Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

هندسة الأنسجة ظهارة صباغ الشبكية زرع مناسبة المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/58216
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Summary

يصف لنا طريقة لمهندس نسيج شبكية تتكون من الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية المستزرعة على رأس أغشية السلي البشرية وإعدادها للتطعيم في نماذج حيوانية.

Abstract

العديد من الحالات المرضية للعين يؤثر على الأداء الوظيفي و/أو بقاء ظهارة صباغ الشبكية (RPE). وتشمل هذه بعض أشكال التهاب الشبكية الصباغي (RP) والمتعلقة بالعمر البقعي (AMD). خلية العلاج واحدة من الاستراتيجيات العلاجية الواعدة المقترحة لعلاج هذه الأمراض، مع تشجيع الفعل النتائج الأولية في البشر. ومع ذلك، طريقة إعداد الاختلاس أثرا كبيرا على أن النتائج الفنية فيفو. والواقع أن الخلايا RPE المطعمة كتعليق خلية وظيفية أقل من نفس الخلايا التي زرعها كنسيج شبكية. هنا، نحن تصف طريقة بسيطة واستنساخه لمهندس RPE الأنسجة وإعداده لغرس في فيفو . هي المصنف RPE الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent على دعم بيولوجية، الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (لحم الخنزير). بالمقارنة مع السقالات مصطنعة، هذا الدعم له ميزة وجود غشاء الطابق السفلي الذي يقع بالقرب من غشاء بروخ حيث يتم إرفاق الذاتية RPE الخلايا. ومع ذلك، ليس من السهل التلاعب بها، ووضعنا عدة استراتيجيات لاستزراع المناسبة لها، والتحضير لتطعيم فيفو.

Introduction

RPE أمر حاسم للبقاء على قيد الحياة والتوازن من photoreceptors التي كان من أحكام المرتبطة بها1. تغيير الظروف المرضية عدة وظائف و/أو البقاء على قيد الحياة، بما في ذلك البرنامج العادي وأية أم دي.

RP هي مجموعة من الطفرات monogenic الموروثة التي تؤثر على وظائف خلايا RPE أو فوتوريسيبتورس أو كلاهما2،3. ومن المقدر أن الطفرات التي تؤثر على وجه التحديد RPE الخلايا 5 في المائة من البرنامج العادي2. أية أم دي شرط آخر حيث يتم تبديل طبقة RPE، فقدان الرؤية في نهاية المطاف إلى المركزية الرائدة. أية أم دي سببه التفاعلات المعقدة بين العوامل الوراثية والبيئية ويؤثر على المسنين4،،من56. ووفقا للتوقعات، ستكون أية أم دي مصدر قلق للمرضى 196 مليون في العالم بحلول عام 20207. لهذه الاضطرابات، يوجد لا يوجد علاج فعال، وواحدة من الاستراتيجيات المقترحة هو زرع خلايا RPE جديدة بغية التعويض عن الخلايا RPE الموجودة مسبقاً لا يعمل الميت/8.

وضع صياغة للمنتج النهائي تكون المطعمة ضروري لضمان أفضل النتائج الفنية. الخلايا RPE حقن كتعليق خلية، على الرغم من كونها طريقة سهلة ومباشرة للتسليم، تثير مخاوف بشأن البقاء على قيد الحياة، والتكامل، ووظائف9،10،،من1112 , 13-العلماء حاليا بتطوير أكثر الصيغ المعقدة لتسليم المهندسة نسيج الشبكية9،،من1314،،من1516. وفي هذا السياق، قمنا بتطوير أسلوب الأصلي لتوليد في المختبر الأنسجة RPE التي يمكن أن تستخدم لزرع9.

وتستخدم المصارف خلية RPE المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES) في هذا البروتوكول. إلا أن الخلية بديل RPE المصارف من مصادر مختلفة من الخلية (الخلايا الجذعية pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان، وخلايا أولية RPE، إلخ) وميزت بطريقة مختلفة هي أيضا مناسبة لهذا البروتوكول. ويشمل التمييز الموجه البروتوكولات باستخدام السيتوكينات و/أو الجزيئات الصغيرة17،،من1819،20،،من2122.

لزرعها، ينبغي إعداد الأنسجة المهندسة على سقالة. في السنوات القليلة الماضية، وضعت السقالات مختلفة استناداً إلى بوليمر أو على مصفوفة من أصل بيولوجي13،،من2324. هنا، هو الركيزة البيولوجية المستخدمة لحم الخنزير، ولكن يمكن تنفيذ ركائز أخرى، مثل المعراة Bruch الأغشية،. الأسلوب الموصوفة هنا يحتوي على ميزة استخدام سقالة بيولوجية التي أكثر صلة بالبيئة الأصلية RPE.

تستزرع المستمدة من الخلايا خلايا RPE ES الإنسان لمدة 4 أسابيع على الأقل من أجل تنظيم تماما كأحادي الطبقة المرصوفة بالحصى. في هذه المرحلة، ظهارة الحصول على وظيفية والاستقطاب9. وأخيراً، كما هذا النسيج التجاعيد بسهولة، أنه مضمن في طبقة رقيقة من الناقل المائية لإعطائها أكثر صلابة ومرونة وحمايته أثناء إجراء حقن. ويتم حينئذ تخزين هذا المنتج عند 4 درجة مئوية حتى التطعيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

واستخدمت جميع المواد البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول وفقا للوائح الاتحاد الأوروبي. خط الخلية ES البشرية المستخدمة في هذه الدراسة مستقاة من جنينا فريدة من نوعها. أبلغت تماما الزوجين الذين تبرعت بالجنين وأعطت موافقتها لمنحه مجهول. كان خط خلية ES بشرية سريرية الصف المستمدة من هذه الأجنة وراهن والمؤهلين وموثقة بشكل صحيح قبل الخلايا روزلين (المملكة المتحدة). وتم شراء همس تحت ظروف معقمة أثناء قيصرية في الأمهات اللاتي وقعت موافقة واعية للتبرع المشيمة وفقا للمبادئ التوجيهية للمستشفى (أفب، مستشفى سانت لويس).

1-إعداد وسائل الإعلام الثقافة والكاشفات

  1. إعداد متوسطة الثقافة خلية RPE
    1. إعداد مستنبت الخلية RPE، إضافة بديلاً المصل 4% (20 مل لوحدة تخزين نهائي من 500 مل) والعاشر 1,000 المخفف 2-mercaptoethanol (500 ميليلتر لوحدة تخزين نهائي من 500 مل) 1% Eagle′s المتوسطة الأساسية الدنيا (MEM) حل الأحماض الأمينية غير الأساسية (5 مل لنهائي حجم 500 مل) إلى المتوسطة (دميم) ارتفاع الجلوكوز تعديل النسر دولبيكو (475 مل لوحدة تخزين نهائي من 500 مل).
  2. إعداد وسيلة النقل وحفظ
    1. لإعداد وسيلة النقل وحفظ، إضافة % 1 من البنسلين-ستربتوميسين (5 مل لوحدة تخزين نهائي من 500 مل) CO2-المتوسطة مستقلة (495 مل لوحدة تخزين نهائي من 500 مل) وإبقائه في 4 درجات مئوية.
  3. استثارة للانزيم ثيرموليسين
    1. إعداد حل الأسهم من ثيرموليسين
      1. لإعداد حل أسهم من ثيرموليسين، إذابة مسحوق ثيرموليسين، التي كانت مخزنة في-20 درجة مئوية، في درجة حرارة الغرفة.
      2. كما قد يكون النشاط الأنزيمي متغير من دفعة إلى دفعة، حساب هذا النشاط استناداً إلى شهادة التحليل المقدمة مع مسحوق ثيرموليسين لدفعة لاستخدامها. تقسيم "حساب نشاط محايد حوزتي = أنبك" (يشار إليها في شهادة التحليل) من 181 (وهو الوزن الجزيئي تيروزين). والنتيجة التي تم الحصول عليها يناظر مجموع النشاط الأنزيمي من مسحوق ثيرموليسين التي تم توفيرها (يو/فيال).
      3. إعداد حل أسهم في 200 يو/مليلتر بإضافة حجم المياه المقابلة للنشاط الأنزيمي الكلي (يو/فيال) مقسوماً على 200 (U/mL).
      4. حل الإنزيم بيبيتينج الماء الذي تمت إضافته صعودا وهبوطاً. دوامة الحل 30 ثانية والتحقق ما إذا كان تم تعليق المسحوق تماما. بيبيتينج أكثر قد تكون مطلوبة من أجل حل كامل.
      5. قاسمة الحل الأسهم وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. التحضير لإيجاد حل عملي ثيرموليسين
      ملاحظة: يجب إعداد الحل ثيرموليسين في اليوم لعلاج لحم الخنزير.
      1. ذوبان الجليد مختبرين الأسهم من ثيرموليسين في 200 يو/مليلتر المخزنة في-20 درجة مئوية. تمييع الحل الأسهم x 200 في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بغية الحصول على أحد أنشطة الانزيمية نهائي من 1 يو/مليلتر. إعداد 40 مل لعلاج بقع حم 1 – 4.
      2. تصفية ثيرموليسين الحل عن طريق مسبقة فلتر 0.2 ميكرون لاستخدام.
  4. تعليق جيلاتين
    1. إعداد محلول الجيلاتين 20% وكتلة
      ملاحظة: 20% من محلول الجيلاتين وكتلة قد تكون مستعدة حتى لأسبوع واحد قبل الاستخدام.
      1. الحارة CO2-المتوسطة مستقلة إلى 42 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة (ما يصل إلى 1 ساعة). أضف في أنبوب 50 مل، 10 غرام جيلاتين إلى 40 مل من حرارة CO2-المتوسطة مستقلة ودوامه الحل.
      2. حل الجيلاتين لمدة 30 – 60 دقيقة في 42 درجة مئوية. دوامة كل 10 دقيقة لمجانسة الحل.
      3. بمجرد أن الحل متجانس، إضافة 4 مل الحل الجيلاتين 20% إلى أربعة أطباق الثقافة 6 سم. تجنب الفقاعات. إضافة فيلم بارافين بلاستيكية لحماية الأطباق، والسماح للحل على ترسيخ عند 4 درجة مئوية.
    2. إعداد محلول الجيلاتين 8%
      ملاحظة: الجيلاتين 8% الحل قد يكون أعد اليوم قبل الاستخدام والمخزنة في 4 درجات مئوية.
      1. الحارة CO2-المتوسطة مستقلة إلى 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (ما يصل إلى 1 ساعة). أضف في أنبوب 50 مل، 4 غرام جيلاتين لمل 46 من حرارة CO2-المتوسطة مستقلة ودوامه الحل.
      2. حل الجيلاتين لمدة 30 – 60 دقيقة في 42 درجة مئوية. إضافة فيلم بارافين بلاستيكية لحماية الأنبوب ويبقيه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية إذا كان المراد استخدامه في نفس اليوم، أو تخزينها في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامها في وقت لاحق.

2-ثيرموليسين علاج أغشية السلي البشرية

  1. يغسل الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري
    1. وقد همس الموردة كقطع صغيرة (حوالي 30 مم × 30 مم) ثابتة في سقالة نايلون، أما بالفعل في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني أو تجميدها. إذا وفرت المجمدة أو ذوبان الجليد في الأغشية في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة.
    2. غسل الأغشية:
      1. ضع الأغشية 1 – 4 في زجاجة 250 مل يحتوي على 80 مل من برنامج تلفزيوني. استخدام العديد من زجاجات كما هو مطلوب.
      2. اهتز كل زجاجة في شاكر لوحة بسرعة عالية لمدة 5 دقائق، ثم تجاهل برنامج تلفزيوني. إضافة 80 مل من برنامج تلفزيوني وتكرار.
  2. العلاج ثيرموليسين
    1. إضافة 40 مل حل العامل ثيرموليسين (1 يو/mL) كل زجاجة تحتوي على الأغشية (الأغشية 1 – 4 في زجاجات؛ يصل إلى 3 زجاجات في وقت واحد).
    2. هزة في زجاجات لمدة 5 دقائق في 450 دورة في الدقيقة، ومن ثم دوامة لهم لمدة 30 س. كرر 1 x.
    3. تجاهل الحل ثيرموليسين وإضافة 80 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. هزة في زجاجات لمدة 5 دقائق في 450 دورة في الدقيقة. تجاهل برنامج تلفزيوني، وإضافة 80 مل من برنامج تلفزيوني. كرر 3 x.

3-تثبيت أغشية السلي البشرية على إدراج الثقافة

  1. استخدام الملقط العقيمة الطويلة (التي يمكن أن تصل إلى الجزء السفلي من الزجاجة) لإزالة همس واحداً تلو الآخر، ونقل كل لحم الخنزير إلى طبق ثقافة 10 سم التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. في جديد 10 سم ثقافة صحن تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني، بوضع أحد الأغشية مع النايلون أسفل. فصل اثنين من المقاطع الأربعة التي يتم استخدامها لإصلاح الغشاء بالنايلون.
  3. إدراج الحلقة أصغر من إدراج الثقافة بين النايلون والغشاء.
  4. تأكد من أن الغشاء الذي يغطي الحلبة أصغر تماما. مقطع الجزء الثاني من إدراج الثقافة على رأس الغشاء. هو مواجهة الغشاء الطابق السفلي لحم الخنزير داخل إدراج الثقافة. فصل القصاصات الأخيرتين.
  5. قطع، مع مقص العقيمة، الزيادة في الغشاء خارج إدراج الثقافة إذا لزم الأمر. باستخدام الملقط، نقل الغشاء ثابتة في إدراج الثقافة إلى لوحة 12-جيدا، إضافة إلى برنامج تلفزيوني، وتخزين اللوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  6. كرر هذه العمليات (من الخطوة 3.2 إلى 3.5) مع الأغشية الأخرى.

4-ذوبان الجليد وبذر خلايا ظهارة صباغ الشبكية في أغشية السلي البشرية

  1. ذوبان الجليد من خلايا ظهارة صباغ الشبكية
    1. يتم تجميد البنك RPE الخلية في الخلايا 1 مليون كل قنينة المبردة في نيتروجين سائل. ذوبان الجليد العديد من قنينات المبردة كما هو مطلوب (الخلايا 350,000 هي تبذر كل الغشاء).
    2. إعداد أنبوب 15 مل يحتوي على 3 مل متوسطة RPE كل قنينة المبردة. حالما يتم إذابة القنينة، نقل الخلايا لكل أنبوبة. كرر هذه العملية لقنينة أخرى.
    3. مجانسة ("الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات إلى ريسوسبيند الخلايا في المتوسط RPE) وتأخذ 10 ميليلتر من حل الخلية وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل. إضافة 10 ميليلتر من تريبان الأزرق. ميليلتر 15 مكان لهذا الحل في دائرة عد الأصوات، ثم عد عدد الخلايا قابلة للتطبيق (غير ملونة بالأزرق) تحت مجهر مع هدف X 4. كرر هذه العملية لقنينة أخرى.
    4. وفي غضون ذلك الطرد المركزي أنابيب 15 مل في 110 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 700,000 خلايا/مل.
  2. زرع خلايا ظهارة صباغ الشبكية في أغشية السلي البشرية
    1. إزالة لوحة 12-كذلك تحتوي على الأغشية من الحاضنة.
    2. نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميليلتر من تعليق خلية إعدادها في الخطوة 4.1.4 في وسط إدراج الثقافة. أضف 1 مل متوسطة RPE خارج إدراج الثقافة (داخل البئر). كرر الأغشية الأخرى.
    3. ضع لوحة 12-كذلك تحتوي على الأغشية في الحاضنة.

5-الحفاظ على الثقافات الخلية ظهارة صباغ الشبكية في أغشية السلي البشرية

  1. تجديد متوسطة 2 س في الأسبوع، عادة يومي الاثنين والجمعة، على الأقل حتى يوم 30 من الثقافة.
  2. نضح المتوسطة داخل وخارج إدراج الثقافة لكل بئر وتجديدها مع الطازجة المتوسطة (1 مل خارج إدراج الثقافة و 500 ميليلتر داخل). ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.

6-إعداد التصحيح ظهارة صباغ الشبكية لزرع الأعضاء

ملاحظة: ابتداء من يوم 30 من الثقافة، الأنسجة جاهزة للزرع.

  1. الحارة الحل الجيلاتين 8% في حمام مائي عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 ملء الدائرة الداخلية فيبرتوم مع الباردة CO2-المتوسطة مستقلة (في 4 درجات مئوية).
  2. ضع كتلة الجيلاتين 20% إلى فيبرتوم.
    1. تأخذ طبق الثقافة 6 سم تحتوي على كتلة الجيلاتين 20% من الثلاجة. استخدام مشرط، قطع كتلة 5 × 5 سم. قم بلصق الجانب العلوي من الكتلة للدعم مع الغراء cyanoacrylate أو ما يعادله.
    2. ضع شفرة جديدة في فيبرتوم.
    3. قم بضبط مستوى كتلة حتى يتم بنفس المستوى من شفرة حلاقة.
    4. ملء الحمام حول الدعم مع شركة جديدة2-المتوسطة المستقلة في 4 درجات مئوية. قص الكتلة مع فيبرتوم باستخدام سرعة متوسطة حتى يتم قطع الكتلة موحدة، مما يؤدي إلى سطح أملس. تعيين الموضع 0.
    5. نضح المتوسطة حول كتلة الجيلاتين حتى أنها جافة تماما، ومن ثم اتخاذ الثقافة جيدا 12 لوحة تحتوي على الأنسجة من الحضانة عند 37 درجة مئوية.
    6. بعناية باستخدام الملقط، فتح إدراج الثقافة على رأس كتلة الجيلاتين. قطع، مع المقص، جميع أجزاء من الأغشية التي لا تحتوي على خلايا (خارج الحلبة حيث كانت لا مثقف الخلايا). نضح المتوسطة المتبقية كاملة.
    7. إضافة 1 مل من سائل الجيلاتين 8% الحل في 37 درجة مئوية لكي تغطي الأغشية. بعناية إزالة الزائدة. 5-8 دقيقة للسماح الجيلاتين على ترسيخ الانتظار.
    8. إضافة شركة جديدة2-المتوسطة مستقلة (عند 4 درجة مئوية) إلى الحمام حتى تغطي الغشاء.
    9. قطع، مع فيبرتوم في موقف من-100 ميكرومتر، سرعتها متوسطة، تبقى على علم بكيفية تصرف الكتلة. في نهاية المقطع، كن حذراً للحفاظ على التوجه للأنسجة.
    10. مع مشرط، قص زاوية لتحديد التوجه للقسم.
    11. جمع الغشاء جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين مع ملعقة ووضعه في لوحة 6-بئر مليئة بمتوسط الحفظ عند 4 درجة مئوية، حتى تطعيم أنه في عين المتلقي.
    12. في الوقت لزرع الأعضاء، قم بضبط حجم عملية الزرع لحجم العين المتلقية تحت مجهر جراحي (1 – 3 للفئران، 10 – 15 مم2 للرئيسيات غير البشرية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

همس تحتوي على طبقة الظهارة التي ينبغي إزالتها قبل البذر RPE الخلايا. يتم تنفيذ علاج الأنزيمي للغشاء مع ثيرموليسين تحت تهتز. الترتيب إلا لعدم فقدان قطبية الغشاء (الظهارة على جانب واحد)، فثابتة على دعم التكوين التي يمكن أن تكون مختلفة اعتماداً على الموفر (الشكل 1A). فحص التصاق الغشاء لدعمه في هذه الخطوة وإضافة مقاطع إذا لزم الأمر. وقت التثبيت في إدراج الثقافة، العمل بعناية لتجنب أحداث فتحات في الغشاء والاحتفاظ به الأقطاب مع الغشاء مواجهة (الشكل 1B). عندما يتم المصنف الخلايا في الأغشية، أنها يمكن أن الهروب من هذه الثقوب وسيتم تخفيض تركيز الخلية الأخيرة. يمكن تصور وجود ثقوب تحت مجهر، أو عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني داخل إدراج الثقافة والتحقق إذا كان هو تسرب برنامج تلفزيوني. يجب أن يتم تجاهل أي غشاء بثقوب.

بعد تثبيت البرنامج على إدراج الثقافة، هو وجود خلايا متبقية في مجهر تباين مرحلة تقييم (الأرقام 1 ود 1). كلاسيكي، يمكن أن تظل بعض الخلايا الميتة على سطح الغشاء، ولكن سيتم القضاء على تلك الخلايا عند تغيير الثقافة المتوسطة (الشكل 1). يمكن اعتبار ألياف الغشاء الطابق السفلي في تكبير أعلى (الشكل 1) إذا بقيت أي من الخلايا. إذا كان هذا ليس هو الحال، يمكن تعديل توقيت الحضانة مع ثيرموليسين.

في الأيام التالية لبذر الخلايا RPE، تحقق إذا كان التقيد الخلايا. اعتماداً على استخدام المجهر، أنه يمكن أن يكون من الصعب نرى بوضوح الخلايا خلال الأسابيع القليلة الأولى، ولكن إذا لم تنضم الخلايا، خلايا سيتبين تطوف في مستنبت الخلية. حالما تتشكل الظهارة ويبدأ ناضجة، يصبح من الأسهل لرؤيتها تحت مجهر (2A الأرقامو 2 وج 2). في 3 أسابيع، تشكل الخلايا ظهارة أحادي الطبقة كاملة نموذجية من RPE (منظمة حصاة كبيرة). بعد 4 أسابيع، الظهارة ناضجة ما يكفي لإعداده لغرس (الشكل 2D). ومع ذلك، يمكن أن تظل في الثقافة لأكثر من أسبوعين لأسباب لوجستية.

إعداد الاختلاس لغرس يرد في الشكل 3. على ترخيصات للغشاء إلى كتلة الجيلاتين 20%، نضح جميع الخلايا الزائدة الثقافة المتوسطة. هذه الخطوة غير هامة، كأي وسيط المتبقية يمكن أن يحول دون انضمام الجيلاتين 8% RPE والغشاء. وفي الواقع، ستشكل المتوسطة فيلما سائل بين طبقات الجيلاتين.

الجيلاتين يستخدم لتضمين عملية الزرع يمكن أن تكون ذات قوة متفاوتة، اعتماداً على مؤشر بلوم (إجراءأياختبار مراقبة الجودة، والمقدمة من الموردين، وأن يقيم قوة هلام عند درجة حرارة قياسية و تركيز). إذا كان الجيلاتين المستخدمة ليست جامدة ما يكفي وتفصل خلال التطعيم، يجب تغيير مرجع الجيلاتين المستخدمة إلى واحد آخر بقوة أكبر. ويمكن أيضا تغيير تركيز الجيلاتين، استناداً إلى التجارب، ضبط قوة ومرونة.

Figure 1
رقم 1: إدراج الصور التمثيلية من لحم الخنزير قبل وبعد العلاج ثيرموليسين والتثبيت على ثقافة- (أ) صورة الممثل لغشاء تم توفيره بواسطة مصرف أنسجة. (ب) صورة تمثيلية من غشاء ثابت على إدراج ثقافة. (ج) صورة تمثيلية لغشاء تعامل مع ثيرموليسين في تكبير منخفضة. (د) صورة تمثيلية لغشاء تعامل مع ثيرموليسين في تكبير عالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: صور الممثل هام عند البذر الخلايا RPE. (أ) صورة تمثيلية للغشاء قبل البذر. (ب وج) صور الممثل من الخلايا RPE على الأغشية في 3 أسابيع بعد البذر. قد لا يكون الغشاء مستو تماما كما يظهر في لوحة ج. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (ج)، 20 ميكرومتر للتكبير. (د) صورة تمثيلية من الخلايا RPE على غشاء مدة 30 يوما بعد انتهاء البذر، المقابلة للوقت لتضمينها في الجيلاتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مخطط يصف الخطوات المتسلسلة لإدراج هندسيا نسيج الشبكية التي تحتوي على طبقة الخلايا RPE على هام داخل فيلم جيلاتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفت لنا طريقة لاستزراع خلايا RPE على سقالة بيولوجية وإعداده لغرس في نماذج حيوانية. واحدة من الخطوات الحاسمة للبروتوكول هو الحفاظ على اتجاه هام على طول هذا الإجراء حتى إدراجه في الجيلاتين. في الواقع، تتم إزالة ظهارة الأصلي للغشاء وأن الغشاء يصبح عرضه9. الخلايا RPE يجب أن يكون المصنف على رأس هذا الغشاء. عند التحضير لتضمين الجيلاتين، من الأهمية بمكان للعمل مع جميع المنتجات عند درجة حرارة محددة. وفي الواقع، قد الجيلاتين الخاصية أن تكون جامدة في سائل في الجسم درجة الحرارة (37 درجة مئوية)9و 4 درجات مئوية. إذا لم يتم احترام درجة الحرارة، يمكن أن يصلب الجيلاتين أو تسيل في خطوة فيها هذا التأثير هو غير مرغوب فيه.

واقترحت عدة السقالات البيولوجية، مثل ديسسيميت للأغشية25 أو همس26. على وجه الخصوص، همس، من العملية قيصرية27، كانت أظهرت أن يتغاضى عنها جيدا في الفضاء سوبريتينال، ويسبب التهاب محدود وتقليل neovascularization تشورويدال26. ويدعم الغشاء بنجاح ثقافة البشرية RPE الخلايا9،28. وعلاوة على ذلك، هذه الأغشية لها أيضا تاريخ طويل في عيادات29، مما يجعلهم مرشحين جيدين سقالة لعلاج الخلايا RPE. يدعم البيولوجية الأخرى يمكن تنفيذها بسهولة مع هذا البروتوكول. الاصطناعية السقالات استناداً إلى البوليمر بالفعل الجامد، وقد لا تحتاج إلى جيلاتين تضمين قبل زرع13،،من3031،،من3233. وقد وضعت أنظمة أخرى لغرس مؤخرا لتقديم سوبريتينال في العين البشرية من المستمدة من هيس RPE أحادي الطبقة سقالة بوليستر جامدة34 أو على الركازة parylene اصطناعية مصممة لتقليد غشاء بروخ في35 . حتى ولو كانت هذه الاستراتيجيات الواعدة، ونعتقد أن السقالات البيولوجية يمكن أن توفر أفضل منصة لهندسة الأنسجة RPE.

في هذا البروتوكول، استخلصت الخلايا RPE المبذورة من البشرية دإط الخلايا باستخدام أسلوب المفاضلة عفوية. ومع ذلك، يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا RPE، أما متباينة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent أو من الخلايا RPE الأولية التي تم الحصول عليها من الجثث أو حتى من RPE خلية خط19،،من3637، 38. وعلاوة على ذلك، إذا كان استخدام الخلايا الجذعية pluripotent، وضعت العديد من البروتوكولات في السنوات الماضية للحصول على خلايا RPE استناداً إلى تفريق عفوية أو باستخدام الجزيئات الصغيرة لتوجيه التمايز18،22. RPE الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه البروتوكولات التمايز مختلفة يمكن استخدامها أيضا مع هذا الأسلوب لهندسة الأنسجة.

حد واحد من هذا الأسلوب هو استقرار الأنسجة المضمنة في 4 درجات مئوية. كما أنها متضمنة في الجيلاتين قبل شحنها إلى موقع الجراحة، أنها للإبقاء على درجة الحرارة هذه حتى انجرافتمينت. وفي هذا السياق، ينبغي إجراء العمليات الجراحية خلال 48 ساعة.

هذا الأسلوب يمكن نقلها بسهولة إلى العيادة. الأنسجة RPE جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين هو المحافظة على 4 درجة مئوية في CO2-المتوسطة مستقلة. يمكن الاستعاضة عن هذه الوسيلة، إذا لزم الأمر، مع آخرين سبق أن وافقت عليها "لنا الغذاء" والدواء (FDA) لحفظ القرنيات التي تم الحصول عليها بعد الوفاة، والتي تستخدم لعمليات الزرع في البشر. أننا نجح في إثبات فعالية هذه الاستراتيجية لزرع الأعضاء في دراسة نماذج القوارض9من بين مفهوم الإثبات، ويتم حاليا التحقق من النهج الجراحية في المقدمات غير البشرية قبل تنفيذه لتجربة سريرية لعلاج المرضى بأشكال محددة من البرنامج العادي التي تؤثر RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أوليفييه جورو هو المخترع في انتظار براءات الاختراع المتعلقة بتوليد خلايا الشبكية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر جيروم لارغيرو وفاليري فانو (مستشفى سانت لويس، باريس، فرنسا) لمساهمتها أثناء إقامة للطريقة الموضحة هنا.

أيد منح مقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية هذا العمل [جبيبس: ANR-2010--RFCS005؛ سايتريبير: وكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE17-008-02]، لوس أنجليس من أجل مؤسسة "بحوث ميديكال" [برنامج الهندسة الحيوية-DBS20140930777] ومن "أحياء لابيكس" [ANR-10-لابكس-73] "أوليفييه جورو" ومونفيل Christelle. أيده نيوراتريس، بحوث متعدية بنية أساسية (يشرف دعفينير) بيوثيرابيس في علوم الأعصاب [ANR-11-إينبس-0011] وإينجيستيم، البنية التحتية الوطنية (يشرف دعفينير) الشركة الهندسية ل pluripotent و المتمايزة الخلايا الجذعية [ANR-11-إينبس-000] إلى مونفيل Christelle. كريم بن مبارك أيده زمالات من ستيمبل خافت وإحياء لابيكس [ANR-10-لابكس-73]. الجذعية جزء من معهد "الأمراض النادرة التي" تدعمها "الرابطة الفرنسية" مكافحة ليه ميوباثيس (AFM) بيوثيرابيس-Téléthon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250 mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1x (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100x) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
  5. Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
  6. Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
  7. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  8. Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
  9. Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  10. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  11. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  12. Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
  13. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  14. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
  17. Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
  18. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  19. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  20. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
  21. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  22. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  23. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  24. Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
  25. Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
  26. Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
  27. Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
  28. Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
  29. Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
  30. Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  31. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
  32. Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
  33. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  34. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  35. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  36. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  37. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  38. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، 139 قضية، Pluripotent وقف الخلايا، التمايز، العلاج بالخلايا، وظهاره صباغ الشبكية، وضمور الشبكية، البقعي المتعلقة بالعمر
هندسة الأنسجة ظهارة صباغ الشبكية زرع مناسبة المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben M'Barek, K., Habeler, W.,… More

Ben M'Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter