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Biology

De नोवो याप/TAZ द्वारा दैहिक स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57462
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Medicine, University of Padua School of Medicine

Summary

दैहिक SCs की उपलब्धता अपक्षयी दवा, रोग मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है और अनुसूचित जाति के गुणों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए । यहाँ हम फिर से प्रोग्राम करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीतियों वर्तमान, इन विट्रो में, एकल transcriptional सह उत्प्रेरक याप के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा उनके संगत विस्तार योग्य ऊतक-विशिष्ट स्टेम/जनक कोशिकाओं में विभेदित वयस्क कोशिकाओं.

Abstract

यहाँ हम प्राथमिक विभेदित कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल मौजूद है और उन्हें प्रतिलेखन कारक याप की क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा एक ही वंश के स्टेम/जनक कोशिकाओं (SCs) में बदल जाते हैं । इस पद्धति के साथ, माउस स्तन ग्रंथि के चमकदार विभेदित (LD) कोशिकाओं को कोशिकाओं है कि स्तन SCs. याप के आणविक और कार्यात्मक गुणों का प्रदर्शन भी अग्नाशय वाहिनी में पूरी तरह से विभेदित अग्नाशय exocrine कोशिकाओं बदल जाता है में बदल रहे है जैसे progenitors । इसी तरह, अंतर्जात करने के लिए, प्राकृतिक SCs, याप प्रेरित स्टेम की तरह कोशिकाओं ("ySCs") अंत में organoid संस्कृतियों के रूप में लंबे समय तक विस्तारित किया जा सकता है इन विट्रो, आगे की जरूरत के बिना अस्थानिक याप/TAZ, के रूप में ySCs एक heritable स्व के साथ संपंन कर रहे है अनुसूचित जाति की तरह राज्य

reprogramming प्रक्रिया यहां प्रस्तुत की संभावना उत्पंन करने के लिए प्रदान करता है और इन विट्रो विभिंन ऊतक जनक कोशिकाओं से शुरू स्रोतों की कोशिकाओं में विस्तार । दैहिक कोशिकाओं के सीधा विस्तार पूर्व vivo अपक्षयी दवा के लिए निहितार्थ है, ट्यूमर दीक्षा के तंत्र को समझने के लिए और, सामान्य में और अधिक, सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए.

Introduction

ऊतक-विशिष्ट दैहिक स्टेम सेल (SCs) ऊतक नवीकरण और चोट के बाद की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण हैं । संभावना आसानी से अलग और सीमित रूप से विस्तार पूर्व vivo दैहिक SCs संभावित अपक्षयी उपचारों के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, साथ ही साथ बुनियादी अनुसंधान और रोग मॉडलिंग में अनुसूचित जाति के अनुप्रयोगों के लिए का प्रतिनिधित्व करता है । इस दिशा में प्रगति तथापि, विभिंन उपकला अंगों की अनुसूचित जाति राज्य पर कब्जा करने की कठिनाई द्वारा सीमित किया गया है इन विट्रो। दरअसल, कई वयस्क ऊतकों निवासी SCs में मौजूद नहीं हो सकता है, या आसानी से उपलब्ध नहीं हो, या उनकी संख्या और अपक्षयी क्षमता उंर बढ़ने या रोग की स्थिति से घिस सकता है । २०१६ में, हम एक एकल transcriptional coactivator की अभिव्यक्ति है कि रिपोर्टिंग द्वारा इस अंतर को भरने के लिए शुरू कर दिया, याप (हां जुड़े प्रोटीन) या उसके निकट संबंधित प्रोटीन TAZ (एक transcriptional आकृति के साथ PDZ उत्प्रेरक), टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं में कुशलतापूर्वक कार्यात्मक, विस्तार योग्य, गैर tumorigenic, ऑटोलॉगस कोशिका आबादी है कि ऑपरेशन और उनके इसी ऊतक-विशिष्ट SCs1से आणविक रूप से अलग कर रहे है बनाता है । निरंतर याप या कुछ दिनों के लिए TAZ गतिविधि की एक पल्स आत्म नवीकरण दैहिक SCs की उपस्थिति पैदा करने के लिए पर्याप्त है । यह एक स्थिर शर्त है जो अब निरंतर transgene व्यंजक पर निर्भर नहीं है, क्योंकि इसे आगे अस्थानिक याप/TAZ1की अभिव्यक्ति के बिना सेल पीढ़ियों के माध्यम से प्रेषित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत विवरण de नोवो उपकला स्टेम/जनक कोशिकाओं स्तन ग्रंथि और अग्ंयाशय के उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया, इन ऊतकों के विभेदित कोशिकाओं से शुरू । यह कार्यविधि वर्तमान reprogramming/transdifferentiation arena में एक काला बॉक्स भरता है । इन दिशाओं में मुख्य प्रयास वास्तव में अभी तक एक प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) राज्य के लिए सेल संक्रमण पर केंद्रित है, और अधिक विभेदित कोशिकाओं में इन भ्रूण और pluripotent SCs के रूपांतरण के बाद । हालांकि, iPSCs एक बार वयस्क ऊतकों में शुरू tumorigenic रहे हैं, उनके पूर्ण और कुशल भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने की आवश्यकता स्थापना2। हालांकि, यह भेदभाव कदम, जब भी संभव हो, दीर्घकालिक विस्तार, स्वयं संगठन और अंग पुनर्जनसंख्या क्षमता की कीमत पर आता है । ये अंग पुनर्जनन कि वास्तव में विशिष्ट है अंतर्जात ऊतक-विशिष्ट SCs और वर्तमान में वर्णित याप-प्रेरित SCs (ySCs) के लिए आवश्यक गुण हैं । इसी तरह, विभिंन प्रतिलेखन कारकों की कॉकटेल का उपयोग करके दूसरे में एक सेल प्रकार के प्रत्यक्ष transdifferentiation भी विभेदित कोशिकाओं है कि आवश्यक प्रफलन और स्टेम क्षमता की कमी उत्पंन3।

यहां बताई गई प्रक्रिया का भी लाभ लेता है हाल ही में पेश organoid तकनीक का, जिसके द्वारा अंतर्जात SCs का विस्तार और विभेद किया जा सकता है पूर्व वीवो4. याप-प्रेरित SCs प्रयोगात्मक, जैविक या रोग की स्थिति में भी organoid-गठन SCs उत्पन्न कर सकता है जिसमें अंतर्जात SCs मौजूद नहीं हैं. हम ध्यान दें कि, अंय reprogramming प्रक्रियाओं के साथ अंतर पर, सेल याप द्वारा प्रदान की प्लास्टिक की तरह एक अनुसूचित जाति के लिए संस्करण के केवल फार्म के अनुरूप हो सकता है कि स्थिति की तरह रहने वाले ऊतकों में होता है । अनुसूचित जाति के पुनर्अधिग्रहण-जैसे लक्षण ऊतक की मरंमत या oncogenic सक्रियण5के साथ संबद्ध किया गया है । हालांकि कई वयस्क ऊतकों, याप और/या TAZ के homeostasis के लिए औषधालय बिल्कुल पुनर्जनन के लिए आवश्यक हैं, ट्यूमर विकास और दैहिक SCs के विस्तार इन विट्रो में1,6,7,8 ,9,10,11,12

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं हमारे संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन प्रदर्शन किया गया और OPBA और स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अनुमोदित

1. याप प्रेरित स्तन स्टेम की तरह कोशिकाओं (yMaSCs) की पीढ़ी

नोट: अनुभाग 1 के लिए सभी मीडिया और समाधान रचनाएं तालिका 1में निर्दिष्ट की गई हैं ।

  1. प्राथमिक स्तन कोशिका आबादी का अलगाव
    1. एक सेल संस्कृति डाकू के तहत तैयार: डिस्पोजेबल नश्तर, hyaluronidase समाधान, पृथक्करण मध्यम, रक्तलायी समाधान, छंटाई समाधान, कोलेजन मैं कोटिंग समाधान, Ca2 + chelating समाधान, धो मध्यम #1, धो मध्यम #2, dispase समाधान, स्तन 2 डी संस्कृति मध्यम, आइस कोल्ड HBSS/
    2. एक ठेठ प्रयोग के लिए, 10 मादा चूहों बलिदान (या तो सीडी-C57BL की 1/), 8-12 सप्ताह ग्रीवा विस्थापन से पुराना है । विच्छेदन से पहले प्रचुर मात्रा में ७०% इथेनॉल समाधान के साथ पेट निष्फल ।
    3. काटना पेट की त्वचा के साथ एक वाई के आकार का चीरा बनाकर स्तन ग्रंथियों को ध्यान से और धीरे से Dumont संदंश के साथ खींच द्वारा त्वचा के ऊपर से नीचे की ग्रंथियों को अलग । एक गैर कोशिका चिपकने वाली ग्रंथियों को 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा HBSS के साथ रखें/पुनश्च (प्रत्येक डिश के लिए 20 ग्रंथियों), सुनिश्चित करने के लिए किसी भी त्वचा के टुकड़े पर नहीं ले ।
    4. एक ऊतक संस्कृति हूड के तहत, ताजा HBSS के 10 मिलीलीटर में एक बार एक ग्रंथि धो/पुनश्च और उंहें एक खाली गैर सेल चिपकने वाला पकवान में जगह (प्रत्येक डिश के लिए 20 ग्रंथियों) । ऊतक संस्कृति प्लेट का उपयोग न करें, के रूप में कोशिकाओं के लिए उंहें सामग्री के महत्वपूर्ण नुकसान के कारण चिपके रहते हैं ।
    5. 1 मिमी3 टुकड़ों में से एक समरूप मिश्रण तक नश्तर के साथ पतले स्तन ग्रंथियों भरती प्राप्त की है । पृथक्करण मध्यम के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक डिश से कीमा बनाया हुआ ऊतक पुनर्प्राप्त करने के लिए एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट कॉलेस्ट्रॉल से बचने और निलंबन एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब pipetting में एक से अधिक करने के लिए ंयूनतम 5x ऊतक के झुरमुट को कम करने के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: एक कुशल पाचन के लिए, कदम 1.1.5 में ऊतक के उचित नख़रेबाज़ महत्वपूर्ण है ।
    6. सतत जोरदार झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन । 1 घंटे के बाद, homogenate की जांच करें और 10 मिनट तक लंबा गर्मी अगर झुरमुट अभी भी मौजूद हैं । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर पचा ऊतक नीचे स्पिन और supernatant त्यागें । रक्तलायी समाधान के 3 मिलीलीटर में ऊतक गोली reसस्पेंड और बर्फ पर 3 मिनट की मशीन ।
      नोट: Hemolysis एक जगह कठोर उपचार है, तो सख्त समय इस कदम पर महत्वपूर्ण है ।
    7. धो मध्यम #1 के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो, 5 मिनट के लिए ४०० x g पर पचा ऊतक नीचे स्पिन और supernatant त्यागें । धो मध्यम # 2 और थाली में 10 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन के 10 मिलीलीटर में ऊतक गोली reसस्पेंड । एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए व्यंजन मशीन ।
      नोट: यह कदम fibroblasts के बहुमत को हटाने की अनुमति होगी, कि संस्कृति पकवान का पालन करना चाहिए ।
    8. बर्तन से सेल निलंबन की वसूली और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डालना । 5 मिनट के लिए ४०० x g पर स्पिन और supernatant को खत्म । 5 मिनट के लिए हर बार ४०० x g पर नीचे कताई द्वारा Ca2 + chelating समाधान के 10 मिलीलीटर में दो बार गोली धो लें । ०.२५% Trypsin/EDTA और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    9. trypsin समाधान के शीर्ष पर dispase समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें और DNase I 1μg/एमएल के साथ पूरक । पिपेट ऊपर और नीचे एक 1 मिलीलीटर-टिप के माध्यम से समग्र डीएनए का झुरमुट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी, हर 3 मिनट में मिलाते से कम 5x ।
    10. धो मध्यम #2 के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक ४० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में फिल्टर । 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल सस्पेंशन नीचे स्पिन और supernatant त्यागें, सभी तरल को खत्म करने के लिए सुनिश्चित कर रही है ।
  2. FACS द्वारा स्तन उपकला कोशिकाओं का शुद्धिकरण
    1. 10 μL लिन (माउस वंश एंटीबॉडी कॉकटेल) जोड़कर एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें, 12 μL विरोधी CD326 (Ep कैम), के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए 30 एनजी/एमएल, 10 μL विरोधी CD49f, के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 25 एनजी/एमएल, 10 μL विरोधी CD61, एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी/ , २.५ μL विरोधी CD29, २.५ एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए ।
      नोट: इस कदम से कदम १.३, हमेशा अंधेरे में काम करते हैं, फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के ब्लीचिंग से बचने के लिए । प्रत्येक गोली के लिए:
    2. कोशिकाओं की एक छोटी संख्या रखें (गोली में एक १०० μL टिप सूई से) एक अलग ट्यूब में । एक FACS ट्यूब में समाधान छंटाई के ५०० μL में कोशिकाओं reसस्पेंड और FACS प्रक्रिया के लिए unलेबल्ड नमूना के रूप में बर्फ पर रहते हैं ।
    3. धो मध्यम #1 के २०० μL में प्रत्येक गोली reसस्पेंड, एंटीबॉडी मिश्रण के ४४.५ μL जोड़ने के लिए, अच्छी तरह से पिपेट और अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन । सेल सस्पेंशन को वॉश मीडियम के 10 मिलीलीटर में पतला करें #1, 5 मिनट के लिए ४०० x g पर नीचे स्पिन करें और supernatant को छोड़ें ।
    4. एक टोपी के माध्यम से समाधान और फिल्टर छंटाई के 2 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड-छलनी FACS tubeand सेल आबादी के FACS जुदाई के लिए आगे बढ़ना ( चित्र 1bके रूप में) । बहुरंगा FACS प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले, दूसरों में से प्रत्येक में प्रत्येक fluorochrome के संभावित spillover के लिए सही करने के लिए सुनिश्चित करें । ऐसा करने के लिए, प्रत्येक fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी सेल निलंबन के साथ अलग से और मापने वर्णक्रमीय सभी fluorophores के लिए और सभी डिटेक्टरों में ओवरलैप मूल्यों, एकल रंग नियंत्रण के माध्यम से, क्रम में एक मुआवजा मैट्रिक्स बनाने के लिए ।
      नोट: इस प्रयोग में, ८५ माइक्रोन नोजल से सुसज्जित सॉर्टर कार्यरत था । 10 मादा चूहों से एक ठेठ तैयारी लगभग ८००,००० एलडी कोशिकाओं निकलेगा । माध्यमिक निस्पंदन के लिए आगे बढ़ें यदि FACS प्रक्रिया के दौरान झुरमुट फार्म ।
  3. प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं के सीडिंग
    1. FACS प्रक्रिया कोट के दौरान एक बहु अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट कोलेजन के साथ मैं कोटिंग समाधान । ३७ ° c, 5% एक सेल संस्कृति मशीन में सह2 पर 1 एच के लिए मशीन । कोटिंग समाधान निकालें और धोने के माध्यम से धो #1 बस चढ़ाना पहले ।
    2. धो कोशिकाओं धो समाधान #1 के 10 मिलीलीटर के साथ FACS प्रक्रिया से बरामद, 5 मिनट के लिए नीचे ४०० x जी स्पिन और supernatant को खत्म । स्तन 2 डी संस्कृति मध्यम (५०० µ l/अच्छी तरह से) और कोलेजन इलाज प्लेट में सेल गोली reसस्पेंड । कोशिकाओं ४८ एच के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में बैठने के लिए उचित सेल लगाव और फैलने के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: 10 मादा चूहों से एक ठेठ छंटाई के लिए, एक 24 अच्छी तरह से बहु अच्छी तरह से प्लेट के 6-8 कुओं एक इष्टतम कोशिका घनत्व निकलेगा (१०० ००० कोशिकाओं/
  4. प्रेरण yMaSCs (याप-प्रेरित स्तन स्टेम सेल)
    नोट: इस कदम से आगे, सभी प्रक्रियाओं बीएसएल-2 शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।
    1. स्तन कॉलोनी मध्यम तैयार करें । हौसले से बस सेल बोने से पहले माध्यम से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें ।
    2. याप-प्रेरित स्तन स्टेम सेल (yMaSCs) की प्रेरण के लिए, FUdeltaGW-rtTA वायरल supernatant, FUW-tetO-याप (या TAZ) supernatant की एक मात्रा, सीरम मुक्त स्तन के दो संस्करणों के साथ की एक मात्रा के मिश्रण से lentiviral संक्रमण द्वारा प्राथमिक LD कोशिकाओं transduce 2d संस्कृति मध्यम 2x की खुराक की सांद्रता, ५०० मिलीलीटर की कुल मात्रा में । ४८ एच के लिए lentiviral supernatants के साथ कोशिकाओं की मशीन । एक ठेठ lentiviral तैयारी के लिए, कृपया ऑनलाइन प्रोटोकॉल को देखें22।
    3. संक्रमण के बाद, अनुयाई कोशिकाओं को धोने और स्तन 2d संस्कृति के साथ इलाज 2 µ जी के साथ पूरक/एमएल doxycycline exogenous याप (या TAZ) जीन अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए । खाली, EGFP या YAPS94A व्यक्त वैक्टर, या inducible याप (या TAZ) वैक्टर से संक्रमित कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग करें, लेकिन नकारात्मक नियंत्रण के रूप में doxycycline के बिना छोड़ दिया है ।
      नोट: सफल संक्रमण मानव याप transgene के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ qRT-पीसीआर द्वारा मांय किया जा सकता है, के रूप में पहले1वर्णित है ।
    4. doxycycline के साथ प्रेरण के 7 दिनों के बाद, ०.०५% Trypsin/EDTA (१५० μL/well) 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के साथ गर्मी से अलग अनुयाई कोशिकाओं; stop trypsinization द्वारा कमजोर 1:5 में धो मध्यम #2 (६०० μL/अच्छी तरह से) और गणना कोशिकाओं । स्तन कॉलोनी मध्यम (प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए 1 मिलीलीटर) में कोशिकाओं reसस्पेंड, 2 μg/एमएल doxycycline और बीज के साथ १,००० कोशिकाओं के एक clonogenic घनत्व/अच्छी तरह से 24-well ultralow संलग्नक प्लेट में पूरक ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि स्तन कॉलोनी मध्यम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स इसके अलावा के समय में बर्फ ठंड है बनाओ । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हमेशा पर संग्रहीत किया जाना चाहिए-20 ° c आगमन पर, और धीरे-2 रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर गल; एक बार गल, यह हमेशा बर्फ पर नियंत्रित किया जाना चाहिए, निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार ।
    5. एक बार याप-एक्सप्रेस LD कोशिकाओं proliferating शुरू और निलंबन (yMaSC कालोनियों) में MaSC की तरह कालोनियों के रूप में विकसित (14 दिन बोने के बाद), गिनती और आगे विश्लेषण (चित्रा 1C) के लिए प्रक्रिया ।
      नोट: ऋणात्मक नियंत्रण कक्ष (बिंदु 1.4.3 के रूप में) एकल कक्षों के रूप में रहेंगे ।
    6. yMaSC कॉलोनी विकास के 14 दिनों के दौरान ताजा स्तन कॉलोनी माध्यम हर ७२ ज के साथ संस्कृति की भरपाई; ऐसा करने के लिए 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बिना स्तन कॉलोनी मध्यम के एक aliquot तैयार करने के लिए, पूरक की 10x एकाग्रता के साथ पूरक और 1:10 कुल मात्रा का एक अच्छी तरह से (जैसे १०० μL कुल मध्यम के 1 मिलीलीटर में) जोड़ने के लिए, अत्यधिक कमजोर पड़ने से बचने के लिए मैट्रिक्स निलंबन ।
  5. yMaSCs के उप-संवर्धन
    1. स्तन कॉलोनी माध्यम से प्राथमिक कालोनियों ठीक है, तो अलग कर देना और बीज ।
      नोट: याप से व्युत्पन्न yMaSC कालोनियों-पुनर्निर्मित LD कोशिकाओं स्व-नवीकरण क्षमता प्राप्त और आगे doxycycline प्रशासन के बिना सफलतापूर्वक उप-cultureed जा सकता है (यानी, स्वतंत्र रूप से ट्रांसजेनिक याप/TAZ की अभिव्यक्ति की) ।
    2. तैयार, एक सेल कल्चर हुड के तहत, चरण 1.4.1 और स्तन organoid माध्यम के रूप में स्तन कॉलोनी माध्यम ।
    3. प्रत्येक नमूना ले लीजिए और बर्फ पर 1 एच के लिए आइस कोल्ड HBSS के अतिरिक्त मात्रा (10:1) में गर्मी, क्रम में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स solubilize करने के लिए । 5 मिनट के लिए १८० x g पर केंद्रापसारक द्वारा और बर्फ ठंड HBSS में reसस्पैंड द्वारा 3x कालोनियों धो लो । एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ०.०५% trypsin/EDTA में मशीन कालोनियों । पिपेट कालोनियों अप और एक p1000 टिप के साथ 10x नीचे एकल कोशिका स्तर को पूरा पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए ।
    4. गिनती और स्तन कॉलोनी मध्यम में (प्रत्येक अच्छी तरह के लिए 1 मिलीलीटर) doxycycline बिना १,००० कोशिकाओं के एक clonogenic घनत्व पर 24-अच्छी तरह से ultralow लगाव प्लेटों में कोशिकाओं/ स्व-नवीनीकरण का आकलन करने के लिए प्रत्येक 10-14 दिनों में इस passaging कार्यविधि को दोहराएँ.
    5. तीसरे मार्ग से पहले, organoid संस्कृति की स्थिति में पारित yMaSC कालोनियों, yMaSC विस्तार बढ़ाने के लिए और मिनी ग्रंथियों के गठन के लिए अनुमति देने के लिए, कि आत्म एक bilayered उपकला बारीकी से की याद ताजा में का आयोजन vivo स्तन ग्रंथि में ऊतकवैज्ञानिक संगठन ।
    6. स्तन कॉलोनी माध्यम से ठीक से कालोनियों के रूप में कदम 1.5.3 1.5.4 के लिए । १००% वृद्धि फैक्टर में reसस्पेंड कालोनियों तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कम, एक अच्छी तरह से एक के लिए 20-25 कालोनियों की एक अधिकतम reµ में 24-अच्छी तरह से ultralow लगाव थाली मैट्रिक्स के १५० l ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४० मिनट के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में प्लेटें और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जमना और फिर स्तन organoid माध्यम के ५०० μL के साथ जैल ओवरले चलो ।
    8. कुछ दिनों के बाद कालोनियों के गठन के लिए जांच के लिए नवोदित organoids (चित्रा 1E) फार्म ।
    9. 10-14 दिनों के बाद, बीतने या आगे विश्लेषण के लिए organoids प्रक्रिया ।
    10. organoids संस्कृतियों बीतने के लिए, बर्फ पर 1 एच के लिए बर्फ शीत HBSS के अतिरिक्त मात्रा (10:1) में प्रत्येक नमूना इकट्ठा करने और organoids की वसूली, क्रम में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स solubilize करने के लिए । 5 मिनट के लिए १८० x g पर नीचे स्पिन और बर्फ ठंड HBSS में reसस्पेंड द्वारा organoids 3x धो लें ।
    11. organoids ०.०५% trypsin/EDTA में 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए । पिपेट organoids अप और एक p1000 टिप के साथ 10x नीचे एक सेल स्तर तक पूरा पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए ।
    12. १००% वृद्धि कारक की एक बूंद में एक सेल निलंबन के रूप में पुनर्बीज एक 24 अच्छी तरह से ultralow लगाव प्लेट की एक अच्छी तरह के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (१५० μL कम) । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४० मिनट की मशीन और स्तन organoid माध्यम के ५०० μL के साथ जैल ओवरले द्वारा एक जेल के रूप में करते हैं ।
      नोट: yMaSC organoids चरण 1.5.13 में के रूप में १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स संस्कृति से उबरने से cryopreserved किया जा सकता है, trypsinization से परहेज । स्तन organoid मध्यम में स्टोर 10% DMSO के साथ पूरक ।
    13. जल्दी-८० डिग्री सेल्सियस पर yMaSC organoids फ्रीज और फिर तरल नाइट्रोजन में संरक्षित ।

2. yDucts की जनरेशन

नोट: अनुभाग 2 के लिए सभी मीडिया और समाधान रचनाएं तालिका 2में निर्दिष्ट की गई हैं ।

  1. प्राथमिक अग्नाशय acini के अलगाव
    1. ७०% ेतोः में विच्छेदन संदंश और कैंची प्लेस और एक सेल संस्कृति हूड कोष्ठकी संस्कृति माध्यम के तहत तैयार, प्रत्येक माउस के लिए 15 मिलीलीटर; कोष्ठकी वसूली मध्यम, प्रत्येक माउस के लिए ६० मिलीलीटर; पंजाबियों पुनश्च; स्टॉक समाधान collagenase I; collagenase मैं समाधान एक, प्रत्येक माउस के लिए 15 मिलीलीटर; बेअसर चूहा पूंछ कोलेजन मैं समाधान । बेअसर चूहा पूंछ कोलेजन मैं पीएच = 7 के लिए, ०.१ N NaOH के साथ पहले का समायोजन करने के लिए एसिटिक एसिड जिसमें कोलेजन भंग है बफर, और फिर 10N एचसीएल के साथ । के लिए पतला २.५ मिलीग्राम//रहो चूहे पूंछ कोलेजन मैं और बर्फ पर सभी रिएजेंट इसे बेअसर करने के लिए । कुर्बानी के 6 से 9 सप्ताह के पुराने चूहों को उचित जीनोटाइप ।
    2. अपनी पीठ पर प्रत्येक माउस प्लेस, और ७०% इथेनॉल समाधान के साथ पेट धोने । पेट की दीवार के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाओ । स्थिति जानें और अग्ंयाशय काटना (एक गाइड के रूप में तिल्ली का उपयोग करके) और यह 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाब में एक 10 सेमी गैर सेल चिपकने वाला पकवान में जगह/एक सेल संस्कृति हूड के तहत तुरंत बर्तन हस्तांतरण । इस कदम के बाद से, एक सेल कल्चर हुड के तहत हमेशा काम करते हैं ।
    3. एक नए गैर-सेल चिपकने वाला पकवान पहले collagenase मैं समाधान ए के 7 मिलीलीटर से भरा में प्रत्येक अग्ंयाशय स्थानांतरण ।
    4. जल्दी से डिस्पोजेबल नश्तर की एक जोड़ी के साथ प्रत्येक अग्ंयाशय कीमा, लगभग 1 mm3 टुकड़ों के एक सजातीय ऊतक निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि इस प्रक्रिया में कोई अधिक से अधिक 2 मिनट इष्टतम सेल व्यवहार्यता के लिए ले जाना चाहिए ।
    5. ३७ ° c, 10 मिनट के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में 5% सह2 पर collagenase पाचन के लिए पकवान मशीन, हर 3 मिनट मिलाते हुए समरूप ऊतक पाचन आश्वासन देता हूं ।
    6. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब (प्रत्येक अग्ंयाशय के लिए एक) में पचा ऊतक पुनर्प्राप्त, कोष्ठकी धोने मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ पकवान धोने और यह एक ही ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जगह है, pipetting पचा ऊतक ऊपर और नीचे नहीं 3x से अधिक ।
    7. १०० एक्स जी में 18 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पचा ऊतक नीचे स्पिन और supernatant हटा दें ।
      नोट: इस चरण के दौरान collagenase गतिविधि कम करने के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं नीचे स्पिन.
    8. collagenase मैं समाधान एक के 7 मिलीलीटर में ऊतक गोली reसस्पेंड और एक नया 10 सेमी गैर सेल चिपकने वाला पकवान में इस समाधान डालो ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर collagenase पाचन के एक दूसरे दौर के लिए डिश के रूप में कदम 2.1.5 में 10 मिनट के लिए, हर 3 मिनट मिलाते हुए समरूप ऊतक पाचन को आश्वस्त । इस बीच, प्रत्येक अग्ंयाशय के लिए एक साफ ५०-एमएल शंकु ट्यूब तैयार एक १०० माइक्रोन सेल छलनी के साथ सबसे ऊपर ।
    10. पचा ऊतक ठीक हो और एक बाँझ 10 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर के साथ ऊतक macerating द्वारा १०० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से पारित (ध्यान से ऊतक नीचे प्रेस करने के लिए सुनिश्चित करें, कतरनी बलों छलनी सतह के लिए स्पर्श करने से परहेज). कोष्ठकी वॉश मीडियम के 10 मिलीलीटर के साथ डिश को धो लें, और इसी १०० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से इस 10 मिलीलीटर से गुजारें ।
    11. १०० एक्स जी में 18 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पचा ऊतक नीचे स्पिन और supernatant हटा दें ।
    12. कोष्ठकी धो मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक गोली ठीक । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल समाधान स्थानांतरण पहले से ही अतिरिक्त 10 ताजा कोष्ठकी धोने मध्यम के मिलीलीटर युक्त, गोली के निलंबन के लिए अत्यधिक pipetting से परहेज ।
    13. १०० एक्स जी में 18 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पचा ऊतक नीचे स्पिन और supernatant हटा दें ।
    14. ध्यान से कोष्ठकी वसूली मध्यम के 6 मिलीलीटर में पचा ऊतक reसस्पेंड और यह 6 अच्छी तरह से बहु अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट, 3 मिलीलीटर प्रत्येक के 2 कुओं में वितरित । एक stereomicroscope के तहत ध्यान से कोष्ठकी अलगाव की गुणवत्ता का आकलन है, जो कोष्ठकी समूहों के एक समरूप निलंबन के रूप में दिखाई देते हैं, एकल कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात के साथ ( चित्र bदेखें); किसी भी बड़े ऊतक का झुरमुट अंततः वर्तमान (आम तौर पर भी नग्न आंखों को दिखाई), उंहें हल से बाहर pipetting द्वारा निकालें ।
  2. प्राथमिक अग्नाशय acini के सीडिंग
    1. 2 एच के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c पर पचा कोष्ठकी समूहों मशीन, सेल वसूली के लिए अनुमति देने के लिए ।
    2. सेल वसूली कोट ४८ के दौरान-तटस्थ चूहे पूंछ कोलेजन के १०० μL के साथ अच्छी तरह से बहु कुओं और एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c पर 1 घंटे के लिए मशीन एक hydrogel तकिया फार्म के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. सेल वसूली के 2 ज के बाद, एक शंकु ट्यूब में कोष्ठकी सेल निलंबन, 18 डिग्री सेल्सियस पर १०० x जी में 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन और supernatant को हटा लीजिए ।
    4. कोष्ठकी संस्कृति मध्यम (एक ४८ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह के लिए १५० μL) के उपयुक्त मात्रा में acini reसस्पेंड । बीज एक इष्टतम घनत्व प्राप्त करने के लिए 16 कुओं में प्रत्येक असंबद्ध अग्ंयाशय (100-120 कोष्ठकी क्लस्टर/
    5. तटस्थ चूहे पूंछ कोलेजन मैं समाधान के एक समान मात्रा के साथ इस कोष्ठकी निलंबन पतला, बर्फ पर ट्यूबों रखते हुए । मिश्रण ध्यान से और जल्दी से बीज कोलेजन तकिया में वर्णित के शीर्ष पर सेल निलंबन एक ४८ अच्छी तरह से बहु अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से (३०० μL के लिए) ।
    6. एक hydrogel करने के लिए अनुमति देने के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c पर 1 एच मशीन ।
  3. अग्नाशय organoids की प्रेरण
    1. कोष्ठकी संस्कृति माध्यम के ५०० μL के साथ कोलेजन hydrogels ओवरले doxycycline-याप से अग्नाशय organoids के आश्रित प्रेरण के लिए 2 μg/एमएल R26 के साथ पूरक है rtTAM2 ; TetO-यापS127A चूहों; ऋणात्मक नियंत्रणों को समान स्थितियों या R26-rtTAM2 में कल्चरित wt कक्षों द्वारा प्रदान किया जाता है; TetO-यापS127A कोशिकाएँ doxycycline की अनुपस्थिति में कल्चरित होती हैं.
    2. कोष्ठकी संस्कृति माध्यम में संस्कृति कोष्ठकी कोशिकाओं के पूरक 2 μg/एमएल doxycycline के लिए 5 से 7 दिनों के लिए संस्कृति मध्यम ताज़ा (३०० μL/अच्छी तरह से) हर ४८ एच और organoid गठन के बाद रूपात्मक परिवर्तन द्वारा डक्ट बनाने नलिकात्मक की तरह संरचनाओं ( चित्र 2c). एक बार organoids का गठन कर रहे हैं, कोशिकाओं अग्नाशय organoid संस्कृति की स्थिति में पारित किया जा सकता है या आगे के विश्लेषण के लिए काटा (उदा: आरएनए निष्कर्षण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस).
  4. अग्नाशय organoids के उप-संवर्धन
    1. अपने स्वयं के नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए, क्लोनिंग याप-प्रेरित अग्नाशय organoids (yDucts) में तीन आयामी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स hydrogels (अग्नाशय organoid संस्कृति शर्तों) स्वतंत्र रूप से exogenous याप/TAZ आपूर्ति (यानी , स्वतंत्र रूप से doxycycline प्रशासन) ।
    2. तैयार Trypsin 0, 05%/EDTA; १००% वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कम; अग्नाशय Organoid मध्यम और Collagenase I हल B.
    3. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब Collagenase मैं समाधान बी के 4 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से पारित होने के लिए तैयार ।
    4. संस्कृति माध्यम को त्यागें, सावधानीपूर्वक कोमल आकांक्षा द्वारा कुओं से hydrogels निकालें और उन्हें शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें.
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ट्यूब, सतत जोरदार झटकों के साथ कोलेजन मैट्रिक्स के पूर्ण पाचन की अनुमति के लिए (हर 10 मिनट की जांच जब तक hydrogel पूरी तरह से solubilized है) । नीचे स्पिन ७५० एक्स जी पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं बरामद और supernatant निकालें ।
    6. एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए Trypsin 0, 05%/EDTA के 1 मिलीलीटर में मशीन बरामद की । पंजाब के 9 मिलीलीटर 1x के साथ trypsin पतला, 2 मिनट के लिए ७५० x g पर नीचे स्पिन और supernatant निकालें ।
    7. बर्फ ठंडा विकास कारक में सेल गोली reसस्पेंड कम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और अल्ट्रा कम संलग्नक प्लेटों में बीज (आमतौर पर एक में एक बूंद १५० μL की एक अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से प्लेट) ।
    8. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स hydrogel एक सेल संस्कृति मशीन ४० मिनट में ३७ डिग्री सेल्सियस और फिर अग्नाशय Organoid मध्यम (प्रत्येक अच्छी तरह के लिए ५०० μL) के साथ ओवरले में प्लेटें मशीन द्वारा जमना चलो । yDucts 7-10 दिनों (चित्रा 2d) में organoids की तरह पुटी के रूप में विकसित होगा ।
    9. आगे passaging organoids के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ ठंडा पंजाब में मशीन द्वारा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से हटाया जा सकता है, 5 मिनट के लिए १८० x जी में नीचे स्पिन द्वारा 3 बार धोने और बर्फ ठंडा पंजाबन 1x में पुनर्निलंबन के बाद मैट्रिक्स carryover से बचने के लिए । Organoids तो 10 मिनट के लिए trypsin ०.०५% के साथ असंबद्ध है एक एकल कोशिकाओं निलंबन प्राप्त करने के लिए और ताजा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में reसीडिंग और फिर अग्नाशय Organoid माध्यम के साथ मढ़ा (के रूप में 2.4.7-2.4.8 में) ।
    10. yDuct organoids के रूप में कदम 2.4.9 में १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स संस्कृति से उबरने से तरल नाइट्रोजन में cryopreserved जा सकता है, trypsinization से परहेज, और अग्नाशय Organoid मध्यम में भंडारण 10% DMSO के साथ पूरक ।
    11. yDuct organoids जल्दी में जमे हुए है-८० º सी और फिर तरल नाइट्रोजन में संरक्षित ।

Representative Results

yMaSCs की पीढ़ी
प्रयोगात्मक रणनीति के एक सिंहावलोकन याप के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं reprogram करने के लिए चित्र 1aमें प्रस्तुत किया है । प्राथमिक स्तन LD उपकला कोशिकाओं फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई13द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. आरेख 1b तीन अलग उपजनसंख्या प्राप्त करने के लिए एक विशिष्ट सॉर्टिंग कार्यविधि का प्रतिनिधित्व करता है: बेसल कोशिकाओं (EpCAMकमCD49fउच्चCD61-), चमकदार जनक (एल. पी.) कोशिकाओं (EpCAMउच्चCD49fकमCD61+ ) और LD कोशिकाओं (EpCAMउच्चCD49fकमCD61-) । तीन उपजनसंख्याों के सावधान गेटिंग LD कोशिकाओं की एक शुद्ध तैयारी को अलग करने के लिए आवश्यक है, कि पूरी तरह से विभेदित होते हैं और पूरी तरह से जब स्तन ग्रंथि कॉलोनी बनाने की स्थिति में वरीयता प्राप्त गिरफ्तार विकास ( चित्रा 1C, बाएँ पैनल) देखें. इसके विपरीत, जब exogenous याप व्यक्त करने के लिए प्रेरित, एलडी कोशिकाओं 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निलंबन संस्कृतियों (चित्रा 1C) में आसानी से पहचानने योग्य घने उपकला कालोनियों फार्म करने के लिए proliferating शुरू । reprogramming की दक्षता, एक ठेठ प्रयोग के लिए 3% के आसपास सत्यापित, मूल रूप से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निलंबन संस्कृतियों में वरीयता प्राप्त एकल कोशिकाओं की संख्या से अधिक कालोनियों की संख्या की गिनती से रन बनाए जा सकते है (चित्र 1 d) । reorganized चमकदार कोशिकाओं (yMaSCs) तो १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स organoid संस्कृति की स्थिति में पारित किया जा सकता है ( चित्रा 1aमें योजना देखें), जटिल organoid की तरह संरचनाओं में आत्म-आयोजन है कि कई लुमेन के आसपास विकसित और ( चित्रा 1E) (ट्रांसजेनिक याप अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति में) doxycycline के अभाव में भी उल्लेखनीय स्व-नवीकरण की क्षमता प्रदर्शित करें । Histologically, yMaSC-व्युत्पंन organoids एक बेसल परत (K14 सकारात्मक) प्रदर्शन, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ECM और एक चमकदार परत (K8 सकारात्मक) का सामना करना पड़ रहा, organoid के भीतर लुमेन की तरह गुहाओं का सामना करना पड़ (चित्रा 1F) । इस वास्तुकला देशी MaSCs (चित्रा 1F) द्वारा गठित organoids की है कि से अलग है ।

yDucts की पीढ़ी
याप की क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा प्राथमिक अग्नाशय acini reprogram करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीति का एक सिंहावलोकन चित्रा 2aमें प्रस्तुत किया गया है । पूरे कोष्ठकी समूहों अग्नाशय के ऊतकों के थोक से हल्के पृथक्करण और निस्पंदन के माध्यम से आकार अपवर्जन का एक संयोजन से अलग कर रहे हैं । एक ठेठ तैयारी चित्रा बीमें प्रस्तुत किया जाता है । अलगाव के बाद, कोष्ठकी सेल क्लस्टर exocrine कोष्ठकी इकाइयों के सजातीय आकार के एक निलंबन के रूप में प्रकट होना चाहिए, अंत में स्रावी आइलेट्स टाप या अग्नाशय डक्टर पेड़ के टुकड़े और एकल कोशिकाओं को कम से पृथक्करण के द्वारा कोई संदूषण के साथ । अंत: स्रावी टाप या नलिकात्मक अंशों द्वारा संदूषण की कमी चयनात्मक निस्पंदन (step 2.1.10) का एक संकेत है, संभवतः कठोर हैंडलिंग के कारण; अवांछित पृथक्करण एकल कोशिकाओं के लिए कोष्ठकी समूहों के अत्यधिक collagenase उपचार या proteolytic ऊतक, जो अतिरिक्त SBTI उपचार द्वारा अंकुश लगाया जा सकता द्वारा जारी एंजाइमों की बफर गतिविधि के कारण हो सकता है ।

एक ठेठ कोष्ठकी reprogramming प्रयोग चित्रा 2cमें प्रस्तुत किया जाता है; 3 डी में संस्कृति के 5-7 दिनों के भीतर कोलेजन-मैं doxycycline की उपस्थिति में hydrogel आधारित है, अग्नाशय acini से व्युत्पंन R26-rtTAM2/tetO-यापS127A चूहों आसानी से डक्ट की तरह समूहों में बदल (है कि हम नाम yDucts), एक पतली द्वारा रचित उपकला कोशिकाओं है कि एक विस्तार केंद्रीय गुहा के आसपास पैदा करना के monolayer । reprogramming क्षमता है, जो एक ठेठ प्रयोग के लिए ७०% के आसपास है, आसानी से बीज acini की कुल संख्या में वाहिनी की तरह समूहों की संख्या स्कोरिंग द्वारा मापा जा सकता है (चित्रा 2d) । ऋणात्मक नियंत्रण कक्ष, जो कि R26-rtTAM2/+ कक्षों या R26-rtTAM2/tetO-यापS127A कक्षों को बिना doxycycline के छोड़ देते हैं, हमेशा इन संस्कृति स्थितियों में पोस्ट-mitotic कोष्ठकी क्लस्टर्स के रूप में रहते हैं, जैसा कि पहले बताया गया था ,14,15. rebased yDucts फिर Matrigel में एकल सेल स्तर पर किया जा सकता है आधारित organoid संस्कृति की स्थिति16 ( चित्रा 2aमें योजना देखें), भी doxycycline के अभाव में उल्लेखनीय स्व-नवीकरण क्षमता प्रदर्शित (यानी । ट्रांसजेनिक याप अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति में) (चित्र 2E).

Figure 1
चित्र 1: प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं का अलगाव और स्तन स्टेम कोशिकाओं के प्रेरण । (क) प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व को पुनर्कार्यक्रम प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं को अपनाया । (ख) प्रतिनिधि FACS-भूखंडों एक ठेठ छंटाई प्रक्रिया को समझाने के लिए LD कोशिकाओं को शुद्ध । i) असंबद्ध कोशिकाएं जीवित कोशिकाओं (P1; नीला) के लिए आगे और साइड स्कैटर के अनुसार gated हैं; ii) जनसंख्या P1 तो इसके लिन प्रोफ़ाइल के अनुसार आगे gated है: वंश-ऋणात्मक कोशिकाओं (P2; धूसर) की उपजनसंख्या चयनित है, वंश-धनात्मक टेम कक्षों को छोड़कर; iii) जनसंख्या P2 तो एक EpCAMउच्च (पी 3; पीला + हरा) और एक EpCAMकम (P6; लाल) उपआबादी में अलग है; iv) पी 4 और P6 तो आगे gated है उनके CD61 के अनुसार/CD49f प्रोफाइल तीन उपजनसंख्याों में: EpCAMकमCD49fउच्चCD61- बेसल कोशिकाओं (P7; लाल), EpCAMउच्चCD49fकमCD61+ LP कोशिकाओं (P8; पीला) और EpCAMउच्चCD49fकमCD61- LD कोशिकाओं (P9; हरा) । (ग) छवियां LD कोशिकाओं की क्षमता के उदाहरण हैं, संकेत constructs से संक्रमित, स्तन कालोनियों के फार्म के लिए 15 दिन स्तन कॉलोनी माध्यम में बोने के बाद । केवल याप-एक्सप्रेस कोशिकाओं को कॉलोनी बनाने कोशिकाओं में बदल जाते हैं, जबकि नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं (EGFP संक्रमित) विकास के रूप में रहना-गिरफ्तार एकल कोशिकाओं । स्केल बार = ५० माइक्रोन । (D) (C) के रूप में, इंगित कक्षों की कॉलोनी बनाने की क्षमता का ठहराव । डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे है + s.d. और पांच स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि, छह तकनीकी प्रतिकृति के साथ प्रत्येक । (ङ) याप के प्रतिनिधि छवि-reyMaSCsed स्तन स्टेम सेल की तरह कोशिकाओं (organoid संस्कृति की स्थिति में 12 दिनों के बाद ताजा तीन आयामी १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स hydrogel में Doxycycline के अभाव में । स्केल बार = १०० माइक्रोन । (च) बेसल मार्कर K14 के लिए प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों (हरी) और चमकदार मार्कर K8 (लाल) organoids के संकेत कोशिकाओं से व्युत्पंन, organoid संस्कृति की स्थिति में 12 दिनों के बाद । स्केल बार = 10 माइक्रोन । यह आंकड़ा Panciera एट अल., २०१६1से reproduced है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्राथमिक अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के अलगाव और अग्नाशय progenitors की प्रेरण । (क) प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्राथमिक अग्नाशय exocrine कोष्ठकी कोशिकाओं reprogram करने के लिए अपनाया की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) प्राथमिक अग्नाशय acini के प्रतिनिधि छवि अलगाव प्रक्रिया के बाद बस (step 2.1.14) । कोष्ठकी तैयारी कोष्ठकी क्लस्टर के एक सजातीय निलंबन के रूप में प्रकट होना चाहिए, एकल कोशिकाओं की ंयूनतम उपस्थिति के साथ । स्केल बार = ४०० माइक्रोन । (ग) प्राथमिक अग्नाशय acini के प्रतिनिधि छवियां R26-rtTAM2 (ऊपरी पैनलों) से व्युत्पंनया R26-rtTAM2; tetO-यापS127A (कम पैनलों) चूहों और 3 में संस्कृति-डी कोलेजन मैं के साथ या बिना 5 दिनों के लिए hydrogel आधारित Doxycycline (मज़हब), के रूप में संकेत दिया । केवल याप-व्यक्त प्राथमिक acini Doxycycline अतिरिक्त के बाद पुटी की तरह organoid के रूप में बढ़ कोशिकाओं में कनवर्ट करें । स्केल बार्स = ७० माइक्रोन । (घ) अग्नाशय acini की क्षमता का ठहराव के रूप में (C) ट्रांसजेनिक याप पर प्रडक्टर organoids के रूप में । डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे है + s.d. और पांच स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, चार तकनीकी प्रतिकृति के साथ प्रदर्शन किया । (ङ) याप की प्रतिनिधि छवि-reprogramed कोशिकाओं की तरह (yDucts) ताजा तीन आयामी १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स hydrogel में तीन अंश के बाद Doxycycline के अभाव में । स्केल बार = १३० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राथमिक स्तन कोशिकाओं का अलगाव
Ca2 + chelating समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
EDTA ०.०२% w/
Pbs
कोलेजन मैं कोटिंग समाधान
एसिटिक एसिड 0.02 एन, पीएच 3, 23
चूहा पूंछ कोलेजन (कोटिंग) 1:50
Dispase समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
Dispase 5 मिलीग्राम/
Pbs
पृथक्करण माध्यम
DMEM: F12
Hyaluronidase स्टॉक समाधान ४०० यू/एमएल
कलम Strep/ 1x
स्टॉक समाधान collagenase I ६०० यू/एमएल
Haemolytic समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
एनएच4सीएल समाधान 1 भाग
TrisBase २०.६ g/L 9 भागों
७.२ को पीएच समायोजित करें
HBSS/पीएस 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
HBSS
कलम Strep/ 2x
Hyaluronidase स्टॉक समाधान फ़िल्टर ०.२ µm, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
गोजातीय परीक्षण (पाउडर) से Hyaluronidase २,००० यू/एमएल
सोडियम फॉस्फेट 1m पीएच 7.3 बफर
एनएच4सीएल समाधान अंब में स्टोर ।
H2O
एनएच4सीएल ७.१ g/L
७.६५ को पीएच समायोजित करें
सॉर्टिंग समाधान फ़िल्टर ०.२ µm, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
Bsa ०.१%
EDTA 1 मिमी
HEPES पीएच 7 25 एमएम
Pbs
मध्यम #1 धो लें
DMEM/F12
कलम Strep/ 1x
मध्यम #2 धो लें
DMEM/F12
FBS 5%
कलम Strep/ 1x
स्तन 2 डी संस्कृति मध्यम
DMEM/F12
FBS 2%
हेपरिन 4 मिलीग्राम/एमएल
L-Glutamine 1x
murine bFGF 10 एनजी/
murine EGF 10 एनजी/
कलम Strep/ 1x
इंडक्शन एण्ड Passaging ऑफ yMaSCs
स्तन कॉलोनी मध्यम
DMEM: F12
FBS 5%
हेपरिन 4 µ g/mL
L-Glutamine 1x
Matrigel (सीडिंग से पहले तुरंत जोड़ें) 5%
murine bFGF 20 एनजी/
murine EGF 10 एनजी/
कलम Strep/ 1x
स्तन Organoid माध्यम
उंनत DMEM: F12
B27 1x
GlutaMax 1x
हेपरिन 4 µ g/mL
Hepes 1x
ह्यूमन नोगिन १०० एनजी/
murine bEGF 20 एनजी/
murine EGF ५० एनजी/
आर-Spondin 1 1 µ g/mL

तालिका 1: yMaSCs की जनरेशन. सभी विभिंन संस्कृति मीडिया और प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं और yMaSCs की प्रेरण (खंड 1 के अलगाव के लिए आवश्यक समाधान की संरचना.)

प्राथमिक अग्नाशय acini के अलगाव
कोष्ठकी कल्चर मीडियम
BPE ५० µ g/mL
Bsa ०.१%
डेक्समेतएसॉनी 1 µ g/mL
FBS ०.१%
इसका-X 1x
कलम Strep/ 1x
SBTI ०.२ मिलीग्राम/एमएल
Waymouth के मध्यम
कोष्ठकी धो मध्यम
Bsa ०.१%
कलम Strep/ 1x
RPMI माध्यम
SBTI ०.२ मिलीग्राम/एमएल
कोष्ठकी वसूली माध्यम
कोष्ठकी कल्चर मीडियम
FBS 30%
Collagenase I हल एक
कोष्ठकी धो मध्यम
स्टॉक समाधान collagenase I ३६० यू/एमएल
पंजाब के पीएस/ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
पंजाब (फास्फेट-खारा)
कलम Strep/ 1x
स्टॉक समाधान collagenase I पर स्टोर-20 ° c
Collagenase, प्रकार I (चूर्ण) ६,००० यू/एमएल
Pbs
अग्नाशय organoids के Passaging
Collagenase हल ख
पंजाबन 1x
स्टॉक समाधान collagenase I २४० यू/एमएल
अग्नाशय Organoid माध्यम
उंनत DMEM/
B27 1x
गैस्ट्रीन 10 एनएम
ह्यूमन FGF10 १०० एनजी/
ह्यूमन नोगिन १०० एनजी/
murine EGF ५० एनजी/
एन-असेटयलस्यस्थेने १.२५ एमएम
Nicotinamide 10 एमएम
कलम Strep/ 1x
आर-Spondin 1 1 मिलीग्राम/एमएल
SBTI ०.२ मिलीग्राम/एमएल

तालिका 2: yDucts की जनरेशन. सभी विभिंन संस्कृति मीडिया और प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं और प्रेरण और yDucts (खंड 2 के passaging के अलगाव के लिए आवश्यक समाधान की संरचना.)

Discussion

यहां हम वर्तमान प्रोटोकॉल याप के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा उनके इसी ऊतक-विशिष्ट जनक कोशिकाओं (या ySCs) में विभिंन ऊतकों के पूर्व vivo अंतरित उपकला कोशिकाओं reprogram करने के लिए, के रूप में पहले1बताया । हम विस्तृत दो प्रक्रियाओं है: एक lentiviral वैक्टर के माध्यम से FACS-शुद्ध कोशिकाओं के reprogramming की अनुमति है और एक दूसरा एक कि वायरल संक्रमण से बचा जाता है और ट्रांसजेनिक याप अभिव्यक्ति का लाभ लेता है । प्रत्येक प्रोटोकॉल एक कुशल रणनीति को अलग और संस्कृति प्राथमिक विभेदित कोशिकाओं और exogenous याप विभेदित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए मजबूर करने के लिए एक रणनीति प्रस्तुत करता है, de नोवो दैहिक ऊतक पैदा विशिष्ट विस्तार योग्य स्टेम कोशिकाओं (देखें आंकड़े 1a और 2a) में योजनाएं ।

हम प्रदर्शन किया है कि अलगाव रणनीतियों यहां प्रस्तुत प्रभावी ढंग से विभेदित कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी को अलग, के रूप में तथ्य यह है कि हम कभी नहीं नकारात्मक नियंत्रण नमूनों से किसी भी वृद्धि का पता चला द्वारा प्रदर्शन (आंकड़े 1C और 2c) ।

lentiviral प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं के reprogramming के लिए इस अध्ययन में प्रयुक्त वैक्टर doxycycline inducible, transgene अभिव्यक्ति का एक तंग नियंत्रण की संभावना की पेशकश कर रहे हैं; यह exogenous पर याप अभिव्यक्ति चालू और बंद करने के लिए अनुमति देता है । विशेष रूप से ध्यान एक अत्यधिक वायरल titer के उपयोग से बचने में रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह reprogramming दक्षता के मामले में हानिकारक हो सकता है । प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के मामले में, हम एक पूरी तरह से ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण को बंद करने के लिए ंयूनतम जोड़तोड़ के साथ एक याप-निर्भर reprogramming प्राप्त करते हैं । इस उत्तरार्द्ध रणनीति प्राथमिक अग्नाशय acini के लिए भी विशेष रूप से उपयुक्त है, अलग कोष्ठकी समूहों के रूप में शायद ही lentiviral संक्रमण और बहुत नाजुक के लिए उत्तरदायी हैं. ट्रांसजेनिक रणनीति कार्यरत जीन अभिव्यक्ति के तंग नियंत्रण के लिए doxycycline-निर्भर lentiviral वैक्टर का ही लाभ प्रदान करता है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक प्राथमिक अग्नाशय acini के साथ शोषण की रणनीति एक बहुत उच्च reprogramming के वायरल की तुलना में दक्षता के अतिरिक्त लाभ भालू-स्तन LD कोशिकाओं के पुनः प्रोग्रामिंग प्रेरित । अलग आंतरिक विभिंन ऊतकों से व्युत्पंन कोशिकाओं से जुड़े प्लास्टिक के पार, अग्नाशय reprogramming की उच्च दर से प्राप्त किया जा सकता है अभिव्यक्ति की उच्च दक्षता से जुड़े सभी में वर्दी और स्वायत्त याप अभिव्यक्ति explanted कक्ष । विशेष रूप से, हम exogenous याप अब ySCs (yMaSC कालोनियों और yDucts) की पीढ़ी के बाद की आवश्यकता है, अपने स्वयं के नवीकरण की क्षमता को प्रभावित किए बिना प्रदर्शित किया है । इसका कारण यह है कि ySCs पुनः सक्रिय अंतर्जात याप/TAZ और उन्हें स्व-नवीकरण के लिए उपयोग करते समय exogenous याप बंद कर दिया जाता है1.

हम धारणा है कि ySCs वास्तव में आनुवंशिक वंश के माध्यम से हमारे reprogramming प्रयोगों की उत्पत्ति की कोशिका को नियंत्रित करने के द्वारा विभेदित कोशिकाओं से उभरने पुष्टि-वैध पता अनुरेखण1।

ySCs के व्यापक लक्षण वर्णन से पता चलता है कि याप प्रेरित reprogramming सामांय दैहिक SCs1 के रूप में transcriptomic स्तर पर उत्पंन करता है, ySCs प्रदर्शन बड़े पैमाने पर देशी SCs के साथ ओवरलैप; ii) ySCs प्रदर्शन अंतर क्षमता और एक multilineage संतति उत्पन्न कर सकते हैं हमेशा मूल के अपने ऊतक की पहचान करने के लिए प्रतिबंधित; iii) ySCs में गैर-रूपांतरित और गैर-tumorigenic होते है जब vivo मेंप्रत्यारोपण होता है ।

यहां हम भी प्रक्रियाओं का वर्णन को बनाए रखने और संस्कृति में विस्तार दोनों yMaSCs और yDucts organoids के रूप में १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स hydrogels में एंबेडेड । इन शर्तों स्वयं के लिए अनुमति ySCs के संगठन तीन आयामी organoids में है कि उपजी गुण लंबे समय के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति में अवधि, बहाव विश्लेषण और अनुप्रयोगों के लिए होगा पर इन स्टेम आबादी का विस्तार करने के लिए सक्षम करने से । अज्ञात कारणों के लिए, हम संक्रमित एलडी कोशिकाओं organoid संस्कृति की स्थिति में सीधे doxycycline प्लास्टिक ऊतक संस्कृति की थाली में उपचार के बाद 7 दिनों रखकर yMaSC organoids प्राप्त करने में विफल; दूसरे शब्दों में, स्तन कॉलोनी की स्थिति में मध्यवर्ती विकास कदम आवश्यक है । हमारे हाथ में, यहां तक कि देशी MaSCs organoid संस्कृति में passaging से पहले स्तन कॉलोनी शर्तों की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, सबसे कुशल organoid वृद्धि प्राप्त की है जब हम एक ही कक्ष में प्राथमिक कालोनियों dissociating से बचने के लिए, बल्कि organoid संस्कृति की स्थिति में बरकरार कालोनियों हस्तांतरण ।

Organoid कल्चरल स्थितियाँ भी cryopreserve ySCs को संभावना देने का लाभ वहन करते हैं, बशर्ते कि organoids को उनके मैट्रिक्स से बरामद कर लिया जाए, कोशिका पृथक्करण से परहेज करने से पहले नाइट्रोजन स्नान में cryopreservation.

याप reprogramming प्रक्रिया अलग विभेदित सेल उनके इसी ऊतक में विभिंन वयस्क ऊतकों से व्युत्पंन प्रकार विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं को परिवर्तित कर सकते है (हम इसे स्तन का उपयोग कर परीक्षण किया है, अग्नाशय और ंयूरॉन कोशिकाओं)1। iPSCs या अंय reprogramming प्रयासों से अंतर पर, याप/प्रेरित SCs मूल के अपने ऊतक की यादें बनाए रख सकते हैं । नोट की, स्टेम की तरह गुणों के साथ संपंन कोशिकाओं में दैहिक कोशिकाओं के de-भेदभाव सेल भाग्य प्लास्टिक और vivo में मनाया reprogramming के एकमात्र रूप है, उदाहरण के लिए ऊतक क्षति के बाद और घाव भरने का समर्थन करने के लिए5,17 , 18 , 19 , 20. यह उल्लेखनीय है कि याप और TAZ सामान्य homeostasis के लिए काफी हद तक औषधालय हैं लेकिन कई ऊतकों में ऊतक की मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं11,21. लगातार reprogramming कदम के एक शारीरिक समारोह के साथ यहां वर्णित है, याप/TAZ हाल ही में एक वयस्क आंत्र कोशिकाओं का रूपांतरण के कारण द्वारा अल्सरेटिव कोलाइटिस रोगियों के माउस मॉडल में आंत्र पुनर्जनन में आवश्यक हो दिखाया गया है एक मरंमत उपकला कि भ्रूण आंत19की सुविधाओं को प्रदर्शित करता है । याप reprogramming इस प्रकार एक दैहिक स्टेम सेल, एक राज्य है कि अब तक इन विट्रो मेंकब्जा करने के लिए चुनौतीपूर्ण है उत्पंन करने का साधन प्रदान करके वर्तमान प्रेरित सेल प्लास्टिक की रणनीतियों का विस्तार । यह दृष्टिकोण, मानव-व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए भी विस्तारित है, दैहिक उपजी स्थिति के अध्ययन के लिए और दैहिक स्टेम कोशिकाओं के विस्तार के लिए reअपक्षयी दवा अनुप्रयोगों से व्यापक प्रासंगिकता हो सकता है इन विट्रो में।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम tetO-यापS127A चूहों के उपहार के लिए F. Camargo धंयवाद; R26-rtTAM2 चूहों (स्टॉक #006965) को जैक्सन लेबोरेटरी से खरीदा गया । हम FACS प्रक्रियाओं के साथ मदद के लिए चियारा Frasson और ग्यूसेप Basso धंयवाद । यह काम AIRC विशेष कार्यक्रम आणविक नैदानिक ऑन्कोलॉजी ' ' 5 प्रति मिल ' ' और एक AIRC पीआई-एस. पी करने के लिए अनुदान द्वारा समर्थित है, और Epigenetics फ्लैगशिप परियोजना CNR-Miur अनुदान सपा के द्वारा इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ग्रांट एग्रीमेंट DENOVOSTEM No. ६७०१२६) के तहत यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) से फंडिंग मिली है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL sterile syringes Rays 10LC
100 mm  cell strainer Corning 352360
15 mL sterile conical tubes Corning 430052
24-well ultra low attachment plates Costar 3473
40 mm cell strainers Corning 352340
48-well multiwell plates Corning 353078
50 mL sterile conical tubes Corning 430290
6-well multiwell plates Corning 353046
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634028
B27 supplement (50x) Gibco 17504001
BPE Gibco 13028014
BSA Sigma A9418
Collagenase, type I Sigma 17018029
dexamethasone Sigma D4902 
Dispase Gibco 1705-041
Disposable scalpels Swann-Morton 0503
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma D2650
DnaseI Roche 11284932001
doxycycline hyclate Sigma D9891 
EDTA Sigma E5134
Ethanol 100% Sigma 51976
FACS tubes (with strainer caps) Falcon 352235
FBS Gibco 10270106
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) BioLegend 118208
FUdeltaGW-rtTA  Addgene  #19780 
FUW-tetO-EGFP Addgene  #84041 used as negative control
FUW-tetO-MCS Addgene  #84008 used as negative control
FUW-tetO-wtYAP Addgene  #84009
FUW-tetO-YAPS94A Addgene  #84010 used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)
GlutaMax Gibco 35050061
HBSS Gibco 24020117
HCl Sigma 30721
heparin sodium salt Sigma H3149 
HEPES buffer solution (1M) Gibco 15630-056
human R-Spondin1 (His Tag) Sino Biological 11083-H08H-5
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506 
ITS-X Gibco 51500056
K-14 antibody Life Technologies Ab7800 
K-8 antibody Life Technologies Ab14053 
L-Glutamine Gibco  25030081
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) BD Biosciences 51-9003632
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free Corning 356231
N-Acetylcysteine Sigma A9165
NaOH J.T.Baker 0402
NH4Cl Sigma A9434 
Nicotinamide Sigma 72340
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) ROLL 18248
PBS 10x Euroclone ECM4004XL
PE Hamster Anti-Mouse CD61 BD Biosciences 553347
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f BD Biosciences 551129
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody BioLegend 102222
Pen/Strep (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Rat Tail Collagen I (coating) Sigma 122-20
Rat Tail Collagen I for 3D culture Cultrex 3447-020-01 
recombinant human FGF10 Peprotech 100-26
recombinant human Noggin Peprotech 120-10C
recombinant murine EGF Peprotech 315-09
recombinant murine FGF basic (bFGF) Peprotech 450-33
RPMI 1640 medium Gibco 31870025
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) Sigma T6522 
Tris BASE  Roche 11814273001
Trypsin-EDTA 0,05% Gibco 25300054
Waymouth medium Gibco 31220023

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References

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जीव विज्ञान १३५ अंक याप/TAZ reprogramming ऊतक विशिष्ट स्टेम सेल स्तन ग्रंथि अग्ंयाशय organoids विभेदन
<em>De नोवो</em> याप/TAZ द्वारा दैहिक स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
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Panciera, T., Azzolin, L., Di… More

Panciera, T., Azzolin, L., Di Biagio, D., Totaro, A., Cordenonsi, M., Piccolo, S. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. J. Vis. Exp. (135), e57462, doi:10.3791/57462 (2018).

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