Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Atividade neuronal em mamíferos é coordenada por oscilações de rede, que ajudam a transferência de informações dentro e entre regiões cerebrais^1,2,3,de⁴. Ritmos do cérebro incluem oscilações variando de muito lento (< 0,8 Hz) até ultra rápidas frequências (> 200 Hz). Um corpo grande da evidência suporta envolvimento das oscilações de rede em funções cerebrais diversas, incluindo cognição^5,6,7,8,9,10 , comportamentos inata^11,12 , bem como distúrbios neuropsiquiátricos, tais como a doença de Parkinson e epilepsia de^14,13,15. Seletivos e temporalmente precisos métodos para manipulação experimental de oscilações de rede são, portanto, essenciais para o desenvolvimento de modelos fisiologicamente plausíveis de sincronização e para estabelecer nexos de causalidade com o comportamento.

Sincronização de rede é mediada por diversos substratos biológicos e processos, variando de identidade molecular de canais iônicos e sua cinética de neuromodulação da excitabilidade e conectividade de rede. O projeto biológico do ritmo geradores¹⁶ foi revelado para muitos ritmos cerebrais, aspectos distintos do qual (por exemplo, frequência, amplitude) são muitas vezes provocada pela dinâmica de redes e tipos de células distintas. Por exemplo, interneurônios inibitórios visando o somata das células principais são os jogadores mais importantes em bandas de frequência e cérebro regiões^17,18, incluindo theta^19,20, gama^{20 , 21}e ondulação (140-200 Hz)²² oscilações. Por sua vez, sincronização de fase de células distantes é assegurada pelo robusto feed-forward sinalização de células piramidais, que redefine o disparo dos interneurônios. Um parâmetro crucial das oscilações, o tamanho da população neuronal sincronizada, está intimamente relacionado com a amplitude da oscilação LFP medidos e, pelo menos para oscilações rápidas, depende a unidade excitatória sobre interneurônios². Em contraste, oscilações mais lentas, como delta e theta ritmos, são geradas pelos laços reentrantes de longo alcance, formados por córtico-talâmica^23,24 e hippocampal-medial septal projeções^{25, 26,27}, respectivamente. Oscilações em tais circuitos são trazidas pelas interações de atrasos de propagação do sinal, respostas excitáveis e sua preferência de frequência em participantes células^{28,29,30, 31 , 32}. projeções inibitórias gabaérgica parvalbumin (PV)-positivo são células do septo medial (MS) para interneurônios no hipocampo^25,33, regiões hipocampal e de córtex entorhinal²⁶ essencial para a geração de oscilações de theta no lóbulo temporal. Assim, os mecanismos fisiológicos de oscilações de rede e sincronização neuronal podem ser manipulados usando optogenetics com uma precisão em tempo real.

Célula tipo específico optogenetic manipulações foram aplicadas para estudos das oscilações hippocampal e cortical em vitro^{34,35,36,37,38} e vivo em^{30,39,40,41,42,},^43,44,45, incluindo funcional investigações de gama^{5,12,36,46,47,},^48,,^{49,50, 51,52} e ondulação oscilações^40,53,54 e sono fusos^55,56. Recentemente nós expressa um vírus ChR2 Cre-dependente no MS, uma região chave para a geração do ritmo theta hippocampal, dos ratos PV-Cre. Usando esta preparação, características das oscilações theta hippocampal (frequência e estabilidade temporal) eram controladas por estimulação optogenetic de projeções inibidoras do MS no hipocampo¹¹. Além disso, a estimulação de optogenetic frequência theta de projeções de displasia septo-hippocampal inibitórias evocado ritmo theta durante imobilidade acordada. O optogenetically arrastado Propriedades do ritmo theta exibido das oscilações de theta espontânea no rato na LFP e níveis de atividade neuronal.

As principais características deste protocolo incluem: (1) utilização de uma via inibitória que é fisiologicamente essencial para oscilações de theta espontânea, evitando efeitos inespecíficos na excitabilidade hippocampal; (2) axonal, ou seja, estimulação de projeção específicas para minimizar uma influência directa na não-hippocampal MS eferentes; (3) local theta-rítmica estimulação de luz, garantindo uma mínima interferência direta com dinâmica de displasia septo-hippocampal theta-rítmica e um arrastamento bilateral global das oscilações de theta; (4) paramétrico controle de frequência de oscilações de theta e regularidade; e (5) quantificação de fidelidade de arrastamento com alta resolução temporal usando LFP para permitir a análise quantitativa de causalidade em comportamento de animais. Uma vez que esta preparação essencialmente capitaliza sobre um papel bem conhecido da displasia septo-hippocampal desinibição em theta geração^25,30, permite controle robusto sobre vários parâmetros de oscilações de theta no comportamento de ratos. Estudos onde outros menos caminhos investigados e tipos de células, os circuitos de displasia septo-hippocampal foram manipularam^38,39,,^47,,^{49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} mais revelar mecanismos do ritmo theta.

PV-Cre bater-nos ratos masculinos⁵⁹, 10-25 semanas de idade, foram utilizados. Os ratos foram alojados em condições padrão na instalação de animais e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelas autoridades sanitárias locais (turismo für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. viral injeção

1. Durante todo o processo, siga as orientações de segurança biológica⁶⁰. Vestir um jaleco, máscara cirúrgica, uma touca e dois pares de luvas.
2. Cortar um tubo com um bisturi estéril ou tesouras para aproximadamente 1 m de comprimento, inseri-lo no bloco suporte da bomba de seringa e corrigi-lo.
   1. Encha o tubo inteiramente com óleo de silicone, usando a seringa.
   2. Verifique se as bolhas de ar aparecem na tubulação. Se observam-se bolhas de ar, encha novamente o tubo com óleo.
   3. Corrigi o êmbolo para o bloco do empurrador.
   4. Avance lentamente o empurrador para o bloco de titular de seringa até a ponta do êmbolo toca a tubulação.
   5. Insira a ponta do êmbolo no tubo e automaticamente mover o bloco de empurrador em frente a uma velocidade lenta, selecionando "Infuse" na janela de comando e uma taxa de infusão baixa (por exemplo, 500 nL/min) até que ele atinja o bloco de titular de seringa.
3. Prepare a agulha de injeção (34G).
   1. Retire o eixo da agulha com um corte limpo, usando um broca de precisão/moedor conectado a um disco de corte. Se necessário, use uma agulha para remover resíduos de metal da superfície recém cortada.
   2. Passe o tubo capilar (3-4 cm de comprimento) através da agulha.
   3. Cola a agulha para a tubagem com super cola.
   4. Conecte a agulha de injeção para a extremidade do tubo, que se conecta à bomba micro-seringa.
4. Anexe a agulha para o titular estereotáxica.
5. Retire o ar até uma bolha de ar no tubo transparente acima da agulha é visível.
6. Anestesia o mouse com isoflurano 1,5-3% de oxigênio. Espere aproximadamente 2-3 min, em seguida, confirme que o mouse é totalmente anestesiado, avaliando sua resposta a uma pitada de dedo do pé. Durante a cirurgia, monitorar a respiração do animal e ajustar a concentração de isoflurano, se necessário.
7. Posicione o mouse no quadro estereotáxico usando suportes de orelha não-traumáticos.
8. Protege os olhos do rato com um gel de lipídios.
9. Injetar lidocaína 0,1 mL por via intradérmica sob a pele cabeça usando um 0,01-1 mL seringa e uma cânula de injeção de 26G.
10. Depilar e desinfetar a cabeça do rato utilizando solução de etanol. Então alterne três vezes 2% clorexidina com etanol para desinfectar o local da cirurgia.
11. Realize uma incisão com uma tesoura afiada e bem indo entre a parte de trás das orelhas ao nível dos olhos, para que o bregma e o lambda são visíveis.
12. Limpe o crânio aplicando aproximadamente 50 µ l de NaCl, usando uma seringa e seque com um lenço de papel e um sopro de ar.
13. Posicione a cabeça de rato, ajustando o nível do dorso-ventral do grampo do nariz para que o bregma e o lambda são no mesmo nível dorso-ventral (± 0,3 mm).
14. Faça um furo acima do MS (AP 0,98 e L 0,5 mm em referência o bregma).
15. Neste ponto, descongele uma alíquota do vírus (deve conter pelo menos 2 µ l de AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente (RT).
16. Centrifugue a alíquota a aproximadamente 4.000 x g em RT por 1 min.
17. Pipeta de 2 µ l do vírus em um pedaço de Parafilm; Use o lado anteriormente protegido.
18. Mergulhe a ponta da agulha da injeção no líquido e Retire cuidadosamente a cerca de 500 nL/min, observando o nível do líquido. Para evitar a aspiração de ar, parar retirada antes que o vírus é totalmente tomado. Ajustar a taxa de retirada de acordo com a viscosidade da solução; uma taxa mais rápida pode facilitar a retirada de um vírus com viscosidade mais elevada.
19. Limpe a agulha com um lenço de papel.
20. Verifique se o vírus está contido no tubo e o vírus e o óleo são separados por uma bolha de ar. Marca o nível do vírus no tubo a fim de controlar se o vírus com sucesso é infundida durante a injeção.
21. Posicione a agulha acima a craniotomia e inseri-lo lentamente no cérebro do primeiro ponto de injeção (AP 0,98, L 0,5, V-5.2, lateral 5,5 °).
22. Injetar 450 nL do vírus a uma taxa de 100-150 nL/min. espere por 10 min. cuidadosamente mover a agulha até 0,1 mm e esperar mais 5 minutos.
    1. Mover a agulha para o segundo ponto de injeção (AP 0,98, L 0,5, V-4.6) e injetar outro 450 nL em 100-150 nL/min.
    2. Espere novamente por 10 min antes de mover a agulha até 0,1 mm... esperar mais 5 minutos antes de retirar a agulha.
23. Sutura da incisão com sutura trançada de seda preto usando quadrado knots. Aquecer o animal com uma luz vermelha para acelerar a recuperação. Administre antibióticos (0,3 mL Erycinum (1:4 em NaCl estéril)) e carprofeno i.p. diariamente 2-3 dias após a cirurgia.
24. Corte o tubo acima da marca que indica o nível do vírus. O tubo pode ser usado para mais injeções. Prepare uma agulha de injeção fresco antes de cada injeção.
    Nota: Esta cirurgia leva cerca de 1-1.5 h. O animal acorda normalmente dentro de 5 min após a cirurgia. Espere um mínimo tempo de 6 semanas para expressão axonal suficiente, mas não mais de 5 meses antes de realizar implantações estereotáxica, como níveis de expressão começam a diminuir cerca de 6 meses após a injeção do vírus.

2. preparação de fibras ópticas (figura 1A)

1. Use a fibra óptica multimodo (núcleo de 105 µm, vidro revestido com núcleo de sílica, 0.22 at). Revestimento de tira 125 µm do núcleo da fibra usando uma micro-stripper, enquanto a fibra ainda estiver presa no carretel de fibra.
2. Corte a fibra de um comprimento de aproximadamente 2-3 cm usando uma faca de diamante.
3. Insira a fibra em uma virola de vara cerâmica zircônia (ID: 126 µm). Aproximadamente 0,5-1 mm da fibra óptica deve sobressair do lado convexo da virola.
4. Usando uma agulha, aplica uma gota de cola epóxi para ambas as extremidades do ferrolho, mas não para os lados da virola. Como alternativa, use super-cola.
5. Permitir que a cola secar durante pelo menos 30 min.
6. Polir o lado convexo da virola usando diamante lapidação fibra polimento filme (grãos de 3 µm).
7. Teste a fidelidade da transferência de luz usando um medidor de potência óptica.
   1. Defina o comprimento de onda sobre o medidor de energia para o mesmo comprimento de onda como o laser sendo usado.
   2. Posicione o cabo de patch com a ponta virada para o centro do sensor. Potência do laser e ler a saída de luz do medidor de energia. O valor de registro.
   3. Conectar o cabo de remendo através de uma luva de acoplamento da fibra óptica e posicioná-lo com a ponta da fibra virado para o centro do sensor. Potência do laser e ler a saída de luz do medidor de energia. O valor de registro.
   4. Calcular a taxa de transmissão: dividir o segundo valor pelo valor do primeiro. Se a taxa de transmissão for inferior a 0,5, descartar a fibra, caso contrário, usá-lo para implantação.
   5. Teste a taxa de transmissão para cada fibra antes da implantação.
   6. Para experiências posteriores, ajustar a saída de intensidade da luz do laser para a taxa de transmissão da fibra óptica: defina a saída de luz da ponta do cabo de remendo de 5-15, dividido pela taxa de transmissão para obter uma saída de luz final da ponta de fibra de 5-15 mW.
      Nota: Veja também ref. ⁶¹ para a preparação de fibras ópticas.

3. preparação do fio de tungstênio matrizes para LFP gravações (figura 1B)

1. Cola-vários (por exemplo 6) 100 µm guias de tubo de sílica em paralelo ao lado de um pedaço de fita pegajoso. Corte um pedaço, aproximadamente de 4 a 6 mm, para montagem de matriz de um fio.
2. Fio isolado formvar 45 µm tungstênio os fios através dos tubos de guia usando fórceps.
3. Tira seis isolados de esmalte bem cobre fios (aproximadamente 5 mm de comprimento) e um fio de aterramento (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) de ligação usando um bisturi para raspar o isolamento em ambas as extremidades. Solda-los aos pinos do nanoconnector.
4. Conecte cada fio de ligação ao fio de um tungstênio usando uma gota de tinta condutiva prata, respectivamente. Deixe secar pelo menos 30 min.
5. Aplique uma quantidade mínima de cimento para cobrir os fios. Não aplique o cimento sobre os fios de tungstênio, que serão inseridos no tecido cerebral ou na parte superior da nanoconnector. Deixe o cimento secar durante pelo menos 30 min.
6. Executar um corte angular (5-20°) dos fios de tungstênio usando tesoura sem corte de aço inoxidável para permitir a implantação confiável de fios abaixo ou acima da zona adjacente ventralmente o estrato pyramidale, onde theta amplitude é demasiado baixa para a estimativa do fidelidade de arrastamento.
7. Deinsulate da ponta (aproximadamente 2mm) do fio terra, usando um bisturi para raspar o isolamento. Trate com fluxo e presolder.
8. Seleção de potenciais Cruz-conversações entre eletrodos usando uma digital multímetro. Para isso, conecte os pinos do conector para o multímetro, que deve ser definido como o modo de medição de resistência. Verifique emparelhadas combinações de canais; uma leitura no multímetro abaixo MΩ 5 indica significativa-conversas cruzadas.
9. Verifique a impedância de cada eletrodo de arame em salina usando um medidor de impedância. Valores de impedância típica estão abaixo de 100 kΩ.
10. Para facilitar a implantação, cola uma fibra óptica para a matriz do fio para que a ponta da fibra é a nível do fio mais curto e a ponteira de fibra está na proximidade, mas não tocar os fios de tungstênio. Mantenha o ângulo da fibra tão pequena quanto possível para evitar danos no tecido durante a implantação.
    Nota: Veja também ref. ⁶² para fabricação de matrizes de fio de tungstênio.

4. estereotáxicos implantações

1. Realize preparações como descrito nos passos 1.6-1.13.
2. Remover o tecido conjuntivo da parte superior do crânio e aperte os músculos do pescoço completamente por cerca de 2 mm para evitar artefatos musculares durante a gravação.
3. Limpar o crânio usando um aplicador de ponta de algodão e soro fisiológico e faça 4 furos (2 na frente) e 2 acima do cerebelo, 0,8 mm de diâmetro para colocar parafusos de aço inoxidável de osso (00-96 x 1/16) para chão e estabilização do implante (Figura 1). Posicione o parafuso de terra, ligado a um fio de cobre (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) acima do cerebelo.
4. Cobrir o chão-parafuso completamente com cimento para evitar artefatos musculares durante as gravações eletrofisiológicas. Construa um anel de cimento conectando todos os parafusos (Figura 1E).
5. Execute uma craniotomia acima do lado de implantação (hipocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 em referência o bregma). Aplique cerca de 5 µ l de NaCl estéril na superfície do tecido cerebral.
6. Abaixe lentamente a matriz de arame usando stereotaxis na craniotomia. Para gravações unitárias, implante uma sonda de silicone, em vez de uma matriz de fio⁶³; a fim de evitar artefatos de luz optoelectric, a fibra óptica separadamente no hipocampo do implante com a ponta de fibra não directamente em frente da sonda (Figura 1 -eu). Para a investigação da coordenação do arrastamento entre hemisférios, implante uma fibra óptica adicional na área CA1 hippocampal contralateral.
7. Aplica aproximadamente 5 µ l de óleo de cera/parafina líquida quente, pré-aquecido a 70 ° C, com uma seringa acima do local de implantação para proteger o tecido cerebral.
8. Aplique o cimento em torno da matriz do fio e cobrir o crânio com cimento.
9. Aplique uma gota de fluxo para o fio terra/referência presoldered e o presoldered fio conectado ao parafuso terra usando, por exemplo, uma agulha e fundir os fios usando uma máquina de solda.
10. Cobrir o fio de terra inteira com cimento.
11. Administrar 0,3 mL Erycinum (1:4 em estéril NaCl) e i.p. carprofeno (5mg/mL) após a cirurgia e pelo menos dois dias seguintes. O mouse normalmente acorda dentro de 15 min após a cirurgia. Aquecer o animal com uma luz vermelha para acelerar a recuperação.
12. Monitore o peso do mouse diariamente para a primeira semana após a cirurgia, ou até que o peso está estável. Perda de peso não deve exceder 10% do peso do mouse gravado antes da cirurgia. Para acelerar a estabilização do peso, fornecer o mouse com comida úmida e leite condensado durante os primeiros dias após a cirurgia.
13. Para gravar a atividade celular hippocampal durante o arrastamento, implante uma sonda de silicone no hipocampo (AP-1.94, 1.4 L, V. 1, com redução posterior) conforme descrito em ref. ⁶² (Figura 1 -eu). A fibra óptica no hipocampo na AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudal-rostral do implante. Implante uma fibra óptica adicional no MS (AP. +0.98, L 1, 3.9 V, lateral de 15 °), se a estimulação do somata célula é desejada.

5. Optogenetic estimulação e aquisição de dados eletrofisiológicos

1. Se habituar o mouse para a configuração de gravação (por exemplo, sessões de 15 min, 1-2 sessões por dia durante 3 dias). Examine o comportamento do animal antes de começar com as primeiras experiências. Se o mouse está se movendo na câmara, explorar o ambiente, cheirar, realizando criadouros, etc., inicie a primeira sessão experimental.
2. Coloque o mouse em uma câmara familiar na ausência de outros animais no mesmo quarto.
3. Anexe um LED para cabeça-palco usando fita adesiva para rastrear a posição do animal. Certifique-se que o diodo emissor de luz é capturada pela câmera durante todo o período que o animal está explorando a câmara de gravação antes de iniciar os experimentos. Registro no escuro a fim de controlar a luz de LED. Posicione uma câmera acima da câmara de gravação.
4. Verifique a saída de luz do cabo de remendo. Estime a saída de luz da ponta da fibra depois da conexão, dependendo da taxa de transmissão da fibra implantada. Certifique-se de que a saída de luz da ponta da fibra é entre 5 a 15 mW, para habilitar o arrastamento confiável.
5. Conecte o pré-amplificador headstage ao conector cronicamente implantado. Conecte o cabo de remendo de fibra óptica para a fibra hippocampal cronicamente implantada para experimentos de estimulação optogenetic. Em experimentos de estimulação luminosa de controle, conecte a fibra óptica para uma manequim virola conectada ao fone de ouvido.
6. Posicione o mouse na câmara de gravação.
7. Abra o software para controlar o gerador de estímulo para gerar o protocolo de estimulação.
8. Selecione o canal que controla o 473 nm laser DPSS. Na primeira linha digite 3.000 mV (coluna 1), tempo 30 ms (2ª coluna), valor 0 mV (coluna 3), tempo ms 112 (coluna 4), row repetição 840 e grupo 1 repetição, para gerar um protocolo para 2 min de estimulação de 7 Hz com pulsos longos de 30 ms. Ajuste o tempo de duração na coluna o 4 e o número de repetições de linha se a estimulação em outra frequência ou uma duração diferente é necessária. No segunda linha Selecione 0 mW (coluna 1), tempo de 500 h (2ª coluna), linha repetir 1 e grupo repetem 1, para garantir que o laser está sendo desligado após o protocolo de estimulação é finalizado.
9. Clique em "arquivo > salvar como" e salve o arquivo com um nome desejado.
10. Assegurar que o estimulador TTL saída provocar o laser é ligado para a placa de entrada analógica Digital Lynx para sincronizar a aquisição de eletrofisiológicos e optogenetic dados.
11. Como alternativa, para regular parametricamente a variabilidade da frequência de oscilação do theta, aplica trens de pulsos de luz em diferentes intervalos de pulso inter, com períodos seguindo uma distribuição gaussiana. Modifica a dispersão do pulso inter intervalos para protocolos diferentes, por exemplo, da etapa 3.2 para 15,1 ms². Aplica esses protocolos para gerar épocas theta com variabilidade diferente da frequência theta (Figura 6).
12. Abra o software do sistema de gravação. Clique em "ACQ" para adquirir e "REC" para gravar. Espera, antes do início da estimulação luminosa para registrar o comportamento de linha de base (por exemplo, 2 min para recuperar a velocidade de linha de base ou 30 min para extrair campos de lugar a linha de base).
13. Abra o software para controlar o gerador de estímulo. Clique em "Arquivo > abrir" e selecione o arquivo de protocolo de escolha. Clique em "Download e Start" para iniciar a estimulação luminosa.
    Nota: O experimento pode ser pesquisado, e a estimulação começou através do controle remoto; Isto exclui a influência da presença do experimentador sobre o comportamento do animal. Dependendo do objetivo do estudo, estimulação pode ser iniciada e encerrada durante a comportamentos específicos.

6. uma abordagem combinada para Optogenetic arrastamento e inibição de projeção específico da saída do hipocampo

1. Express ChR2 em MS gabaérgica células de camundongos PV-Cre, conforme descrito na seção 1.
2. Além disso, injetar um total de 2,4 µ l de CamKIIα halorhodopsin dependente (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) em ambos os hemisférios hipocampo dorsais (AP-1.7; L ± 1,05; V-2.05 e - 1,4 mm; AP-1.7; L ± 1,7; V-2.05 e - 1,55 mm; AP-2.3; L ± 1,5; V-2.2 e - 1.3 mm; AP-2.3; L ± 2,2; V-1.65 e - 2.45 mm).
3. Permitir que 6 semanas de tempo de expressão.
4. Implante uma matriz de fio de tungstênio com fibra óptica na região CA1 hippocampal, conforme descrito na seção 4. Além disso, implante bilateral ópticas fibras do septo lateral (LS, AP 0.1, L 0,25 V-2,250 mm, AP e 0,5, L-0.3, V-2,70 mm).
5. Realize experimentos de arrastamento de theta optogenetic conforme descrito nas etapas 5.4-5.5.
   1. Para inibição simultânea da saída do hipocampo para o LS, gerar uma geração de estímulo de protocolo: por exemplo, gatilho do início do canal de saída conectado ao 593 nm DPSS laser 15 s com um pulso contínuo duradoura no total 45 s, antes de acionar a saída de pulsos para o laser DPSS 473 nm.
   2. Conecte as duas fibras no LS através de cabos de remendo usando um acoplador óptico fibra multimodo para um laser DPSS 593 nm.
   3. Iniciar a gravação e download e acionar o protocolo para controlar a geração do estímulo.

7. processamento de dados

1. Converter os sinais eletrofisiológicos e posicionar o controle de dados com dados neurofisiológicos (ND) gerente para formatos. dat e .pos, respectivamente,⁶⁴.
2. Obter a LFP filtragem passa-baixo e baixo-amostragem do sinal de banda larga a 1.250 Hz usando Gerenciador de ND⁶⁶.
3. Em cada gravação, selecione o canal com a máxima amplitude de theta oscilações (usando Neuroscope)¹⁹.
4. Detectar os carimbos de hora dos pulsos de laser e das épocas estimulação com um limiar de detecção algoritmo (usando MATLAB função findpeaks.m ou similar)¹¹.
5. Para importar o arquivo. dat em um software de análise de dados de multi-canal, clique em "Arquivo > importar", selecione "arquivos binários" como o tipo de dados e selecione o arquivo. dat. Na caixa de diálogo de configuração, digite o número correto de canais e uma taxa de amostragem de 1.250 Hz, clique em "okey" e salvar como arquivo de .smr. Traça os espectros de potência selecionando "Análise > novo resultado View > PowerSpectrum". Nas configurações, selecione o canal com a maior amplitude de theta e 16.384 tamanho da FFT, clique em "Novo", define como "Start time", o início da época de estimulação e como "Tempo do fim" o fim da época de estimulação e clique em "Processo".
6. Calcular a fidelidade de arrastamento como a relação entre a densidade espectral de potência cumulativa (PSD) dentro da faixa de frequência de estimulação optogenetic (estimulação frequência ± 0,5 Hz), para o PSD cumulativo na banda theta (5-12 Hz) com o método multitaper (NW = 3, tamanho da janela 8.192) para 10 épocas de s (por exemplo, toolkit < http://chronux.org/>).
7. Excluir gravação épocas onde o pico dominante do PSD é ≤ 5 Hz de análise (épocas não-theta, usando MATLAB função find.m).
8. Traça a varredura dos espectros de potência LFP para todas as épocas gravadas de acordo com a fidelidade de arrastamento computada (usando pcolor.m e sortrows.m de funções do MATLAB). Carregar os espectros de potência e arrastamento fidelidade clicando em "Arquivo > abrir", armazenado potência variável de tipo pol. = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Direcionamento de ChR2 para células gabaérgica no MS conforme descrito na seção 1 é ilustrado na Figura 2A. Optogenetic estimulação de axônios das células de MS gabaérgica no hipocampo dorsal através de uma fibra óptica que é implantado acima da área CA1 entrains oscilações theta na frequência do estímulo em ipsilateral (Figura 2B) bem como contralateral Hemisfério (Figura 2). Oscilações de Theta podem ser mais ou menos eficientemente arrastadas pela estimulação optogenetic (Figura 3A), a eficácia do que foi calculada para cada época de gravação como um theta relativo poder LFP em torno da frequência de estimulação, ou seja, fidelidade de arrastamento (Figura 3B). Fidelidade de arrastamento acima de 0,3, ou seja, maior do que nas espontâneas luz-fora as gravações, foi observada em aproximadamente 80% das épocas a gravação. Optostimulation em frequências não-theta foi menos eficaz (Figura 3).

Explícita ou seja, manipulação paramétrica de oscilações de theta frequência é acompanhada por mudanças emergentes de regularidade theta: regularidade temporal da amplitude e frequência das oscilações theta foi aumentados durante épocas com alta fidelidade de arrastamento. A estabilidade das oscilações também pode ser regulada parametricamente aplicando trens de pulsos de luz, períodos, dos quais seguem distribuições Gaussian com dispersões diferentes (Figura 4).

Optogenetic controle sobre a frequência de oscilações eliminou a correlação entre a frequência theta e velocidade de corrida, de acordo com o controle de frequência através do MS por ascendente afferents durante o movimento (Figura 5A). Optostimulation induzido também oscilações de theta durante imobilidade (Figura 5B). As fases de fuzilamento preferenciais registrado na área CA1 nas células piramidais putativos e interneurônios foram alterados em relação a oscilação de theta optogenetically arrastado quando comparado ao theta espontânea (Figura 6).

Para estudar a contribuição do hipocampo ao pathway septo lateral no Regulamento mediada por theta de locomoção, nós optogenetically inibiu esta via. Halorhodopsin (eNpHR3.0) bilateral foi expressa em células piramidais hippocampal (Figura 7A), Considerando que ChR2 foi expressa em células de MS gabaérgica como acima e oscilações de theta foram optogenetically arrastado (Figura 7B). O arrastamento de theta reduzida variabilidade de velocidade, mas não quando o hipocampo ao pathway LS foi inibido em execução (Figura 7).

Figura 1: ilustração de fibras ópticas, eletrodos e cirurgia. (A) ilustração de uma fibra óptica. (B) ilustração de uma matriz de fio colado a uma fibra óptica para a gravação do LFP hippocampal durante o arrastamento das oscilações de theta hippocampal. (C) para a gravação da atividade celular hippocampal, uma sonda de silicone é montada sobre um microdrive. (D) os parafusos em miniatura são posicionados no crânio. Fios de cobre são presoldered para o chão e referência parafuso antes posicionando-as acima do cerebelo. (E) cimento é aplicado para cobrir e conectar os parafusos. O círculo azul superior indica onde a craniotomia foi realizada para a implantação da sonda do silicone. Círculo azul inferior indica onde a craniotomia foi realizada para a implantação da fibra óptica no hipocampo. (F), uma fibra óptica é implantada em um ângulo caudal-rostral para atingir a região CA1 hippocampal. Uma segunda fibra poderá ser implantada do septo medial se estimulação do somata célula é desejada (opcional). Sonda (G), o silicone é reduzida para apenas acima da área CA1 do hipocampo. (H) as fronteiras do microdrive e conector são cimentadas para o implante e o chão, e os fios de referência são soldados. (eu) cobre malha é construída para cercar o implante e servir como uma gaiola de Faraday. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: preparação para o arrastamento de theta hippocampal optogenetic. (A) ChR2 foi expressa em PV+ medial septais células em camundongos PV-Cre (regime superior). Fluorescência em MS (1, 2) confirma a construção bem sucedida expressão em somata. Fibras de MS project via fórnice (f) e fímbria (fi), o hipocampo (3-6); Aca: comissura anterior; parte anterior. HDB: núcleo do membro horizontal da banda diagonal; Ou: oriens estrato. A fibra óptica para a estimulação de optogenetic com a luz azul é implantada acima da camada piramidal de hippocampal área CA1 (regime inferior). Barras de escala: 500 µm (imagens 1, 3, 4) e 50 µm (imagens 2, 5, 6). (B) LFP Hippocampal durante oscilações theta espontânea (à esquerda) e 7 Hz (médio) ou arrastamento de 10 Hz optogenetic (à direita). Listras azuis indicam as janelas de tempo de aplicação de luz. Nota a fase redefinir pelo pulso de luz, indicado por uma seta. Nota gama envelopes durante theta espontânea e arrastado, de um indicador do ritmo fisiológico do theta. Fase de inversão entre o estrato oriens (Str. ou.) e estrato radiatum (Str. Ramos) também é mantido durante o arrastamento. (C) arrastamento é confiável durante ipsilaterais (parcelas superiores), bem como contralaterais (lotes menores) estimulação optogenetic. Esquemas de ilustram as posições das fibras em relação a posições de eletrodos. Vestígios LFP exemplo durante theta e a aplicação de pulsos de luz são mostrados no meio. À direita, poder espectros da LFP hippocampal durante ipsi - e estimulação contralateral, codificados por cores de acordo com a frequência de estimulação. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: fidelidade de arrastamento de theta hippocampal optogenetic. (A) exemplo hippocampal LFP vestígios durante a fidelidade de arrastamento de baixa e alta. (B) potência espectrais densidades de 10 épocas de s durante o theta espontânea, com linhas ordenados de acordo com levando a frequência theta (à esquerda) e 7 Hz (médio) e estimulação de optogenetic (à direita) de 10 Hz, com linhas ordenados de acordo com a fidelidade de arrastamento. Espectros de potência exemplo respectivos (indicados por uma seta) são plotados acima. Observe a fidelidade de arrastamento confiável em épocas. À direita, é mostrada a probabilidade cumulativa de fidelidade de arrastamento para frequências theta. (C) arrastamento requer estimulação rítmica de theta. Atividade de rede hippocampal pode ser arrastada com êxito usando frequências entre 6-12 Hz. Em frequências mais baixas (por exemplo, 2 ou 4 Hz) ou maior arrastamento de frequências (por exemplo, 20 Hz) não é confiável. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: manipulação paramétrica de regularidade de oscilações theta. (A) estimulação foi aplicada em diferentes frequências dentro da faixa theta com uma frequência média de 7,8 Hz seguindo uma distribuição gaussiana. O desvio-padrão dos intervalos inter pulso foi aumentado através de protocolos de σ = 3.19 a σ = 15,09. No total, 11 protocolos foram gerados e aplicados, cada um com uma duração total da época de estimulação de 1 min. Desses, a distribuição de probabilidade de 5 protocolos são mostrados à esquerda da figura. A densidade de potência espectral dentro de um intervalo de 1-14 Hz de LFP hippocampal durante a aplicação dos respectivos protocolos é plotada no meio da figura. As probabilidades dos períodos de theta durante a aplicação dos respectivos protocolos são ilustradas no lado direito. (B) a variação de mecânicas intervalos de pulso inter determinado a variação do período de theta simultâneas (r de Pearson = 0,94, p = 0,0002). (C) a relação entre a variabilidade de amplitude theta e o pulso inter intervalo (r de Pearson = 0,61, p = 0,08). Esta figura foi modificada de ref. 70. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Optogenetic arrastamento rítmico de theta determina LFP hippocampal durante comportamento. (A) frequência de estimulação Optogenetic determinado a frequência theta durante a locomoção. Daí, afferents velocidade-relacionados não impactam a frequência theta hippocampal, e como consequência, velocidade não está correlacionada com frequência theta (azul) encontra durante espontânea theta (preto). Os dados são apresentados como média ± no MEV mostrou (B) durante a vigília do silêncio, o theta hippocampal pode ser provocada na ausência de movimento. Vestígios LFP hippocampal antes e durante a bem sucedido arrastamento são mostrados acima, e traços de velocidade exemplo gravados durante o arrastamento são mostrados abaixo (o traço vermelho corresponde ao rastreamento LFP hippocampal retratado acima). Listras azuis marcam as janelas de tempo de pulsos de luz de estimulação. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: atividade celular Hippocampal durante o arrastamento de theta. (A) atividade celular foi gravada usando sondas de silicone (esquema). Interneurônios único e células piramidais foram isoladas e identificadas de acordo com sua respectiva forma de onda. Mostrado aqui é a forma de onda média (média) e auto-correlogram de uma célula piramidal isolado de exemplo. (B) fase de descarga preferenciais de células piramidais (Pyr) não foi diferente durante espontânea (em preto, n = 29 neurônios) e optogenetically arrastado (em azul, n = 30) theta (p = 0,79). (C) mostrado aqui é o auto-correlogram (à esquerda) e fase de fuzilamento preferencial de um interneurônio rápido acionamento durante espontânea e optogenetically arrastado theta. Abaixo o ritmo correspondente LFP hippocampal durante espontânea (esquerda) e entranhado theta (à direita). (D) fase de descarga preferenciais dos interneurônios do rápido-fogo não foi diferente durante espontânea (em preto) e optogenetically arrastado (em azul, n = 28 neurônios) theta (p = 0,97). Auto-correlogram média é mostrado à esquerda. Células de oriens Str. auto-correlogram média (E). (F) fase de descarga preferenciais dos interneurônios de oriens Str. não foi diferente durante espontâneo (preto) e optogenetically arrastado (azul, n = 10 neurônios) theta (p = 0,56). Histogramas de descarga preferencial fases são mostradas à direita. Taxas de queima média (G) não foram afetadas pelo arrastamento de theta em células piramidais (p = 0,98), rápido-fogo interneurônios (p = 0,96) ou interneurônios de oriens Str. (p = 0,85). Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: combinação de theta hippocampal arrastamento e optogenetic inibição do hipocampo subcortical de saída através da LS. (A) eNpHR3.0 (halorhodopsin) foi expressa em células piramidais hippocampal (regime superior). Expressão de sucesso da construção foi confirmada por fluorescência em somata no hipocampo (imagens superiores) e axônios no LS (imagens inferiores). Fibras ópticas foram implantadas bilateralmente acima o LS (regime inferior). Barras de escala: 500 µm (imagens à esquerda), 50 µm (imagens à direita). (B) theta Hippocampal é arrastado com êxito durante a inibição do hipocampo a via de LS. Densidade espectral de poder para estimulação de luz azul 9 Hz durante a inibição de saída são aqui mostrados. (C) inibição da via de saída subcortical hippocampal principais impede os efeitos de arrastamento de theta hippocampal na velocidade. Aqui mostrado é a diminuição na variabilidade de velocidade em cima de arrastamento de optogenetic (branco barra com fronteiras azuis), com está ausente mediante inibição simultânea do hipocampo a via LS (barra amarela com bordas azuis). Velocidade de base média respectivos é mostrada à esquerda. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.