker, Luxemburgofbs 240/e
Corte discosProxxonNO 28812
Cre dependente channelrhodopsinPenn Vector Core, Filadélfia, PA, EUAAV-1-18917PNome da construção: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, título: 1.42x1013 vg/ml
Cam quinase dependente de halorodopsinaPenn Vector CoreAV-1-26971PNome da construção: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, título: 2.08_1012 vg/ml
Fibra óptica multimodoThorLabs, Dachau, AlemanhaFG105LCA0,22 NA, Low-OH, Ø 105 µ Núcleo de m, 400 - 2400 nm
Virola de vara deProdutos de fibra de precisão, Milpitas, CA, EUACFLC126Virola de cerâmica LC MM, papel de polimento de ID 126um
ThorlabsLF3D6 "x 6" Diamond Lapping (polimento)
Medidor de potência Medidor de energiacompacto ThorlabsPM100DCompact Power and Energy Meter, Digital 4 "
LCD Multimodo acoplador de fibra ópticaThorlabsFCMM50-50A-FC1x2 MM Acoplador, Relação de Divisão 50:50, 50 µ m GI Fibers,
cabo de remendo de fibra ópticaThorlabsFG105LCA CUSTOM-MUCfeito sob medida, 3 m de comprimento, com tubulação de proteção, Tubulação: FT030, Conector 1: FC/PC, Conector 2: 1,25 mm (LC) Luva de virola de cerâmica
de fibra de precisão, Milpitas, CA, EUAADAL1Luva de acoplamento de cerâmica dividida para Ø Virolas de 1,25 mm (LC/PC) Laser
DPSS de 473 nmLaserglow Technologies, Toronto, ON, CanadáR471005FXSérie LRS-0473 Laser
DPSS de 593 nmLaserglow TechnologiesR591005FXLRS-0594 Series
MC_Stimulus IIMultichannel Systems, Reutlingen, AlemanhaSTG 4004
Módulo de condicionamento de impedânciaNeural microTargeting em todo o mundo, Bowdoin, EUAICM
NomeCompanyNúmero de CatálogoComentários<
u>Electrophysiology
Fios de tungstênioCalifornia Fine Wire Company, Grover Beach, CA, EUACFW001095440 µ m, 99.95%
Tubulação capilarOptronics1068150020ID: 100.4 µ m
Omnetics nanoconnectorOmnetics Connector Corporation, Minneapolis, EUAA79038-001
ParafusosBilaney, Dü sseldorf, Alemanha00-96x1/16
sonda de siliconeNeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, EUAB32
HeadstageNeuralynx, Bozeman, Montana EUAHS-8miniatura headstage unidade pré-amplificadores de ganho
Pintura condutora de prataConrad electronics, Alemanha530042
Fluxo líquidoFelder GMBH Lö ttechnik, Oberhausen, AlemanhaLö tö l STDIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LEDNeuralynxHS-LED-Red-omni-10V
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Software
MATLABMathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus softwareMultichannel, Systems
Neurophysiological Data ManagerNDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klustershttp://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software do sistema de gravaçãoNeuralynxCheetahhttps://neuralynx.com/software/cheetah
Software de análise de dados multicanalCambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GBSpike2
cerâmica FC/PC Produtos em aço inoxidável

Referências

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