Summary
Наличие соматических СКС имеет решающее значение для регенеративной медицины, болезни моделирования и чтобы разобраться в SC свойства. Здесь мы представляем экспериментальных стратегий для перепрограммирования, в пробирке, дифференцированные клетки взрослого в их соответствующие клетки расширяемая ткани конкретных стволовых/прародитель переходных выражением единого транскрипционный анализ совместного активатор яп.
Abstract
Здесь мы представляем протоколы изоляции первичных дифференцированных клеток и превратить их в клетки (SCs) стволовых/прародитель той же линии переходных выражением транскрипционного фактора YAP. С помощью этого метода просветный дифференцированных клеток (LD) молочной железы мыши преобразуются в клетки, которые демонстрируют молекулярной и функциональных свойств молочной SCs. YAP также оказывается полностью дифференцированной поджелудочной экзокринной клетки в поджелудочной железы протока как прародителями. Аналогично для эндогенного, естественный SCs, яп индуцированных стволовых подобных клеток («ySCs») может быть в конечном счете расширена как органоид культур долгосрочной перспективе в пробирке, без дальнейшей необходимости внематочная YAP/таз, как ySCs наделены наследственные самостоятельного обновления СК как государства.
Перепрограммирования процедура, представленная здесь предлагает возможность создавать и расширять в пробирке клеток-предшественников различных источников тканей, начиная от дифференцированных клеток. Простое расширение соматические клетки ex vivo имеет последствия для регенеративной медицины, для понимания механизмов возбуждения опухоли и, в целом, для клеток и биология развития исследований.
Introduction
Ткани специфических соматических стволовых клеток (SCs) являются критическими для обновления тканей и ремонта после травмы. Возможность легко изолировать и бесконечно расширять ex vivo соматических SCs представляет критическую для потенциальных восстановительной терапии, а также для приложений SC в фундаментальные исследования и моделирование болезней. Прогресс в этом направлении, однако, было ограничено сложность захвата SC состояние различных органов эпителиального в пробирке. Действительно в нескольких взрослых тканях резидентов SCs может не существует, или не быть легко доступны, или их количество и регенеративный потенциал может подорваны условиях старения или болезни. В 2016 году, мы начали заполнить этот пробел, сообщая этим выражением единого transcriptional coactivator, YAP (да связанные белком) или его тесно связанных белков таз (транскрипционный анализ активатор с мотивом PDZ), в смертельно дифференцированных клеток эффективно создает функциональные, расширяемый, не опухолеобразования, аутологичных клеток населения, которые оперативно и молекулярно неотличимы от их соответствующих тканей конкретных СКС1. Импульс устойчивой YAP или таз деятельности за несколько дней достаточно, чтобы вызвать появление самостоятельного обновления соматических СКС. Это стабильное состояние, которая больше не зависит от непрерывной трансген выражение, как он может быть передан через поколения клетки без дальнейшего выражение внематочная YAP/таз1. Протокол здесь представлены детали, процедура используется для создания de novo эпителиальных стволовых/прародитель клеток молочной железы и поджелудочной железы, начиная от дифференцированных клеток этих тканей. Эта процедура заполняет черный ящик текущего перепрограммирование/transdifferentiation арене. Основные усилия в этих направлениях действительно пока сосредоточена на ячейку перехода к индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) состояние, последующим преобразованием этих эмбриональных и плюрипотентных СКС в более дифференцированных клеток. Однако iPSCs онкогенной раз представил во взрослых тканях, поднимая потребность разработки протоколов для их полного и эффективного дифференцирования2. Однако этот шаг дифференциации, даже тогда, когда это возможно, приходит по цене долгосрочных расширяемость, самоорганизации и органа заселение потенциалов. Они являются обязательными атрибутами для регенерации органов, которые в действительности являются типичными только эндогенного ткани конкретных СКС и в настоящее время описано яп индуцированной СКС (ySCs). Аналогичным образом прямой transdifferentiation типа одной ячейки в другую с помощью коктейли, различные транскрипции, которые факторы также создают дифференцированных клеток, которые не располагают необходимым пролиферативных и stemness потенциальных3.
Процедура, описанная здесь также использует недавно представила органоид технологии, в которой эндогенного SCs может быть расширена и дифференцированной ex vivo4. YAP-индуцированной SCs может генерировать органоид формирование СКС даже в экспериментальных, биологические или болезни условий, в которых эндогенного SCs не присутствуют. Мы хотели бы отметить, что на разницу с другими перепрограммирования процедурами, тип клеток пластичность придали YAP может соответствовать единственной формой реверсии СК как статус, который происходит в живых тканях. Уменьшаем SC-как черт был связан с ткани ремонт или онкогенных активации5. Хотя необязательным для гомеостаза нескольких взрослых тканях, YAP и/или таз абсолютно необходимы для регенерации, рост опухоли и расширения соматических СКС в пробирке1,,6,7,,8 ,9,10,11,12
Protocol
Все животные процедуры выполнялись придерживаясь наших институциональных руководящих принципов и одобренные OPBA и Министерство здравоохранения
1. поколение яп индуцированной молочной как стволовые клетки (yMaSCs)
Примечание: Все средства массовой информации и решение композиции для раздела 1 указываются в таблице 1.
- Изоляция первичного молочной клеточных популяций
- Подготовка под капотом культуры клеток: одноразовые скальпели, гиалуронидаза решения, диссоциация средний, Гемолитический решения, сортировки решения, коллагена, покрытие решение, Ca2 + хелатирующий решение, мыть среднего #1, мыть средних #2, dispase решение, молочной железы 2D питательной среды, лед холодной HBSS/ПС.
- Для типичной эксперимента Пожертвуйте 10 самок мышей (либо CD-1 штамм C57BL/6), 8-12 недель, шейки матки дислокации. Стерилизуйте живота с обильным 70% этанола раствор до вскрытия.
- Вскрыть молочных желез, сделав Y-образный разрез вдоль брюшной кожи и тщательно разделяющей желез из брюшины, осторожно потянув пинцетом Дюмон. Место расчлененных желез в-клеток клей блюдо с 10 мл лед холодной HBSS/PS (20 желез для каждого блюдо), убедившись, что не выполнять над любой фрагмент кожи.
- Под капотом культуры ткани стирать каждый железы один раз в 10 мл свежего HBSS/PS и поместите их в пустой клей блюдо-клеток (20 желез для каждого блюдо). Не используйте культуры ткани пластины, как клетки будут склонны придерживаться их вызывая значительные потери материала.
- Мелко фарш молочных желез с скальпелей до получения однородной смеси 1 мм3 фрагментов. Восстановить фарш ткани от каждого блюдо в 10 мл среды диссоциации с 25 мл Серологические Пипетки чтобы избежать засорения и передачи подвеска в 50 мл Конические трубки дозирование по крайней мере 5 x дезагрегировать ткани сгустки.
Примечание: Для эффективного переваривания, надлежащего мясорубки ткани в шаге 1.1.5 имеет решающее значение. - Инкубируйте 1 час при 37 ° C с непрерывной энергичной встряхивания. Через 1 ч проверьте огневки и продлить инкубации на 10 минут, если сгустки по-прежнему присутствуют. Спин вниз переваривается ткани на 400 g x 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле ткани в 3 мл гемолитический раствора и Инкубируйте 3 мин на льду.
Примечание: Гемолиз настолько довольно жестокое обращение, строгие сроки имеет решающее значение на этом этапе. - Вымыть клетки с 10 мл мыть среды #1, спина вниз переваривается ткани на 400 x g 5 минут и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле ткани в 10 мл мыть средних # 2 и пластины в 10 см культуры ткани блюда. Инкубируйте блюда за 1 ч при 37 ° C в инкубатор культуры клеток.
Примечание: Этот шаг позволит удаления большинства фибробластов, которых должны придерживаться культуры блюдо. - Восстановить суспензию клеток из блюд и вылить в 50 мл Конические трубки. Спина на 400 g x 5 мин и ликвидации супернатант. Помыть лепешка дважды в 10 мл Ca2 + Хелатирующие решение на спиннинг вниз на 400 x g 5 минут каждый раз. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл 0,25% трипсина/ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
- Добавьте 5 мл dispase раствора на вершине раствор трипсина и дополнить с DNase 1μg/мл. Пипетка вверх и вниз по крайней мере 5 x через 1 мл наконечник дезагрегировать ДНК пряди и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C, пожимая каждые 3 мин.
- Добавьте 10 мл мыть среды #2 и фильтр в новой 50 мл Конические трубки через стрейнер клеток 40 мкм. Спин вниз суспензию клеток на 400 g x 5 мин и отбросить супернатанта, убедившись в том устранить все жидкости.
- Очистка молочной эпителиальных клеток, СУИМ
- Подготовьте смесь антител, добавив 10 мкл Лин (антитела мыши линии коктейль), 12 мкл анти CD326 (Ep-CAM), до конечной концентрации 30 нг/мл, 10 мкл анти CD49f, до конечной концентрации 25 нг/мл, 10 мкл анти CD61, до конечной концентрации 10 нг/мл , 2,5 мкл анти CD29, до конечной концентрации 2,5 нг/мл.
Примечание: от этого шага к шагу 1.3, всегда работают в темноте, чтобы избежать отбеливания дневно обозначенные антител. Для каждой гранулы: - Храните небольшое количество клеток (погружением кончик 100 мкл в гранулах) в отдельном трубку. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл сортировки решение в трубке СУИМ и держать на льду как немеченого образца для СУИМ процедуры.
- Ресуспензируйте каждой гранулы в 200 мкл мыть среды #1, добавить 44.5 мкл антител смеси, Пипетка тщательно и Инкубируйте 30 мин на льду в темноте. Разбавления суспензии клеток в 10 мл мыть среды #1, спина вниз на 400 g x 5 минут и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл раствора сортировки и фильтра через Кап ситечко СУИМ tubeand приступить к FACS-сепарации клеточных популяций (как показано на рисунке 1B). Перед выполнением протокола многоцветной СУИМ, убедитесь, что правильно для возможного распространения каждого флюрохром в каждой из других. Чтобы сделать это, инкубировать каждое антитело проспряганное Флюорофор отдельно с суспензию клеток и измерения спектрального наложения значения для всех флуорофоров и всех детекторов, через элементов одного цвета, чтобы создать матрицу компенсации.
Примечание: В этом эксперименте использовалась сортировщик с 85 мкм сопла. Типичная подготовки от 10 самок мышей даст около 800000 LD клетки. Перейти к вторичной фильтрации, если сгустки форме в ходе процедуры СУИМ.
- Подготовьте смесь антител, добавив 10 мкл Лин (антитела мыши линии коктейль), 12 мкл анти CD326 (Ep-CAM), до конечной концентрации 30 нг/мл, 10 мкл анти CD49f, до конечной концентрации 25 нг/мл, 10 мкл анти CD61, до конечной концентрации 10 нг/мл , 2,5 мкл анти CD29, до конечной концентрации 2,5 нг/мл.
- Заполнение первичных клеток молочной железы LD
- Во время процедуры СУИМ пальто multi хорошо культуры ткани пластины с коллагеном я покрытие решения. Инкубируйте 1 час при 37 ° C, 5% CO2 в инкубатор культуры клеток. Удалите покрытие решение и промойте среднего #1 мыть перед обшивкой.
- Вымыть клетки, оправился от СУИМ процедуры с 10 мл промывочного раствора #1, спина вниз 400 g x 5 мин и ликвидации супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток молочной 2D питательной среды (500 мкл/а) и коллаген лечение пластины. Пусть сидеть в инкубатор культуры клеток в течение 48 часов для обеспечения надлежащего клеток вложений и распространения клеток.
Примечание: Для типичного сортировки от 10 самок мышей, 6-8 скважин 24-ну multi хорошо плиты даст плотность оптимальный клеток (100 000 клеток/хорошо).
- Индукция yMaSCs (яп индуцированной молочной стволовые клетки)
Примечание: От этого шага все процедуры должны выполняться в условиях BSL-2.- Подготовка среднего молочной колонии. Свеже добавьте матрицу базальной мембраны в среду незадолго до заполнения ячейки.
- Для индукции яп индуцированной молочной стволовых клеток (yMaSCs) передают первичных клеток LD лентивирусные инфекции путем смешивания один объем FUdeltaGW-rtTA вирусных супернатанта, один объем супернатант FUW-Тето Яп (или таз), два тома из молочной сыворотки бесплатно 2D культуры среднего 2 x концентрации добавки, в общем объеме 500 мл. Инкубируйте клетки с лентивирусные supernatants за 48 ч. Для типичной лентивирусные подготовки пожалуйста, обратитесь к онлайн протокол22.
- После заражения мыть адэрентных клеток и лечения с молочной 2D питательной среды, дополнена 2 мкг/мл доксициклин побудить экзогенных экспрессии генов YAP (или таз). Используйте клетки, зараженные с пустым, EGFP или YAPS94A выражая вектора или клетки, инфицированные индуцибельной YAP (или таз) векторов, но уехала без доксициклин как негативный контроль.
Примечание: Успешное инфекции может быть проверен qRT ПЦР с праймерами специфическими для человека YAP трансген, как описано выше1. - После 7 дней индукции с доксициклин, отсоединить адэрентных клеток, инкубация с 0,05% трипсина/ЭДТА (150 мкл/ну) 10 минут при 37 ° C; остановить trypsinization путем разбавления 1:5 в среде мыть #2 (600 мкл/а) и подсчитать ячейки. Ресуспензируйте клеток в среде молочной колонии (1 мл раствора для каждой скважины), дополнены 2 мкг/мл доксициклин и семян на колониеобразования плотности 1000 клеток/хорошо в 24-ну сверхнизких крепежные пластины.
Примечание: Убедитесь, что средство молочной колонии ледяной в то время сложения матриц базальной мембраны. Матрица базальной мембраны должны всегда храниться в-20 ° C по прибытии и талой медленно при температуре 4 ° C на ночь; После размораживания, он должен всегда осуществляться на льду, согласно рекомендациям производителя. - Однажды YAP-выражая LD клетки начать пролиферирующих и расти как MaSC как колоний в суспензии (yMaSC колоний) (14 дней после посева), рассчитывать и обрабатывать для дальнейшего анализа (рис. 1 c).
Примечание: Отрицательный контроль клетки (как в пункте 1.4.3) будет оставаться как отдельные клетки. - Пополнять культуры с свежей молочной колонии среднего каждые 72 ч в течение 14 дней yMaSC колонии роста; для этого подготовить Алиготе молочной колонии среды без матрицы 5% базальной мембраны, дополнена 10 x концентрации добавок и добавить 1:10 от общего объема для каждой скважины (например 100 мкл в 1 мл общей среды), чтобы избежать чрезмерного разбавления Матрица подвеска.
- Югу культивирования yMaSCs
- Восстановить основной колоний от среднего молочной колонии, затем отделить и повторное заполнение.
Примечание: yMaSC колонии, производный от яп перепрограммирование LD клетки приобретают самообновлению потенциала и может быть успешно югу культивировали, без дальнейшего доксициклин администрации (т.е. независимо от выражения трансгенных YAP/таз). - Подготовьте, под капотом культуры клеток, молочной колонии среднего как шаг 1.4.1 и молочной органоид среднего.
- Собирать каждый образец и инкубировать в избыточного количества льда (10:1) и холодной HBSS за 1 час на льду, для того чтобы солюбилизировать последнего матрице базальной мембраны. Вымойте колоний 3 x центрифугированием на 180 g x 5 мин и Ресуспензируйте в лед холодной HBSS. Инкубируйте колоний в 0,05% трипсина/ЭДТА 10 минут при 37 ° C для получения одной ячейки подвеска. Пипетка колонии вверх и вниз 10 x с наконечником p1000 для обеспечения полной диссоциации одной ячейки уровня.
- Граф и повторное заполнение клеток в среде молочной колонии (1 мл раствора для каждой скважины) без доксициклин на колониеобразования плотности 1000 клеток/хорошо в 24-ну сверхнизких крепежные пластины. Повторите это, пассированый процедура каждые 10-14 дней, чтобы оценить самообновления.
- До третьего проход проезд yMaSC колонии в условиях культуры органоид, для повышения yMaSC расширения и возможность для формирования мини желез, которые самостоятельно организовать в bilayered эпителия, тесно напоминает в vivo молочной железы Гистологические Организации.
- Восстановление колоний от среднего молочной колонии как шаг 1.5.3 в 1.5.4. Ресуспензируйте колоний в фактор роста 100% Снижение базальной мембраны матрицы, учитывая replate максимум 20-25 колоний для каждой скважины 24-ну сверхнизких крепежную пластину в 150 мкл матрицы.
- Инкубировать пластины в инкубатор культуры клеток на 40 минут при 37 ° C и пусть базальной мембраны матрица затвердеть и затем наложить гели с 500 мкл молочной органоид среды.
- После нескольких дней проверить для формирования колоний к форме многообещающий organoids (Рисунок 1E).
- После 10-14 дней, проход или процесс organoids для дальнейшего анализа.
- Для прохода organoids культур, восстановить organoids, собирая каждый образец и инкубации избыточного объема (10:1) льда холодной HBSS за 1 час на льду, для того чтобы солюбилизировать последнего матрице базальной мембраны. Вымойте organoids 3 x, спин вниз на 180 g x 5 мин и Ресуспензируйте в лед холодной HBSS.
- Инкубируйте organoids в 0,05% трипсина/ЭДТА 10 минут при 37 ° C для получения одной ячейки подвеска. Пипетка organoids вверх и вниз 10 x с наконечником p1000 для обеспечения полной диссоциации одной ячейки уровня.
- Повторное заполнение одну ячейку суспензий в каплю фактор роста 100% Снижение базальной мембраны матрицы (150 мкл для каждой скважины 24-ну сверхнизких крепежную пластину). Пусть матрице базальной мембраны образуют гель по инкубации 40 мин при 37 ° C в инкубатор культуры клеток и наложение гели с 500 мкл молочной органоид среды.
Примечание: yMaSC organoids может быть криоконсервированных путем восстановления из 100% базальной мембраны матрица культуры как шаг 1.5.13, избегая trypsinization. Хранить в среде молочной органоид, дополнена 10% ДМСО. - Быстро замораживания organoids yMaSC-80 ° c и затем сохранены в жидком азоте.
- Восстановить основной колоний от среднего молочной колонии, затем отделить и повторное заполнение.
2. поколение yDucts
Примечание: Все средства массовой информации и решение композиции для раздела 2, указаны в таблице 2.
- Изоляция первичного ацинусов поджелудочной железы
- Место вскрытия щипцы и ножницы в 70% EtOH и подготовить под клетки культуры капот ацинарной питательной среды, 15 мл для каждой мыши; железистый восстановления среды, 60 мл для каждой мыши; PBS/PS; Стоковый раствор коллагеназы я; коллагеназы я раствор А, 15 мл для каждой мыши; нейтрализовать крысы хвост коллаген я решение. Нейтрализовать крысы хвост коллаген I к рН = 7, регулируя сначала с 0,1 Н NaOH в буфер уксусной кислоты, в которой растворяется коллагена, а затем с 10N HCl. развести до 2,5 мг/мл в PBS/PS. держать коллаген хвост крысы, я и все реагенты на льду, чтобы нейтрализовать его. Пожертвуйте 6-9 недель old мышей надлежащего генотипа.
- Поместите каждую мышь на его обратно и мыть живот с 70% этанола раствор. Сделайте продольный разрез вдоль брюшной стенки. Найдите и вскрыть поджелудочной железы (с помощью Хандра как руководство) и поместите его в 10 см-клеточной клей блюдо в 10 мл лед холодной PBS/PS. передачи блюда сразу под капотом культуры клеток. От этого шага работа всегда под капотом культуры клеток.
- Перевод каждого поджелудочной железы в новую ячейку клей блюдо, ранее заполнены с 7 мл коллагеназы я решение а.
- Быстро фарш каждый поджелудочной железы с парой одноразовые скальпели, для получения однородной ткань подвеска примерно 1 мм3 фрагментов.
Примечание: Важно отметить, что эта процедура должен занять не более 2 мин для жизнеспособности клеток оптимального. - Инкубируйте блюдо для коллагеназы пищеварение при 37 ° C, 5% CO2 в инкубатор культуры клеток за 10 мин, пожимая каждые 3 мин для обеспечения однородной ткани пищеварение.
- Восстановить переваривается ткани в 50 мл Конические трубки (один для каждого поджелудочной железы), мыть блюдо с 10 мл ацинарной мыть среды и поместите его в же 50 мл Конические трубки, закупорить переваривается ткани вверх и вниз, не более, чем 3 x.
- Спин вниз переваривается ткани на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант.
Примечание: Спин вниз клетки на 18 ° C до снижения активности коллагеназы во время этого шага. - Ресуспензируйте ткани пеллет в 7 мл коллагеназы решение A и вылить это решение в новое блюдо клей-клеток 10 см.
- Инкубируйте блюдо для второго раунда коллагеназы пищеварения при 37 ° C 10 мин как шаг 2.1.5, пожимая каждые 3 мин для обеспечения однородной ткани пищеварение. В то же время готовить один чистый 50 мл Конические трубки для каждого поджелудочной железы, увенчанный стрейнер ячейки 100 мкм.
- Восстановить переваривается ткани и проходят через сито ячейки 100 мкм, размягчения тканей с поршень шприца стерильные 10 мл (не забудьте тщательно прижмите ткани, избегая сдвига касательной к поверхности фильтра). Вымойте блюдо с 10 мл среды ацинарной мыть и пройти этот 10 мл через ячейки 100 мкм же сетчатый фильтр.
- Спин вниз переваривается ткани на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант.
- Восстановите ткани лепешка с 10 мл среды ацинарной мыть. Передача решения клеток в 50 мл Конические трубки, уже содержащий дополнительные 10 мл свежего ацинарной мыть среды, избегая чрезмерного закупорить ресуспендирования гранул.
- Спин вниз переваривается ткани на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант.
- Тщательно Ресуспензируйте переваривается ткани в 6 мл ацинарной восстановления среды и распространять его в 2 скважин 6-ну multi хорошо культуры ткани пластины, 3 мл. Под стереомикроскопом тщательно оценить качество ацинарной изоляции, которые появляются как однородная суспензия ацинарной кластеров, с незначительных долей единичных клеток (см. Рисунок 2B); Удалите любой большой ткани сгустки в конечном итоге настоящее время (обычно видна также невооруженным глазом), закупорить их из раствора.
- Заполнение основной ацинусов поджелудочной железы
- Инкубируйте переваривается ацинарной кластеров при 37 ° C в инкубатор культуры клеток для 2 h, чтобы позволить для восстановления клеток.
- Во время восстановления слой клеток 48-ну multi скважины с 100 мкл нейтрализованы крысы хвост коллагена я и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C в инкубатор культуры клеток разрешить гидрогеля подушку в форме.
- После того, как 2 h восстановления клеток, собирать железистый клетки подвеска в коническую пробирку, уменьшается на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Ацинусы в соответствующий объем ацинарной питательной среды (150 мкл для каждой скважины плиты 48 хорошо культуры тканей). Семя каждый отделить поджелудочной железы в 16 скважин для получения оптимальной плотности (100-120 ацинарной кластеры/хорошо).
- Разбавляют этот ацинарной подвеска с равным объемом нейтрализованы крысы хвост коллагена я решения, сохраняя трубы на льду. Тщательно перемешать и быстро семян суспензию клеток поверх подушки коллагена, описанные в 2.2.2 (300 мкл для каждой скважины 48 хорошо multi хорошо культуры ткани пластины).
- Инкубируйте 1 час при 37 ° C в инкубатор культуры клеток разрешить гидрогеля на форме.
- Индукция поджелудочной железы organoids
- Наложение гидрогели коллаген с 500 мкл из ацинарной питательной среды с 2 мкг/мл доксициклин для индукции яп зависимые поджелудочной железы organoids от R26-rtTAM2; Тето-япS127A мышей; негативный контроль обеспечиваются wt клетки культивировали в том же условия или R26-rtTAM2; Тето-япS127A клетки культивировали в отсутствие доксициклин.
- Железистый клетки культуры в железистый Культура средних дополнена 2 мкг/мл доксициклин для 5-7 дней освежающий питательной среды (300 мкл/хорошо) каждые 48 ч и после формирования органоид морфологические изменения в направлении кисты, образуя протоковой как структуры ( Рисунок 2 c). После того, как образуются organoids, клетки могут быть пассированной в условиях культуры поджелудочной железы органоид или собирают для дальнейшего анализа (например: извлечение RNA, иммунофлюоресценции).
- Югу культивирование поджелудочной железы organoids
- Для оценки их способности самообновления, клонально проход яп индуцированной поджелудочной железы organoids (yDucts) в трехмерной базальной мембраны матрица гидрогели (поджелудочной органоид культуры условия) независимо от внешних поставок YAP/таз (т.е. независимо от администрации Доксициклин).
- Подготовить трипсина 0,05%/EDTA; фактор роста 100% Снижение базальной мембраны матрица; Поджелудочной железы органоид среднего и коллагеназы я раствор б.
- Подготовка 15 мл Конические трубки с 4 мл коллагеназы решение B для каждой скважины быть пассированной.
- Отказаться от питательной среды, тщательно извлекать гидрогели из скважин нежный стремлением и передавать их на конические трубы.
- Инкубируйте трубы при 37 ° C за 30 минут, с непрерывной энергичной пожимая разрешить полное переваривание коллагеновой матрицы (проверить каждые 10 мин до тех пор, пока гидрогеля полностью солюбилизирован). Спин вниз восстановленные клетки на 750 g x 2 мин и удалить супернатант.
- Инкубировать восстановленные клеток в 1 мл трипсина 0,05%/EDTA течение 10 минут при 37 ° C для получения одной ячейки подвеска. Разбавить трипсина с 9 мл PBS 1 x, спина вниз на 750 g x 2 мин и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в лед холодной фактор роста снижение базальной мембраны матрицы и семян в ультра-низким крепежные пластины (обычно капля 150 мкл в одной скважине 24-ну плиты).
- Пусть базальной мембраны матрица гидрогеля затвердевают при инкубации пластины в инкубатор культуры клеток 40 мин при 37 ° C и затем оверлея с поджелудочной железы органоид среднего (500 мкл для каждой скважины). yDucts будет расти как organoids киста как в 7-10 дней (Рисунок 2D).
- Для дальнейшего пассированый organoids может быть удален из базальной мембраны матрицы по инкубации в лед холодной PBS 1 x 30 мин, затем промывкой 3 раза спин вниз на 180 g x 5 мин и ресуспендирования в лед холодной PBS 1 x, чтобы избежать матрицы уноса. Organoids затем отделить с трипсином 0,05% за 10 мин до получения единичных клеток подвеска и заполнения в матрице свежие базальной мембраны и затем обложил с поджелудочной железы органоид среднего (как 2.4.7-2.4.8).
- yDuct organoids можно замораживают в жидком азоте путем восстановления из 100% базальной мембраны матрица культуры как шаг 2.4.9, избегая trypsinization, и хранение в поджелудочной органоид среднего дополнена 10% ДМСО.
- yDuct organoids быстро замороженные при температуре-80 ° и затем сохранены в жидком азоте.
Representative Results
Поколение yMaSCs
На рисунке 1Aпредставлен обзор экспериментальной стратегии для перепрограммирования первичных клеток молочной железы LD переходных выражением яп. Основная молочной железы клетки эпителия LD очищаются люминесцентные активации клеток, сортировка13. Рисунок 1B представляет Типичная процедура сортировки получить три различных субпопуляций: базальных клеток (EpCAMнизкойCD49fвысокойCD61–), просветный Progenitor (LP) клетки (EpCAMвысокойCD49fнизкойCD61+ ) и LD клетки (EpCAMвысокойCD49fнизкойCD61–). Тщательное стробирования три субпопуляции необходимо изолировать чистого препарата LD клеток, что полностью продифференцированы и полностью роста арестован, когда посеян в колонии молочной железы, формирование условий (см. Рисунок 1 c, левая панель). И наоборот когда вынуждены выразить экзогенных YAP, LD клетки начинают пролиферирующих сформировать легко узнаваемые плотной эпителиальных колоний в 5% базальной мембраны матрица подвеска культур (рис. 1 c). Эффективность перепрограммирование, заверенная около 3% для типичных эксперимент, может быть забит, подсчитывая количество колоний за количество единичных клеток, первоначально посеян в базальной мембраны матрица подвеска культур (рис. 1 d). Перепрограммировать Люминал клетки (yMaSCs) может быть проход в 100% базальной мембраны матрица органоид культуры условий (см. схему на рис. 1а), самоорганизации в сложных органоид как структуры, которые развиваются вокруг нескольких люменов и Отображение замечательной способности самообновлению даже в отсутствие доксициклин (т.е. в отсутствие экспрессии трансгенных яп) (Рисунок 1E). Гистологически yMaSC производные organoids отображения базальный слой (K14 положительные), сталкивается с базальной мембраны матрица воссоздана ECM и просветный слой (K8 положительных), стоящих перед полости люмен как в рамках органоид (Рисунок 1F). Эта архитектура неотличима от что organoids формируется родной MaSCs (Рисунок 1F).
Поколение yDucts
На рисунке 2Aпредставлен обзор экспериментальной стратегии перепрограммировать первичной ацинусов поджелудочной железы переходных выражением яп. Весь ацинарной кластеры изолированы от основную часть ткани поджелудочной железы сочетание мягкого диссоциации и размер социального отчуждения посредством фильтрации. Типичная подготовка представлена на рисунке 2B. После изоляции железистый клетки кластеры должны отображаться как подвеска экзокринной ацинарной единиц однородной размера, с не загрязнение эндокринной островков Лангерганса или фрагменты протока поджелудочной железы дерево и минимальным диссоциации в отдельные ячейки. Загрязнение эндокринной островков или протоковой фрагментов является свидетельством недостаточно выборочной фильтрации (шаг 2.1.10), возможно из-за суровых обработки; нежелательные диссоциации ацинарной кластеров в отдельные ячейки может быть вызвано чрезмерным коллагеназы лечения или небуферизованная активность протеолитических ферментов, выпущенная ткани, которая может быть искоренены путем дополнительного лечения SBTI.
Типичный ацинарной перепрограммирования эксперимента представлены в Рисунок 2 c; в течение 5-7 дней культуры в 3D коллаген-я основан, гидрогеля присутствии доксициклин, поджелудочной ацинусов, производные от R26-rtTAM2/Тето япS127A мышей легко превратить в проток как кластеры (что мы назвали yDucts), состоящая из тонкой однослойная эпителиальных клеток, которые размножаются вокруг расширения Центральной полости. Перепрограммирования эффективность, которая составляет около 70% для типичной эксперимента, можно легко измеряется забил количество кластеров протока как более общее количество посеянных Ацинусы (Рисунок 2D). Отрицательный контроль клетки, то есть R26-rtTAM2 / + клетки или клетки R26-rtTAM2/Тето япS127A осталось без доксициклин, неизменно остаются как пост митотическая ацинарной кластеры в этих условиях культуры, как сообщалось ранее1 ,14,15. Перепрограммировать yDucts затем может быть пассированной на уровне отдельной ячейки в условиях культуры на основе Matrigel органоид16 (см. схему на рис. 2A), отображение замечательной способности самообновлению даже в отсутствие доксициклин (т.е. в отсутствие экспрессии трансгенных яп) (рис. 2е).
Рисунок 1: Изоляции первичных молочной LD клетки и индукции молочной стволовых клеток. (A) схематическое представление экспериментальной процедуры принял перепрограммировать первичных клеток молочной железы LD. (B) представитель СУИМ участки иллюстрирующие Типичная процедура сортировки для очистки LD клеток. i) диссоциированных клетки являются воротами согласно вперед и боковых разброс для живых клеток (P1 синий); II) населения P1 затем Далее закрытого согласно его Линь профиля: субпопуляции Lineage отрицательные клетки (P2; серый) выбран, исключая Lineage позитивные гемопоэтические клетки; III) населения P2 затем разделяется на EpCAMвысокий (P3; желтый + зеленый) инизкого (P6; красный) субпопуляции EpCAM; IV) P3 и P6 затем Далее закрытого по их профилю CD61/CD49f на три субпопуляции: EpCAMнизкойCD49fвысокойCD61– базальных клеток (P7; красный), EpCAMвысокойCD49fнизкойCD61+ LP клетки (P8; желтый) и EpCAMвысокихCD49fнизкойCD61 клетки LD– (P9; зеленый). (C) изображения являются иллюстрацией LD клеток, инфицированных с помощью указанных конструкций, способность образовывать молочной колоний 15 дней после посева в среде молочной колонии. YAP-выражая клетки превращаются в колонии формируя клетки, тогда как отрицательный контроль клетки (EGFP-инфицированных) остаются только как отдельные клетки, рост арестован. Шкалы бар = 50 мкм. Количественное определение (D) колонии, формирование способности указанных клеток, как и (C). Данные представлены в виде mean + с.д. и представитель пяти независимых экспериментов, каждый с шести технических реплицирует. (E) представитель изображение яп перепрограммирование молочной стволовых клеток подобных клеток (yMaSCs) после 12 дней в условиях культуры органоид в свежих трехмерной 100% базальной мембраны матрица Гидрогель в отсутствие доксициклин. Шкалы бар = 100 мкм. (F) изображения представитель иммунофлюоресценции для базальной маркер K14 (зеленый) и маркер Люминал K8 (красный) organoids производным от указанной ячейки, после 12 дней в условиях культуры органоид. Шкалы бар = 10 мкм. Эта цифра воспроизводится от Panciera et al., 2016-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Изоляции первичных клеток поджелудочной железы железистый и индукции поджелудочной железы прародителей. (A) схематическое представление экспериментальной процедуры принял перепрограммировать первичной поджелудочной экзокринной железистый клетки. (B) представитель изображение первичного ацинусов поджелудочной железы сразу после процедуры изоляции (шаг 2.1.14). Железистый подготовки должен появиться виде однородной суспензии ацинарной кластеров, с минимальным присутствием одиночных клеток. Шкалы бар = 400 мкм. (C) представитель изображения первичного ацинусов поджелудочной железы, производный от R26-rtTAM2 (верхней панели)или R26-rtTAM2; Тето япS127A (нижняя панели) мышах и культивировали в 3-D коллаген I-на основе гидрогеля на 5 дней, с или без Доксициклин (doxy), как указано. Только Яп выражая первичной Ацинусы преобразовать ячейки, растущих как киста как органоид после добавления доксициклин. Масштаб баров = 70 мкм. (D) количественная оценка ацинусов поджелудочной железы способность образовывать протоковой organoids после трансгенных YAP гиперэкспрессия как и (C). Данные представлены в виде mean + с.д. и представитель пяти независимых экспериментов, выполненных с четырех технических реплицирует. (E) представитель изображение яп reprogramed протока подобных клеток (yDucts) после трех проходов в свежих трехмерной 100% базальной мембраны матрица Гидрогель в отсутствие доксициклин. Шкалы бар = 130 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Изоляции первичных клеток молочной железы | |
| CA2 + Хелатирующие решение | Хранить при 4 ° C |
| ЭДТА | 0,02% w/V |
| PBS | |
| Коллаген я покрытие решения | |
| Уксусная кислота 0.02N, рН 3,23 | |
| Крысы хвост коллагена (покрытие) | 1:50 |
| Dispase решение | Хранить при 4 ° C |
| Dispase | 5 мг/мл |
| PBS | |
| Диссоциация среднего | |
| DMEM:F12 | |
| Стоковый раствор гиалуронидаза | 400 ед/мл |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| Стоковый раствор коллагеназы я | 600 ед/мл |
| Гемолитическая решение | Хранить при 4 ° C |
| NH4Cl решение | 1 части |
| TrisBase 20.6 g/L | 9 частей |
| Отрегулируйте пэ-аш до 7,2 | |
| HBSS/PS | Хранить при 4 ° C |
| HBSS | |
| Ручка/стрептококк | 2 x |
| Стоковый раствор гиалуронидаза | Фильтра 0,2 мкм, хранить при 4 ° C |
| Гиалуронидаза от семенников крупного рогатого скота (порошок) | 2 000 ед/мл |
| Натрия фосфат буфер 1 M pH7.3 | |
| NH4Cl решение | Хранить при т. amb. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7.1 г/Л |
| Отрегулируйте пэ-аш до 7,65 | |
| Сортировка решение | Фильтра 0,2 мкм, хранить при 4 ° C |
| BSA | 0,1% |
| ЭДТА | 1 мм |
| HEPES рН 7 | 25 мм |
| PBS | |
| Вымойте среднего #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| Вымойте среднего #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| Молочной железы 2D питательной среды | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| гепарин | 4 мг/мл |
| L-глютамина | 1 x |
| мышиных bFGF | 10 нг/мл |
| мышиных EGF | 10 нг/мл |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| Индукция и Passaging yMaSCs | |
| Средний молочной колонии | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| гепарин | 4 мкг/мл |
| L-глютамина | 1 x |
| Matrigel (добавить непосредственно перед посевом) | 5% |
| мышиных bFGF | 20 нг/мл |
| мышиных EGF | 10 нг/мл |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| Молочной железы органоид среднего | |
| Расширенный DMEM:F12 | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| гепарин | 4 мкг/мл |
| HEPES | 1 x |
| Голова человека | 100 нг/мл |
| мышиных bEGF | 20 нг/мл |
| мышиных EGF | 50 нг/мл |
| R-Spondin 1 | 1 мкг/мл |
Таблица 1: поколение yMaSCs. Состав всех разные культуры средств массовой информации и решения, необходимые для изоляции первичных клеток молочной железы LD и индукции yMaSCs (раздел 1).
| Изоляция первичного ацинусов поджелудочной железы | |
| Железистый питательной среды | |
| BPE | 50 мкг/мл |
| BSA | 0,1% |
| Дексаметазон | 1 мкг/мл |
| FBS | 0,1% |
| ЕЕ X | 1 x |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| SBTI | 0.2 мг/мл |
| Waymouth средний | |
| Железистый мыть среднего | |
| BSA | 0,1% |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| RPMI среднего | |
| SBTI | 0.2 мг/мл |
| Железистый восстановления среды | |
| Железистый питательной среды | |
| FBS | 10g |
| Коллагеназы я решение A | |
| Железистый мыть среднего | |
| Стоковый раствор коллагеназы я | 360 ед/мл |
| PBS/PS | Хранить при 4 ° C |
| PBS (фосфат амортизированное saline) | |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| Стоковый раствор коллагеназы я | Хранить при температуре от-20 ° C |
| Коллагеназы, тип I (порошок) | 6000 ЕД/мл |
| PBS | |
| Пассированый из поджелудочной железы organoids | |
| Коллагеназы я решение B | |
| PBS 1 x | |
| Стоковый раствор коллагеназы я | 240 ед/мл |
| Поджелудочной железы органоид среднего | |
| Расширенные DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| гастрин | 10 Нм |
| FGF10 человека | 100 нг/мл |
| Голова человека | 100 нг/мл |
| мышиных EGF | 50 нг/мл |
| N-ацетилцистеин | 1,25 мм |
| Никотинамид | 10 мм |
| Ручка/стрептококк | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 мг/мл |
| SBTI | 0.2 мг/мл |
Таблица 2: поколение yDucts. Состав всех разные культуры средств массовой информации и решения, необходимые для изоляции первичных железистый клетки и индукции и пассированый из yDucts (раздел 2).
Discussion
Здесь мы представляем протоколы для перепрограммирования ex vivo неизлечимо продифференцировано эпителиальные клетки различных тканей в их соответствующие клетки-предшественники ткани конкретных (или ySCs) переходных выражением YAP, как сообщалось ранее,1. Мы подробно две процедуры: одна позволяя перепрограммирования СУИМ очищенная клеток через лентивирусные векторы и вторая, которая избегает вирусной инфекции и использует преимущества трансгенных YAP выражения. Каждый протокол представляет эффективную стратегию для изоляции и культуры основных дифференцированных клеток и стратегию заставить экзогенных YAP экспрессии генов в дифференцированных клетках, генерации de novo соматических ткани конкретных расширяемые стволовых клеток (см. схемы в цифры 1A и 2A).
Мы продемонстрировали, что стратегии изоляции, здесь представлены эффективно изолировать чисто населения дифференцированных клеток, как свидетельствует тот факт, что мы никогда не обнаружено каких-либо нарост от отрицательных контрольных образцов (цифры 1 c и 2 C).
Лентивирусные векторы, используемые в данном исследовании для перепрограммирования первичных клеток молочной железы LD являются доксициклин индуцибельной, предлагая возможность жесткий контроль над трансген выражения; Это позволяет включить и от экзогенных YAP будет выражение. Особое внимание следует избегать использования чрезмерной титр вирусных, как это может нанести ущерб с точки зрения эффективности перепрограммирования. В случае первичного железистый клетки мы перешли на полностью трансгенных подход для получения яп зависимых перепрограммирование с минимальными манипуляции. Эта последняя стратегия также является особенно подходящим для первичного ацинусов поджелудочной железы, как изолированные кластеры ацинарной едва ли поддаются лентивирусные инфекции и очень хрупкие. Трансгенные стратегия предлагает те же преимущества доксициклин зависимых лентивирусные векторы для жесткий контроль экспрессии генов. Кроме того трансгенных стратегия, эксплуатируемых с первичной ацинусов поджелудочной железы носит дополнительное преимущество намного выше перепрограммирования эффективности по сравнению с вирусный индуцированной перепрограммирования клеток молочной железы LD. Помимо различных внутренней пластичностью, связанные с клетки, полученные из различных тканей выше скорость поджелудочной железы перепрограммирования может быть производным от более высокую эффективность выражения, связанные с единообразной и автономных YAP выражение во всех описаны клетки. В частности мы продемонстрировали, что экзогенных яп больше не требуется после поколения ySCs (yMaSC колоний и yDucts), не затрагивая их потенциала самообновления. Это потому, что ySCs реактивировать эндогенного YAP/таз и использовать их для самообновления, когда экзогенных YAP выключен1.
Мы проверить понятие, что ySCs действительно выйти из дифференцированных клеток, контролируя ячеек происхождения наших перепрограммирования экспериментов путем генетической линии трассировка проверки1.
Обширные характеристикаиз ySCs показывает, что ПЕА индуцированной перепрограммирования генерирует нормальных соматических СКС1 как я) на транскриптомики уровне, ySCs отображения массивные перекрывается с родной СКС; II) ySCs отображения дифференциация потенциал и может генерировать мультилинейного потомства, всегда ограничены к личности их ткани происхождения; III) ySCs не преобразован и не онкогенной когда пересаженные в естественных условиях.
Здесь мы также описывают процедуры для поддержания и расширения в культуре yMaSCs и yDucts как organoids встроенных в 100% базальной мембраны матрица гидрогели. Эти условия для самостоятельной организации из ySCs в трехмерной organoids обеспечить поддержание долгосрочных в культуре stemness свойств, позволяя расширить эти штока населения по желанию течению анализов и приложений. По неизвестным причинам, мы смогли получить yMaSC organoids, поместив инфицированных клеток LD непосредственно в условиях культуры органоид через 7 дней после лечения доксициклин в пластиковых культуры ткани пластины; другими словами среднего роста шаг в молочной колонии условий имеет важное значение. В наших руках даже родной MaSCs требуют молочной колонии условий перед пассированый органоид культуры. Кроме того наиболее эффективным результатом органоид получается, когда мы избегать отделения основной колоний в отдельные ячейки, но скорее перевести нетронутыми колоний в органоид культуры условий.
Органоид культуры условия также несут преимущество дает возможность криоконсервировать ySCs, при том условии, что organoids оправился от их матрицы, избегая диссоциации клеток до криоконсервирования в ванне азота.
Яп, перепрограммирование представлена процедура может конвертировать собственный дифференцированных клеток типов, производных от различных тканей взрослого в их соответствующие ткани конкретных стволовые клетки (мы проверили это с использованием молочных желез, поджелудочной железы и нейрональных клеток)1. В отличие от iPSCs или другие перепрограммирования усилия YAP/индуцированной SCs может поддерживать воспоминания об их ткани происхождения. Следует отметить, де дифференцировку ядер соматических клеток в клетки, обладает свойствами стволовых как это единственная форма клеток судьба пластичности и перепрограммирования наблюдается в естественных условиях, например после повреждения тканей и для поддержки ранозаживляющее5,17 , 18 , 19 , 20. это отметить, что ПНА и таз основном необязательным для нормальной гомеостаза, но решающее значение для восстановления тканей в нескольких тканей11,21. Последовательно с физиологической функцией по перепрограммирования, описанные здесь, YAP/таз были недавно показали потребуются в кишечной регенерации в моделях мыши больных язвенным колитом, вызывая преобразование взрослых клеток кишечника в Восстановление эпителия, отображающий особенности плода кишки19. Таким образом YAP перепрограммирования расширяет текущие стратегии пластичности индуцированных клеток, предоставляя средства для создания соматических стволовых клеток, государство, которое пока трудно захватить в пробирке. Этот подход, если распространяется также на человека производные клеток, может иметь широкое значение из приложений регенеративной медицины к изучению состояния соматического stemness и для расширения соматических стволовых клеток в пробирке.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим F. Camargo за дар Тето япS127A мышей; R26-rtTAM2 мышей (фондовой #006965) были приобретены у Джексона лаборатории. Мы благодарим Chiara Frasson и Джузеппе Бассо за помощь с СУИМ процедур. Эта работа поддерживается АКПО специальные программы молекулярной клинической онкологии '' 5 промилле '' и АКПО PI-Грант С.П и эпигенетики флагманского проекта CNR-Miur предоставляет с.п. Этот проект получил финансирование от Европейского совета научных исследований (ERC) под Европейского союза Horizon 2020 программы научных исследований и инноваций (грантовое соглашение DENOVOSTEM № 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
