Summary
Verfügbarkeit von somatischen SCs ist entscheidend für die regenerative Medizin Krankheit Modellierung und Einblick in SC Eigenschaften. Hier präsentieren wir experimentelle Strategien reprogram, in Vitro unterscheiden sich adulte Zellen in ihre entsprechenden erweiterbar gewebespezifische Stammzellen/Progenitor-Zellen durch die transiente Expression die transkriptionelle Coaktivator YAP.
Abstract
Hier präsentieren wir Protokolle, um primäre differenzierte Zellen und drehen Sie sie in Stamm/Vorläuferzellen (SCs) derselben Linie durch transiente Expression des Transkriptionsfaktors YAP zu isolieren. Mit dieser Methode werden luminalen differenzierte (LD) Zellen der Brustdrüse Maus in Zellen umgewandelt, die molekulare und funktionelle Eigenschaften von Mamma SCs. YAP auch Kurven voll differenzierte exokrinen Pankreaszellen in Pankreas Rohr-ähnliche aufweisen Stammväter. In ähnlicher Weise an endogenen, natürlichen SCs, YAP-induzierten Stammzellen-ähnliche Zellen ("ySCs") schließlich als organoide Kulturen langfristig in-vitro- ohne weitere Notwendigkeit ektopische YAP/taz, erweiterbar wie ySCs mit einem Erbbaurecht selbst erneuernde SC-ähnlichen Zustand ausgestattet sind.
Die Neuprogrammierung Verfahren hier vorgestellten bietet die Möglichkeit zu generieren und in-vitro- Vorläuferzellen der verschiedenen Gewebe Quellen ausgehend von differenzierten Zellen zu erweitern. Die einfache Erweiterung der somatischen Zellen ex Vivo hat Folgen für regenerative Medizin, Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und im Allgemeinen für Zell- und Entwicklungsbiologie Studien.
Introduction
Gewebe-spezifische somatische Stammzellen (SCs) sind entscheidend für Gewebe Erneuerung und Reparatur nach Verletzung. Die Möglichkeit, leicht isolieren und unbegrenzt erweitern Ex Vivo somatische SCs stellt ein schwerwiegendes Problem für potenzielle regenerative Therapien sowie für SC-Anwendungen in der Grundlagenforschung und Krankheit Modellierung. Fortschritte in dieser Richtung wurde jedoch durch die Schwierigkeit der Erfassung des SC-Zustand der verschiedenen epithelialen Organe in Vitrobegrenzt. In der Tat in mehreren adulten Geweben resident SCs können nicht vorhanden oder nicht verfügbar sein, oder ihre Anzahl und regenerative Potenzial können durch Alterung oder Krankheit Bedingungen erodiert. Im Jahr 2016 haben wir begonnen, diese Lücke durch die Berichterstattung dieser Ausdruck einer einzigen transcriptional Coactivator YAP (ja-assoziierten Protein) oder die eng verwandten Protein TAZ (transcriptional Aktivator mit einem PDZ-Motiv), unheilbar differenzierte Zellen effizient schafft funktionale, erweiterbar, nicht tumorigenic, autologe Zell-Populationen, die operativ und Molekular von ihren entsprechenden gewebespezifischen SCs1zu unterscheiden sind. Ein Puls von getragen YAP oder TAZ Aktivität für einige Tage ist ausreichend, um das Aussehen der selbst erneuern somatische SCs zu induzieren. Dies ist ein stabiler Zustand, der nicht mehr kontinuierliche Transgene Ausdruck abhängig ist, wie es durch Zelle Generationen ohne weitere Ausdruck ektopische YAP/TAZ1übertragen werden kann. Das Protokoll hier vorgestellten Einzelheiten des Verfahrens Erzeugung von de Novo epithelialen Stammzellen/Vorläuferzellen der Brustdrüse und der Bauchspeicheldrüse zur, differenzierte Zellen dieser Gewebe ab. Diese Prozedur füllt eine Black Box in der aktuellen Neuprogrammierung/Transdifferenzierung Arena. Große Anstrengungen in diese Richtungen haben in der Tat bisher zentriert auf Zelle Übergang zu einem induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) Zustand, gefolgt von der Umwandlung von diesen embryonalen und pluripotenten SCs in differenzierter Zellen. Allerdings sind iPSCs tumorigenic einmal in adulten Geweben, heben die Notwendigkeit der Entwicklung von Protokollen für ihre vollständige und effiziente Differenzierung2eingeführt. Jedoch kommt diese Differenzierung Schritt, auch wenn möglich, zum Preis von langfristigen Erweiterbarkeit, Selbstorganisation und Orgel Wiederbesiedlung Potenziale. Das sind wesentliche Attribute für Organregeneration, die in der Tat nur der endogenen gewebespezifischen SCs und der derzeit beschriebenen YAP-induzierte SCs (ySCs) typisch sind. In ähnlicher Weise differenzierte direkte Transdifferenzierung von einem Zelltyp ineinander mit Cocktails aus verschiedenen Transkription Faktoren auch erzeugen Zellen, die wesentliche proliferative und Stemness mögliche3fehlt.
Das hier beschriebene Verfahren nutzt auch die kürzlich eingeführte organoide Technologie, durch die endogene SCs erweiterbar und ex Vivo4differenziert. YAP-induzierte SCs können organoide Formen SCs sogar im Versuchsbedingungen, biologische oder Krankheit generieren in denen endogenen SCs nicht vorhanden sind. Wir möchten beachten, dass sich die Differenz mit anderen Neuprogrammierung Verfahren, die Art der Zelle Plastizität durch YAP vermittelt die einzige Form der Rückfall in eine SC-Status wie entsprechen kann, die in lebendes Gewebe auftritt. Rückgewinnung von SC-ähnlichen Merkmalen wurde Gewebereparatur oder Onkogene Aktivierung5zugeordnet. Obwohl entbehrlich für die Homöostase von mehreren adulten Geweben sind YAP und/oder TAZ absolut notwendig für Regeneration, Tumorwachstum und Erweiterung der somatischen SCs in Vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Protocol
Alle tierische Verfahren wurden durchgeführt, die Einhaltung unserer Richtlinien und von OPBA und das Gesundheitsministerium genehmigt
1. Generation von YAP-induzierte Milch-Stem-ähnliche Zellen (yMaSCs)
Hinweis: Alle Medien und Lösung Kompositionen für Abschnitt 1 sind in Tabelle 1angegeben.
- Isolierung der primären Mamma Zellpopulationen
- Unter einer Zelle Kultur Kapuze vorbereiten: Einweg-Skalpelle, Hyaluronidase Lösung, Dissoziation Medium, hämolytische Lösung, Sortierung Lösung, Kollagen, wasche ich Beschichtung Lösung, Ca2 + Komplexbildner Lösung, waschen Medium #1, mittlere #2, Dispase Lösung, Mamma 2D Kulturmedium, Eis kalt HBSS/PS.
- Für ein typisches Experiment Opfern Sie 10 weibliche Mäusen (oder CD-1 Stamm C57BL/6), 8-12 Wochen alt durch zervikale Dislokation. Den Bauch mit reichlich 70 % Ethanol-Lösung vor der Präparation zu sterilisieren.
- Die Brustdrüsen durch einen y-förmigen Schnitt entlang der Bauchhaut und sorgfältig trennt die Drüsen das Peritoneum durch leichtes Ziehen mit Dumont Pinzetten zu sezieren. Legen Sie sezierten Drüsen in einen nicht-Zelle selbstklebende Teller mit 10 mL Eis kalt HBSS/PS (20 Drüsen für jedes Gericht), und achten Sie nicht auf jede Haut Fragment übertragen.
- Waschen Sie unter einer Gewebekultur-Haube jede Drüse in 10 mL frisches HBSS/PS einmal und legen Sie sie in eine leere-Zell Klebstoff Gericht (20 Drüsen für jedes Gericht). Gewebekultur Platten nicht verwenden, da Zellen neigen dazu, an ihnen kleben verursachen erheblichen Verlust des Materials.
- Hacken Sie fein die Milchdrüsen mit Skalpell, bis eine homogene Mischung aus 1 mm3 Fragmente erhalten wird. Erholen Sie das Hackfleisch / Gewebe von jedem Gericht in 10 mL Dissoziation Medium mit einer serologischen 25 mL-Pipette zu vermeiden, Verstopfung und übertragen die Suspension in einem 50 mL konische Röhrchen pipettieren von mindestens 5 X, um Gewebe Klumpen disaggregieren.
Hinweis: Für eine effiziente Verdauung ist richtige Zerkleinerung des Gewebes im Schritt 1.1.5 entscheidend. - Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit kontinuierlichen kräftig schütteln. Überprüfen Sie nach 1 h die homogenisierte und verlängern Sie Inkubation von 10 min zu, wenn Klumpen noch vorhanden sind. Spin-down das verdaute Gewebe bei 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand verwerfen. Aufschwemmen der Gewebe-Pellets in 3 mL hämolytische Lösung und inkubieren Sie 3 min auf Eis.
Hinweis: Hämolyse ist eine ziemlich harte Behandlung so strengen Timing entscheidend bei diesem Schritt ist. - Zellen mit 10 mL waschen Medium #1 waschen, spin-down das verdaute Gewebe bei 400 X g für 5 min und den überstand verwerfen. Das Gewebe Pellet in 10 mL waschen Medium # 2 und Platte in 10 cm Gewebekultur Gerichte aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Gerichte für 1 h bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator.
Hinweis: Dieser Schritt die Mehrheit der Fibroblasten, ermöglicht es, die an der Kulturschale halten sollte. - Wiederherstellen der Zellsuspension vom Geschirr und Gießen Sie in ein 50 mL konische Röhrchen. 400 X g für 5 min drehen und den überstand zu beseitigen. Waschen Sie das Pellet zweimal in 10 mL der Ca2 + chelatisierenden Lösung durch Drehen nach unten bei 400 X g für 5 min jedes Mal. Aufschwemmen das Pellet in 0,25 % 5 mL Trypsin/EDTA und 5 min bei 37 ° c inkubieren
- 5 mL Dispase-Lösung auf der Oberseite die Trypsin-Lösung hinzugeben und ergänzen mit DNase ich 1μg/mL. Pipette nach oben und unten mindestens 5 X durch eine 1 mL-Spitze zu disaggregieren DNA Klumpen und 10 min bei 37 ° C, schütteln alle 3 min inkubieren.
- Fügen Sie 10 mL Medium Wash #2 und Filter in einem neuen 50 mL konische Rohr durch ein 40 μm Zelle Sieb. Spin-down der Zellsuspension bei 400 X g für 5 min und entsorgen des Überstands, achten Sie darauf, die Flüssigkeit zu beseitigen.
- Reinigung von Mamma Epithelzellen durch FACS
- Vorbereiten den Antikörper-Mix durch Zugabe von 10 μl Lin (Maus Linie Antikörper cocktail), 12 μL Anti-CD326 (Ep-CAM), um eine Endkonzentration von 30 ng/mL, 10 μl Anti-CD49f, um eine Endkonzentration von 25 ng/mL, 10 μl Anti-CD61, um eine Endkonzentration von 10 ng/mL , 2,5 μL Anti-CD29, um eine Endkonzentration von 2,5 ng/mL.
Hinweis: von diesem Schritt für Schritt 1.3, betreiben Sie in der Dunkelheit, um zu vermeiden, Bleichen von eindringmittel beschriftete Antikörper. Für jedes Pellet: - Halten Sie eine kleine Anzahl von Zellen (durch Eintauchen einen 100 μL Tipp im Pellet) in einem separaten Rohr. Aufschwemmen der Zellen in 500 μl Lösung in ein FACS-Rohr zu sortieren und halten Sie auf dem Eis als unbeschriftete Probe für das FACS-Verfahren.
- Aufschwemmen jedes Pellet in 200 μl waschen Medium #1, 44,5 μL des Antikörper-Mix hinzufügen, pipette gründlich und 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in 10 mL waschen Medium #1, spin-down bei 400 X g für 5 min und den überstand verwerfen.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Lösung Sortierung und Filter durch ein GAP-Sieb FACS Tubeand fahren Sie mit FACS-Trennung von der Zell-Populationen (wie in Abbildung 1 b). Stellen Sie bevor Sie die mehrfarbige FACS-Protokoll durchführen sicher, das mögliche Übergreifen der einzelnen Fluorochrom in jedes der anderen zu korrigieren. Um dies zu tun, jeder Fluorophor-konjugierten Antikörper separat mit der Zellsuspension brüten und Messwerte spektrale Überlappung für alle Fluorophore und alle Melder über einfarbige Kontrollen, um eine vergütungsmatrix zu schaffen.
Hinweis: In diesem Experiment arbeitete Sortierer mit 85 μm Düse ausgestattet. Eine typische Vorbereitung von 10 weiblichen Mäusen erbringt rund 800.000 LD Zellen. Fahren Sie mit sekundären Filtration, wenn Klumpen während FACS Verfahrens bilden.
- Vorbereiten den Antikörper-Mix durch Zugabe von 10 μl Lin (Maus Linie Antikörper cocktail), 12 μL Anti-CD326 (Ep-CAM), um eine Endkonzentration von 30 ng/mL, 10 μl Anti-CD49f, um eine Endkonzentration von 25 ng/mL, 10 μl Anti-CD61, um eine Endkonzentration von 10 ng/mL , 2,5 μL Anti-CD29, um eine Endkonzentration von 2,5 ng/mL.
- Aussaat von primären Mamma LD-Zellen
- Während FACS Verfahren Beschichten Sie eine Multi-gut Gewebekultur-Platte mit Kollagen ich Beschichtung Lösung. 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator inkubieren. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie waschen Medium #1 kurz vor der Beschichtung.
- Waschen Sie Zellen von FACS-Verfahren mit 10 mL Waschlösung #1 erholt, spin-down 400 X g für 5 min und beseitigen überstand. Aufschwemmen der Zelle Pellet in Mamma 2D Kulturmedium (500 µL/Well) und Kollagen behandelt. Lassen Sie die Zellen sitzen in einer Zelle Kultur Inkubator für 48 h, um korrekte Zellhaftung und Verbreitung zu ermöglichen.
Hinweis: Für eine typische Sortierung von 10 weiblichen Mäusen ergibt 6-8 Brunnen von einer 24-Well-Multi-well-Platte eine optimale Zelldichte (100 000 Zellen/na).
- Induktion von yMaSCs (YAP-induzierte Mamma Stem Cells)
Hinweis: Von diesem Schritt vorwärts, sollten alle Verfahren BSL-2 Bedingungen durchgeführt werden.- Bereiten Sie Mamma Kolonie Medium. Fügen Sie die Basalmembran Matrix frisch das Medium nur vor der Aussaat der Zelle hinzu.
- Transduzieren Sie für die Induktion von YAP-induzierte Mamma Stammzellen (yMaSCs) die primäre LD-Zellen durch Lentivirale Infektion durch das Mischen von 1 Volumenteil FUdeltaGW RtTA virale überstand, 1 Volumenteil FUW TetO YAP (oder TAZ) überstand, mit zwei Bänden der serumfreien Milch- 2D Kulturmedium 2 X Konzentrationen von ergänzt, in einem Gesamtvolumen von 500 mL. Inkubieren Sie Zellen mit Lentivirale Überstände für 48 h. Eine typische Lentivirale Zubereitung entnehmen Sie bitte der Online-Protokoll22.
- Nach der Infektion adhärente Zellen zu waschen und behandeln mit Mamma 2D Kulturmedium mit 2 µg/mL Doxycyclin induzieren exogene YAP (oder TAZ) Genexpression ergänzt. Verwenden Sie Zellen mit leeren, EGFP oder YAPS94A mit dem Ausdruck ihrer Vektoren oder induzierbaren YAP (oder TAZ) Vektoren, infizierte Zellen infiziert aber Links ohne Doxycyclin als Negativkontrollen.
Hinweis: Erfolgreiche Infektion kann durch qRT-PCR mit Primer spezifisch für Mensch YAP Transgen, wie zuvor beschrieben1validiert werden. - Nach 7 Tagen der Induktion mit Doxycyclin, adhärente Zellen durch Inkubation mit 0,05 % abnehmen Trypsin/EDTA (150 μl/Well) für 10 min bei 37 ° C; Trypsinization durch Verdünnung 1:5 in Waschanlagen Medium #2 (600 μl/Well) zu stoppen und Zellen zu zählen. Aufzuwirbeln Sie Zellen im Mamma Kolonie Medium (1 mL für jede Vertiefung), ergänzt mit 2 μg/mL Doxycyclin und Saatgut bei einer klonogenen Dichte von 1.000 Zellen/Brunnen in 24 Wohlen Frequenzverschiebungen anbauplatten.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Mamma Kolonie Medium eiskalt zum Zeitpunkt der Basalmembran Matrix zusätzlich. Die Basalmembran Matrix muss immer bei-20 ° C bei der Ankunft gespeichert und langsam bei 4 ° C über Nacht aufgetaut werden; einmal aufgetaut, muss immer auf dem Eis nach Richtlinien des Herstellers behandelt werden. - Einmal YAP-mit dem Ausdruck LD Zellen beginnen vermehren und wachsen als MaSC-ähnliche Kolonien in der Schwebe (yMaSC Kolonien) (14 Tage nach der Aussaat), zählen und verarbeiten für weitere Analysen (Abbildung 1).
Hinweis: Negativkontrolle Zellen (wie in Punkt 1.4.3) bleibt als Einzelzellen. - Die Kultur mit frischen Milch-Kolonie Medium alle 72 h in den 14 Tagen der yMaSC koloniewachstum aufzufüllen; dazu bereiten Sie einen aliquoten Mamma Kolonie Medium ohne 5 % Basalmembran Matrix, ergänzt mit 10 X-Konzentration von Ergänzungen und fügen 01:10 am Gesamtvolumen in jede Vertiefung (z.B. 100 μl in 1 mL total Medium), übermäßige Verdünnung zu vermeiden die Matrix-Federung.
- Sub-Kultivierung von yMaSCs
- Wiederherstellen der primären Kolonien vom Mamma Kolonie Medium, dann distanzieren und reseed.
Hinweis: yMaSC Kolonien von YAP umprogrammiert LD Zellen abgeleitet Selbsterneuerung Kapazität zu erwerben und können erfolgreich Sub kultivierten ohne weitere Doxycyclin Administration (dh, unabhängig von der Ausdruck der transgenen YAP/TAZ). - Bereiten Sie vor, unter einer Zelle Kultur Haube, Mamma Kolonie wie in Schritt 1.4.1 und Mamma organoide Medium.
- Jede Probe zu sammeln und in die überschüssige Menge Eis (10:1) inkubieren kalt HBSS 1 h auf dem Eis, um die Basalmembran Matrix lösen. Waschen Sie Kolonien 3 X durch Zentrifugieren bei 180 X g für 5 min und Aufschwemmen im Eis kalt HBSS. Inkubieren Sie Kolonien in 0,05 % Trypsin/EDTA für 10 min bei 37 ° C, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Pipette Kolonien nach oben und unten 10 X mit p1000 Spitze um vollständige Dissoziation Einzelzelle Niveau zu gewährleisten.
- Graf und Reseed Zellen im Mamma Kolonie Medium (1 mL für jede Vertiefung) ohne Doxycyclin bei einer klonogenen Dichte von 1.000 Zellen/Brunnen in 24 Wohlen Frequenzverschiebungen anbauplatten. Wiederholen Sie diesen Vorgang passagierung Verfahren alle 10-14 Tage um Selbsterneuerung zu beurteilen.
- Vor dem dritten Durchgang Durchgang yMaSC Kolonien in organoide Kulturbedingungen, yMaSC Erweiterung zu verbessern und für die Bildung von Mini-Drüsen, ermöglichen, die selbst in einem bilayered Epithel eng erinnert der Brustdrüse in Vivo zu organisieren histologischen Organisation.
- Erholen Sie Kolonien von Mamma Kolonie Medium wie in Schritt 1.5.3, 1.5.4. Aufschwemmen Kolonien in 100 % Wachstumsfaktor reduziert die Basalmembran Matrix, erwägt, ein Maximum von 20-25 Kolonien für jedes gut von einer 24-Well Frequenzverschiebungen Befestigungsplatte in 150 µL der Matrix replate.
- Inkubieren Sie die Platten in eine Zelle-Kultur-Inkubator für 40 min bei 37 ° C und lassen Sie die Basalmembran Matrix verfestigen und dann überlagern die Gele mit 500 μL des Mediums Mamma organoide.
- Suchen Sie nach ein paar Tagen die Bildung von Kolonien zu bilden angehende Organellen (Abbildung 1E).
- Nach 10-14 Tage, Passage oder Prozess der Organellen zur weiteren Analyse.
- Durchgang Organellen Kulturen, Organellen wiederherstellen, indem Sie jede Probe sammeln und Inkubation in überschüssige Menge (10:1) Eis kalt HBSS 1 h auf dem Eis, um die Basalmembran Matrix lösen. Waschen Sie Organellen 3 X durch Drehung nach unten 180 X g für 5 min und Aufschwemmen im Eis kalt HBSS.
- Inkubieren Sie Organellen in 0,05 % Trypsin/EDTA für 10 min bei 37 ° C, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Pipette Organellen nach oben und unten 10 X mit p1000 Spitze um vollständige Dissoziation Einzelzelle Niveau zu gewährleisten.
- Reseed als einzelne Zelle Suspension in einem Tropfen 100 % Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembran Matrix (150 μL für jedes gut von einer 24-Well Frequenzverschiebungen Befestigungsplatte). Lassen Sie die Basalmembran Matrix bilden eine Gel von 40 min bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Brutkasten Ausbrüten und die Gele mit 500 μL des Mediums Mamma organoide zu überlagern.
Hinweis: yMaSC Organellen können kryokonserviert werden, durch die Rückgewinnung von 100 % Basalmembran Matrix Kultur wie in Schritt 1.5.13, Trypsinization zu vermeiden. Speichern Sie im Mamma organoide Medium mit 10 % DMSO ergänzt. - Schnell die yMaSC Organellen bei-80 ° C eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
- Wiederherstellen der primären Kolonien vom Mamma Kolonie Medium, dann distanzieren und reseed.
2. Generation der yDucts
Hinweis: Alle Medien und Lösung Kompositionen für Abschnitt 2 sind in Tabelle 2angegeben.
- Isolierung der primären pankreatischen Azini
- Legen Sie Dissektion Pinzetten und Scheren in 70 % EtOH und bereiten unter einer Haube acinar Kultur Zellkulturmedium, 15 mL für jede Maus; acinar rettungsmediums, 60 mL für jede Maus; PBS/PS; Stammlösung Kollagenase ich; Kollagenase ich Lösung A, 15 mL für jede Maus; neutralisiert Rattenschwanz Kollagen ich Lösung. Ratte Schweif Kollagen zu neutralisieren ich auf pH = 7, indem zuerst mit 0,1 N NaOH Puffer Essigsäure, in denen das Kollagen aufgelöst wird, und dann mit 10N HCl. verdünnt bis 2,5 mg/mL in PBS/PS. halten die Ratte Tail Kollagen ich und alle Reagenzien auf Eis, es zu neutralisieren. 6 bis 9 Wochen alten Mäusen des richtigen Genotyps zu opfern.
- Legen Sie jede Maus auf den Rücken, und waschen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol-Lösung. Machen Sie einen längs-Schnitt entlang der Bauchwand. Lokalisieren und sezieren die Bauchspeicheldrüse (mithilfe der Milz als Leitfaden) und legen Sie sie in einem 10 cm-Zell Klebstoff Teller in 10 mL Eis kaltem PBS/PS. übertragen das Geschirr sofort unter einer Zelle-Kultur-Haube. Arbeiten Sie von diesem Schritt ab immer unter einer Zelle-Kultur-Haube.
- Jede Bauchspeicheldrüse in einer neuen nicht-Zelle übertragen Klebstoff Gericht zuvor gefüllt mit 7 mL Kollagenase ich Lösung A.
- Schnell Hackfleisch jeder Pankreas mit ein paar Einweg-Skalpelle, um eine homogene Gewebe Suspension von etwa 1 mm3 Fragmente zu erhalten.
Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Vorgang nicht mehr als 2 min für optimale Zellviabilität dauern sollte. - Inkubieren Sie die Mahlzeit für Kollagenase Verdauung bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator für 10 min schütteln alle 3 min um homogene Gewebe Verdauung zu gewährleisten.
- Wiederherstellen der verdauten Gewebes in einem 50 mL konische Röhrchen (eine für jede Bauchspeicheldrüse), waschen Sie die Schale mit 10 mL Acinar Wash Medium und legen Sie sie in das gleiche 50 mL konische Rohr, pipettieren verdaut Gewebe nach oben und unten nicht mehr als 3 X.
- Spin-down das verdaute Gewebe für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen.
Hinweis: Spin-down der Zellen bei 18 ° C, Kollagenase-Aktivität während dieses Schrittes zu senken. - Aufschwemmen des Gewebes pellet in 7 mL Kollagenase ich Lösung A und Gießen Sie diese Lösung in eine neue 10 cm-Zell Klebstoff Teller.
- Inkubieren Sie das Gericht für eine zweite Runde von Kollagenase Verdauung bei 37 ° C für 10 min wie in Schritt 2.1.5, schütteln alle 3 min um homogene Gewebe Verdauung zu gewährleisten. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine saubere 50 mL konische Röhre für jede Bauchspeicheldrüse, gekrönt mit einem 100 μm Zelle Sieb.
- Erholen Sie das verdaute Gewebe und durch das Sieb 100 μm Zelle vorbei Einmaischen das Gewebe mit einem sterilen 10 mL Spritzenkolben (achten Sie darauf, drücken vorsichtig auf das Gewebe, Vermeidung von Scherkräften tangential an die Sieb-Oberfläche). Die Schale mit 10 mL Medium acinar Wäsche zu waschen, und diese 10 mL durch die gleichen 100 μm Zelle Sieb passieren.
- Spin-down das verdaute Gewebe für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen.
- Das Gewebe Pellet mit 10 mL acinar waschen Medium zu erholen. Die Zelle-Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen bereits mit zusätzlichen 10 mL frisches acinar waschen Medium, Vermeidung von übermäßigen pipettieren für Wiederfreisetzung des Pellet-zu übertragen.
- Spin-down das verdaute Gewebe für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen.
- Sorgfältig Aufschwemmen Sie das verdaute Gewebe in 6 mL acinar rettungsmediums und verteilen sie in 2 Brunnen 6-Well Multi gut Gewebekultur Platte, 3 mL. Beurteilen Sie unter einem Stereomikroskop sorgfältig die Qualität der acinar Isolation, die als eine homogene Suspension acinar Cluster mit einem kleineren Anteil einzelner Zellen angezeigt werden (siehe Abb. 2 b); Entfernen Sie alle großen Gewebe Klumpen schließlich präsentieren (in der Regel auch mit dem bloßen Auge sichtbar), durch pipettieren sie aus der Lösung.
- Aussaat von primären pankreatischen Azini
- Inkubieren Sie die verdaute acinar Cluster bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator für 2 h, um die Zelle Erholung zu ermöglichen.
- Während der Zelle Erholung Mantel 48-Well Multi Brunnen mit 100 μL der neutralisierten Ratte Tail Kollagen ich und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator ermöglicht eine Hydrogel-Kissen zu bilden.
- Nach 2 h der Zelle Erholung sammeln acinar Zellsuspension in einem konischen Rohr, spin-down für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen.
- Aufschwemmen der Azini in das entsprechende Volumen der acinar Kulturmedium (150 μl für jede Vertiefung einer 48 gut Gewebekultur-Platte). Jeder Samen getrennt Bauchspeicheldrüse in 16 Vertiefungen, eine optimale Dichte (100-120 acinar Cluster/Brunnen) zu erhalten.
- Verdünnen Sie diese acinar Suspension mit ein gleiches Volumen von neutralisierten Ratte Schweif Kollagen ich Lösung, Rohre auf dem Eis zu halten. Vorsichtig umrühren und schnell Samen der Zellsuspension auf der Kollagen-Kissen in 2.2.2 (300 μL für jede Vertiefung einer 48 gut Multi gut Gewebekultur Platte) beschrieben.
- Inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator ermöglicht ein Hydrogel zu bilden.
- Induktion der pankreatischen Organellen
- Überlagern Sie Kollagen Hydrogele mit 500 μL Acinar Kulturmedium mit 2 μg/ml Doxycyclin YAP-abhängige Induktion von Pankreas Organellen von R26-rtTAM2 ergänzt; TetO-YAPS127A Mäuse; Negativkontrollen sind von wt -Zellen kultiviert in der gleichen Bedingungen oder R26-rtTAM2 zur Verfügung gestellt; TetO-YAPS127A Zellen, die in Abwesenheit von Doxycyclin kultiviert.
- Kultur acinar Zellen in Acinar Kulturmedium ergänzt für 5-7 Tage erfrischende Kulturmedium (300 μl/Well) alle 48 Std. und nach organoide Bildung durch morphologische Veränderungen in Richtung Zyste bilden duktale-ähnliche Strukturen ( mit 2 μg/mL Doxycyclin. Abbildung 2). Sobald Organellen gebildet werden, können Zellen passagiert im Pankreas organoide Kulturbedingungen oder geerntet für weitere Analysen (z.B.: RNA-Extraktion, Immunfluoreszenz).
- Sub-Kultivierung des Pankreas Organellen
- Um ihre Selbsterneuerung Fähigkeit zu beurteilen, klonal passage YAP-induzierte Pankreas Organellen (yDucts) in dreidimensionale Basalmembran Matrix Hydrogele (Pankreas organoide Kulturbedingungen) unabhängig von exogenen YAP/TAZ Versorgung (i.e. unabhängig von Doxycyclin Verwaltung).
- Vorbereiten von Trypsin 0,05%/EDTA; 100 % Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembran Matrix; Pankreas organoide Medium und Kollagenase ich Lösung B.
- Bereiten Sie eine 15 mL konische Rohr mit 4 mL Collagenase ich Lösung B für jedes gut zu passagiert werden.
- Verwerfen Sie Kulturmedium zu, sorgfältig extrahieren Sie Hydrogele aus den Vertiefungen durch sanftes Absaugen und übertragen Sie sie auf den konischen Rohren.
- Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 30 min, mit kontinuierlichen kräftig schütteln um vollständige Verdauung von Kollagen-Matrix (überprüfen Sie alle 10 Minuten bis das Hydrogel komplett solubilisiert ist) zu ermöglichen. Spin-down wiederhergestellten Zellen bei 750 X g für 2 min und überstand zu entfernen.
- Inkubieren Sie wiederhergestellte Zellen in 1 mL Trypsin 0,05%/EDTA für 10 min bei 37 ° C, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Verdünnen Sie Trypsin mit 9 mL PBS 1 X, spin-down bei 750 X g für 2 min und überstand zu entfernen.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in Eis kalt Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembran Matrix und Samen in ultra-niedrigen anbauplatten (in der Regel einen Tropfen 150 μL in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte).
- Lassen Sie die Basalmembran Matrix Hydrogel festigen, indem die Platten in eine Zelle Kultur Inkubator 40 min bei 37 ° C inkubieren und dann überlagern mit pankreatischen organoide Medium (500 μL für jede Vertiefung). yDucts wächst als zystenartigen Organellen in 7-10 Tagen (Abb. 2D).
- Für weitere passagierung Organellen aus Basalmembran Matrix durch Inkubation in Eis kaltem PBS 1 entfernt werden kann x für 30 min, gefolgt durch Waschen 3 mal drehen nach unten 180 X g für 5 min und Wiederfreisetzung in Eis kaltem PBS 1 X Matrix Verschleppung zu vermeiden. Organellen sind dann getrennt mit Trypsin 0,05 % für 10 min eine Einzelzellen-Suspension zu erhalten und in frischen Basalmembran Matrix nachgesät und dann überlagert mit pankreatischen organoide Medium (wie 2.4.7-2.4.8).
- yDuct Organellen können in flüssigem Stickstoff kryokonserviert werden, durch die Rückgewinnung von 100 % Basalmembran Matrix Kultur wie in Schritt 2.4.9, Vermeidung von Trypsinization, und speichern in Pankreas organoide Medium mit 10 % DMSO ergänzt.
- yDuct Organellen sind schnell bei-80 ° c eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Representative Results
Generation von yMaSCs
Ein Überblick über die experimentelle Strategie zur primäre Mamma LD-Zellen durch transiente Expression von YAP zu programmieren ist in Figur 1Apräsentiert. Primäre Mamma LD Epithelzellen sind durch Leuchtstofflampen-aktivierte Zelle Sortieren13gereinigt. Abbildung 1 b stellt eine typische Sortierung Prozedur zu drei unterschiedliche Subpopulationen: Basalzellen (EpCAMniedrigeCD49fhoheCD61–), luminalen Vorläuferzellen (LP) Zellen (EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61+ ) und LD-Zellen (EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61–). Vorsichtig sein, dass von den drei Subpopulationen gating ist unerlässlich um eine reine Herstellung von LD-Zellen zu isolieren, die vollständig unterscheiden sich und völlig Wachstum bei ausgesät in Brustdrüse koloniebildenden Bedingungen (siehe Abbildung 1, Links Panel) verhaftet. Umgekehrt, starten, wenn induziert, exogene YAP auszudrücken, LD Zellen vermehren um leicht erkennbar dichten epithelialen Kolonien in 5 % Basalmembran Matrix Suspensionskulturen (Abbildung 1) bilden. Die Effizienz der Neuprogrammierung, bezeugt rund 3 % für ein typisches experiment, kann durch zählen der Anzahl der Kolonien über die Anzahl der Einzelzellen, die ursprünglich in Basalmembran Matrix Suspensionskulturen (Abbildung 1) ausgesät gewertet. Umprogrammierten luminalen Zellen (yMaSCs) kann dann Übergang in 100 % Basalmembran Matrix organoide Kulturbedingungen (siehe Schema in Abbildung 1A), Self-organizing in komplexe organoide-ähnliche Strukturen, die um mehrere Lumen zu entwickeln und bemerkenswerte Selbsterneuerung Fähigkeit auch in Abwesenheit von Doxycyclin (d.h. in Abwesenheit von transgenen YAP Ausdruck) angezeigt (Abbildung 1E). Histologisch, yMaSC-abgeleitete Organellen zeigen eine basale Schicht (K14 positiv), mit Blick auf die Basalmembran Matrix rekonstituiert ECM und einer luminalen Schicht (K8 positiv), mit Blick auf die Lumen-Vertiefungen innerhalb der organoide (Abb. 1F). Diese Architektur ist zu unterscheiden von der Organellen durch native MaSCs (Abb. 1F) gebildet.
Generation von yDucts
Ein Überblick über die experimentelle Strategie zur primären pankreatischen Azini durch transiente Expression von YAP zu programmieren ist in Abbildung 2Apräsentiert. Gesamte acinar Cluster sind von den Großteil der Bauchspeicheldrüsen-Gewebe durch eine Kombination aus milden Dissoziation und Größe Ausgrenzung durch Filtrierung isoliert. Eine typische Zubereitung wird in Abbildung 2 bdargestellt. Nach Isolierung sollte die acinar zellcluster als Suspension der exokrinen acinar Einheiten der homogene Größe ohne Kontamination durch endokrine Langerhans Inseln oder Fragmente der pankreatischen duktalen Baum und minimale Dissoziation Einzelzellen angezeigt werden. Kontamination durch endokrine Inselchen oder duktale Fragmente ist ein Hinweis auf mangelhafte selektive Filterung (Schritt 2.1.10), möglicherweise durch raue Handhabung; unerwünschte Dissoziation von acinar Clustern einzelner Zellen möglicherweise aufgrund übermäßigen Kollagenase-Behandlung oder ungepufferter Aktivität der proteolytischen Enzymen durch das Gewebe, die durch zusätzliche SBTI Behandlung gebremst werden kann.
Ein typisches acinar Neuprogrammierung Experiment ist in Abbildung 2dargestellt. innerhalb von 5-7 Tagen Kultur in 3D Kollagen-ich Sitz Hydrogel in Anwesenheit von Doxycyclin, Pankreas Azini abgeleitet R26-rtTAM2/TetO-YAPS127A Mäuse leicht biegen Sie in Rohr-ähnliche Cluster (, den wir yDuctsgenannt), bestehend aus einer dünnen Monolage von epithelialen Zellen, die um eine expandierende zentralen Hohlraum zu vermehren. Die Neuprogrammierung Effizienz, die rund 70 % für ein typisches Experiment ist, kann leicht gemessen werden, erzielte die Anzahl der Rohr-ähnliche Cluster über die Gesamtzahl der kernigen Azini (Abb. 2D). Die Negativkontrolle Zellen, d. h. R26-rtTAM2 / + oder R26-rtTAM2/TetO-YAPS127A Zellen Links ohne Doxycyclin, unveränderlich bleiben als Post-mitotische acinar Cluster in diesen Kulturbedingungen, wie bereits berichtet1 ,14,15. Umprogrammierten yDucts kann dann auf der Ebene der einzelnen Zelle in Matrigel-basierte organoide Kultur Bedingungen16 passagiert werden (siehe Schema in Abbildung 2A), bemerkenswerte Selbsterneuerung Fähigkeit auch in Abwesenheit von Doxycyclin (d.h. anzeigen in Abwesenheit von transgenen YAP Ausdruck) (Abb. 2E).
Abbildung 1: Isolation von primären Mamma LD Zellen und Induktion von Mamma Stammzellen. (A) schematische Darstellung der Versuchsanordnung angenommen primäre Mamma LD Zellen umzuprogrammieren. (B) Vertreter FACS-Darstellungen zur Veranschaulichung einer typischen Sortierung Prozedur LD Zellen zu reinigen. (i) dissoziierte Zellen werden nach vorwärts und seitliche Streuung für lebende Zellen (P1; blau) angespritzt. (II) Bevölkerung P1 ist dann weiter nach Lin Profil eingezäunt: Subpopulation von Lineage-negativen Zellen (P2; grau) ausgewählt ist, ausgenommen Linie-positiven hämatopoetische Zellen; (III) Bevölkerung P2 wird dann in einer EpCAMhoch (P3; gelb + grün) und eineniedrige (P6; rot) Subpopulationen EpCAM getrennt; (IV) P3 und P6 werden dann weitere angespritzt entsprechend ihrer CD61/CD49f Profil in drei Untergruppen: EpCAMniedrigeCD49fhoheCD61– Basalzellen (P7; rot), EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61+ LP Zellen (P8; gelb) und EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61– LD Zellen (P9; grün). (C) Bilder sind Beispiele für die Fähigkeit der LD Zellen, infiziert mit dem angegebenen Konstrukten, Mamma Kolonien bilden 15 Tage nach der Aussaat in Mamma Kolonie Medium. Nur YAP exprimierenden Zellen wiederum in koloniebildenden Zellen, während negative Kontrolle (EGFP-infizierten) Zellen bleiben als Einzelzellen Wachstum verhaftet. Maßstabsleiste = 50 μm. (D) Quantifizierung der koloniebildenden Fähigkeit der angegebenen Zellen, wie in (C). Daten sind als Mittelwert + s.d. präsentiert und sind Vertreter von fünf unabhängigen Experimenten, jeweils mit sechs technischen repliziert. (E) repräsentatives Bild von YAP umprogrammiert Mamma Stammzell-ähnliche Zellen (yMaSCs) nach 12 Tagen in organoide Kulturbedingungen in frischen dreidimensionale 100 % Basalmembran Matrix Hydrogel in Ermangelung von Doxycyclin. Maßstabsleiste = 100 μm. (F) repräsentative Immunfluoreszenz Bilder für die basalen Marker K14 (grün) und der luminalen Marker K8 (rot) von Organellen abgeleitet aus den angegebenen Zellen nach 12 Tagen in organoide Kulturbedingungen. Maßstabsleiste = 10 μm. Diese Zahl wird von Panciera Et Al., 20161wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Isolierung des primären pankreatischen acinar Zellen und Induktion von Pankreas Vorfahren. (A) schematische Darstellung der Versuchsanordnung reprogram primäre acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse exokrine angenommen. (B) repräsentatives Bild der primären pankreatischen Azini kurz nach der Isolierung-Verfahren (Schritt 2.1.14). Die acinar Vorbereitung sollte als eine homogene Suspension acinar Cluster mit minimalen Präsenz einzelner Zellen erscheinen. Maßstabsleiste = 400 μm. (C) repräsentative Bilder von primären pankreatischen Azini abgeleitet R26-rtTAM2 (oberen Platten)oder R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A (untere Verkleidungen) Mäuse und kultiviert in 3-d-Kollagen ich-basierte Hydrogel für 5 Tage mit oder ohne Doxycyclin (Doxy), wie angegeben. Nur konvertieren primäre Azini YAP exprimierenden Zellen wachsen als zystenartigen organoide nach Doxycyclin Zugabe. Skalieren von Balken = 70 μm. (D) Quantifizierung der Fähigkeit der Bauchspeicheldrüse Azini duktale Organellen bei transgenen Überexpression von YAP wie in (C) bilden. Daten sind als Mittelwert + s.d. präsentiert und sind Vertreter von fünf unabhängigen Experimenten mit vier technischen repliziert. (E) repräsentatives Bild von YAP neuprogrammiert duktale-ähnliche Zellen (yDucts) nach drei Passagen in frischen dreidimensionale 100 % Basalmembran Matrix Hydrogel in Ermangelung von Doxycyclin. Maßstabsleiste = 130 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Isolation von primären Mamma Zellen | |
| Ca2 + chelatisierenden Lösung | Shop bei 4 ° C |
| EDTA | 0,02 % w/V |
| PBS | |
| Kollagen ich Beschichtung Lösung | |
| Essigsäure 0.02N, pH-Wert 3,23 | |
| Ratte Tail Kollagen (Beschichtung) | 01:50 |
| Dispase Lösung | Shop bei 4 ° C |
| Dispase | 5 mg/ml |
| PBS | |
| Dissoziation Medium | |
| DMEM:F12 | |
| Hyaluronidase-Stammlösung | 400 U/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Stammlösung Kollagenase ich | 600 U/mL |
| Hämolytische Lösung | Shop bei 4 ° C |
| NH4Cl-Lösung | 1 Teile |
| TrisBase 20,6 g/L | 9 Teile |
| pH-Wert auf 7,2 einstellen | |
| HBSS/PS | Shop bei 4 ° C |
| HBSS | |
| Pen/Strep | 2 x |
| Hyaluronidase-Stammlösung | 0,2 µm-Filter, bei 4 ° C lagern |
| Hyaluronidase aus bovine Hoden (Pulver) | 2.000 U/mL |
| Natriumphosphat-Puffer 1 M pH7.3 | |
| NH4Cl-Lösung | Bei T. Amb lagern. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7,1 g/L |
| Anpassen der pH-Wert auf 7,65 | |
| Sortierung der Lösung | 0,2 µm-Filter, bei 4 ° C lagern |
| BSA | 0,1 % |
| EDTA | 1 mM |
| HEPES pH 7 | 25 mM |
| PBS | |
| Waschen Sie Medium #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Waschen Sie Medium #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5 % |
| Pen/Strep | 1 x |
| Mamma 2D Kulturmedium | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2 % |
| Heparin | 4 mg/mL |
| L-Glutamin | 1 x |
| Murine bFGF | 10 ng/mL |
| Murine EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Induktion und Passaging von yMaSCs | |
| Mamma Kolonie Medium | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5 % |
| Heparin | 4 µg/mL |
| L-Glutamin | 1 x |
| Matrigel (fügen Sie unmittelbar vor der Aussaat) | 5 % |
| Murine bFGF | 20 ng/mL |
| Murine EGF | 10 ng/mL |
| Pen/Strep | 1 x |
| Mamma organoide Medium | |
| Erweiterte DMEM:F12 | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| Heparin | 4 µg/mL |
| HEPES | 1 x |
| menschlichen Birne | 100 ng/mL |
| Murine bEGF | 20 ng/mL |
| Murine EGF | 50 ng/mL |
| R-Spondin 1 | 1 µg/mL |
Tabelle 1: Generation von yMaSCs. Zusammensetzung aller verschiedenen Nährmedien und Lösungen für die Isolation von primären Mamma LD Zellen und Induktion von yMaSCs (Abschnitt 1)
| Isolierung der primären pankreatischen Azini | |
| Acinar Kulturmedium | |
| BPE | 50 µg/mL |
| BSA | 0,1 % |
| Dexamethason | 1 µg/mL |
| ABt | 0,1 % |
| ITS-X | 1 x |
| Pen/Strep | 1 x |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Waymouth Medium | |
| Acinar Wash Medium | |
| BSA | 0,1 % |
| Pen/Strep | 1 x |
| RPMI Medium | |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Acinar Rettungsmediums | |
| Acinar Kulturmedium | |
| ABt | 30 % |
| Kollagenase ich Lösung A | |
| Acinar Wash Medium | |
| Stammlösung Kollagenase ich | 360 U/mL |
| PBS/PS | Shop bei 4 ° C |
| PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) | |
| Pen/Strep | 1 x |
| Stammlösung Kollagenase ich | Shop bei-20 ° C |
| Kollagenase, Typ ich (Pulver) | 6.000 U/mL |
| PBS | |
| Der pankreatischen Organellen passagierung | |
| Kollagenase ich Lösung B | |
| PBS 1 X | |
| Stammlösung Kollagenase ich | 240 U/mL |
| Pankreas organoide Medium | |
| Erweiterte DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| Gastrin | 10 nM |
| menschliche FGF10 | 100 ng/mL |
| menschlichen Birne | 100 ng/mL |
| Murine EGF | 50 ng/ml |
| N-Acetylcystein | 1,25 mM |
| Nicotinamid | 10 mM |
| Pen/Strep | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 mg/mL |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
Tabelle 2: Generation von yDucts. Zusammensetzung aller verschiedenen Nährmedien und Lösungsvorschläge für die Isolierung von primären acinar Zellen und Induktion und passagierung der yDucts (Abschnitt 2).
Discussion
Hier präsentieren wir Protokolle, um ex-Vivo unheilbar differenzierten Epithelzellen der verschiedenen Geweben in ihre entsprechenden gewebespezifischen Vorläuferzellen (oder ySCs) umprogrammieren von Transienten Expression von YAP, wie bereits berichtet1. Wir haben zwei Verfahren detailliert: eine Reprogrammierung von FACS gereinigt durch Lentivirale Vektoren und eine zweite, die virale Infektion vermeidet und nutzt die Vorteile der transgenen YAP Ausdruck ermöglicht. Jedes Protokoll stellt eine effiziente Strategie zu isolieren und Kultur primären differenzierte Zellen und eine Strategie zur exogenen Kraft YAP Genexpression in differenzierten Zellen generieren de Novo gewebespezifischen erweiterbar gewebestammzellen (siehe Regelungen in Abbildungen 1A und 2A).
Wir bewiesen, dass die hier vorgestellten effektiv isoliert-Strategien eine reine Bevölkerung von differenzierten Zellen isolieren, wie durch die Tatsache bewiesen, dass wir nie irgendwelche Auswuchs von negativen Kontrollproben (Abbildungen 1 und 2 C) erkannt.
Die Lentivirale Vektoren verwendet in dieser Studie für die Reprogrammierung von primären Mamma LD sind Doxycyclin induzierbaren, bietet die Möglichkeit, eine strenge Kontrolle des Transgens Ausdrucks; Dadurch schalten und aus exogenen YAP Ausdruck zu werden. Besondere Aufmerksamkeit sollte in den Verzicht auf eine übermäßige virale Titer platziert werden, wie dies im Hinblick auf die Umprogrammierung Effizienz nachteilig sein kann. Im Falle der primären acinar Zellen wechselten wir in ein vollständig transgenen Ansatz zu einer YAP-abhängige Neuprogrammierung mit minimalen Manipulationen. Diese letztere Strategie eignet sich auch besonders für primäre pankreatischen Azini, wie isolierte acinar Cluster Lentivirale Infektion kaum zugänglich und sehr zerbrechlich sind. Die transgenen Strategie bietet den gleichen Vorteil von Doxycyclin-abhängige Lentivirale Vektoren für die strenge Kontrolle der Genexpression. Darüber hinaus trägt die transgenen Strategie ausgenutzt mit primären pankreatischen Azini den Vorteil einer wesentlich höheren Neuprogrammierung Wirkungsgrad im Vergleich zu der viral induzierten Reprogrammierung von Mamma LD. Über die verschiedenen intrinsischer Plastizität Zellen aus verschiedenen Geweben zugeordnet kann die höhere Rate der pankreatischen Neuprogrammierung von der höheren Effizienz der Ausdruck verbunden, einheitliche und autonome YAP Ausdruck in allen abgeleitet werden explantierten Zellen. Insbesondere haben wir gezeigt, dass exogene YAP nach der Generierung von ySCs (yMaSC-Kolonien und yDucts), entfällt ohne ihre Selbsterneuerung Kapazität. Und zwar deshalb, weil ySCs endogenen YAP/TAZ zu reaktivieren und nutzen sie für Selbsterneuerung1exogene YAP ausgeschaltet ist.
Wir validiert die Vorstellung, die ySCs in der Tat von differenzierten Zellen entstehen durch die Kontrolle der Zelle der Ursprung unserer Neuprogrammierung Experimente durch genetische Abstammung-Ablaufverfolgung Validierungen1.
Umfassende Charakterisierungvon ySCs zeigt, dass YAP-induzierte Umprogrammierung normale somatische SCs1 als ich erzeugt) auf der transkriptomischen Ebene anzeigen ySCs massive Überschneidungen mit native SCs; (II) ySCs Anzeige Differenzierungspotenzial und erzeugen eine multilineage Nachkommen immer beschränkt auf die Identität des ihr Gewebe des Ursprungs; (III) ySCs werden nicht verändert und nicht tumorigenic wann verpflanzt in Vivo.
Hier beschreiben wir auch Verfahren zu erhalten und zu erweitern in der Kultur yMaSCs und yDucts als Organellen in 100 % Basalmembran Matrix Hydrogele eingebettet. Diese Bedingungen ermöglichen für die Selbstorganisation des ySCs in dreidimensionale Organellen, die Stemness Eigenschaften Kultur langfristig zu gewährleisten, ermöglichen, diese zu erweitern Bevölkerung nach Belieben für nachgelagerte Analysen und Anwendungen stammen. Aus unbekannten Gründen wir Fehler beim Abrufen yMaSC Organellen indem man infiziert LD Zellen direkt in organoide Kulturbedingungen 7 Tage nach der Behandlung Doxycyclin in Kunststoff Gewebekultur Platte; in anderen Worten, ist der mittlere Wachstum Schritt in Mamma Kolonie Bedingungen unerlässlich. In unseren Händen erfordern auch native MaSCs Mamma Kolonie Bedingungen vor passagierung in organoide Kultur. Darüber hinaus wird die effizienteste organoide Auswuchs erreicht, wenn wir vermeiden, liegt die primäre Kolonien in einzelnen Zellen, sondern die intakten Kolonien in organoide Kulturbedingungen übertragen.
Organoide Kulturbedingungen tragen auch den Vorteil bietet die Möglichkeit, ySCs, Tiefgefrieren, vorausgesetzt, dass die Organellen aus ihrer Matrizen, Vermeidung von Zelle Dissoziation vor der Kryokonservierung in Stickstoff Bad zurückgewonnen werden.
Die YAP Umprogrammierung Verfahren vorgestellt kann verschiedene differenzierte Zelltypen abgeleitet aus verschiedenen Erwachsenen Geweben in ihren entsprechenden gewebespezifische Stammzellen (wir haben es mit Mamma, Pankreas und neuronalen Zellen getestet) umwandeln1. Im Unterschied zu iPSCs oder andere Neuprogrammierung Bemühungen können YAP/induzierte SCs die Erinnerungen an ihr Gewebe Herkunft pflegen. Der Hinweis de-Differenzierung der somatischen Zellen in Zellen mit Stiel-ähnliche Eigenschaften ausgestattet ist die einzige Form der Zelle Schicksal Plastizität und Umprogrammierung in vivo beobachtet, zum Beispiel nach Gewebeschäden und zur Unterstützung der Wundheilung5,17 , 18 , 19 , 20. es ist bemerkenswert, dass YAP und TAZ für normale Homöostase weitgehend entbehrlich sind aber entscheidend für die Reparatur von Gewebe in mehreren Geweben11,21. Konsequent mit einer physiologischen Funktion der Neuprogrammierung Schritte hier beschrieben, haben YAP/TAZ kürzlich gezeigt, dass im Darm Regeneration in Mausmodellen der Colitis ulcerosa Patienten geforderten verursacht eine Umwandlung von Erwachsenen Darmzellen in eine Reparatur von Epithel, die Funktionen des fetalen Darm19anzeigt. YAP Umprogrammierung erweitert somit die aktuellen induzierte Zelle Plastizität Strategien indem Sie ein Mittel zu generieren somatische Stammzellen, ein Staat, der bislang streitig gemacht, in Vitrozu erfassen. Dieser Ansatz, könnte wenn auch auf Menschen-abgeleitete Zellen erweitert haben breite Relevanz aus regenerativen Medizin Anwendungen zur Erforschung des somatischen Stemness Staates und ergeben sich für die Erweiterung der somatischen Zellen in Vitro.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken für das Geschenk von TetO-YAPS127A MäusenF. Camargo; R26-rtTAM2 Mäuse (Lager #006965) wurden von The Jackson Laboratory gekauft. Wir danken Chiara Frasson und Giuseppe Basso für Hilfe mit FACS-Verfahren. Diese Arbeit wird unterstützt durch AIRC spezielle Programm Molekulare Clinical Oncology '' 5 Promille '' und ein AIRC PI-Grant, S.P und Epigenetik Vorzeigeprojekt CNR-Miur gewährt S.P. Dieses Projekt wird finanziell vom European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (Finanzhilfevereinbarung DENOVOSTEM Nr. 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
