Summary
Vi beskriver en metod för att konstruera en retinala vävnaden består av näthinnans pigment epitelial celler från mänskliga pluripotenta stamceller odlade ovanpå mänskliga fostervatten membran och dess förberedelse för ympning i djurmodeller.
Abstract
Flera sjukdomstillstånd i ögat påverka funktionaliteten eller överlevnaden av retinal pigmentepitel (RPE). Dessa inkluderar vissa former av retinitis pigmentosa (RP) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Cellterapi är en av de mest lovande terapeutiska strategier föreslås att bota dessa sjukdomar, med redan uppmuntrande preliminära resultat hos människor. Metoden för beredning av graften har dock en betydande inverkan på dess funktionella utfall i vivo. RPE-celler som ympade som en cellsuspension är faktiskt mindre funktionell än samma celler transplanterade som en näthinnevävnad. Häri, beskriver vi en enkel och reproducerbar metod till ingenjör RPE vävnad och dess förberedelse för en in-vivo -implantation. RPE-celler som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller är seedade på en biologisk stöd, mänskliga fostervatten membranet (hAM). Jämfört med konstgjorda byggnadsställningar, har detta stöd fördelen av att ha en basalmembranet som ligger nära den Bruchs membran där endogena RPE-celler är kopplade. Men dess behandlig är inte lätt och vi utvecklat flera strategier för dess korrekt odling och beredning för ympning i vivo.
Introduction
RPE är avgörande för överlevnad och homeostas av fotoreceptorer som det är tätt associerad1. Flera sjukdomstillstånd ändra dess funktionalitet och/eller överlevnad, inklusive RP och AMD.
RP är en grupp av ärvda monogena mutationer som påverkar funktionerna i fotoreceptorer, RPE-celler eller båda2,3. Det uppskattas att mutationer som påverkar särskilt RPE celler utgör 5% av RP2. AMD är ett annat tillstånd där RPE lagret ändras, ledande slutligen till centrala synbortfall. AMD orsakas av komplexa växelverkan av genetiska och miljömässiga faktorer och påverkar äldre4,5,6. Enligt prognoser kommer AMD vara ett bekymmer för 196 miljoner patienter över hela världen av 20207. För dessa störningar, något effektivt botemedel finns, och en av de strategier som föreslås är transplantation av nya RPE-celler för att kompensera för döda/nonfunctional redan existerande RPE celler8.
Formulering av den slutliga produkten att ympas är avgörande för att säkerställa bästa funktionella resultat. RPE-celler injiceras som en cellsuspension, trots att det är en lätt och okomplicerad metod för leverans, höja oro för deras överlevnad, integration och funktionalitet9,10,11,12 , 13. forskare utvecklar nu mer komplexa formuleringar att leverera konstruerad näthinnevävnad9,13,14,15,16. I detta sammanhang utvecklat vi en originell metod för att generera i vitro RPE vävnad som kan användas för transplantation9.
RPE cellbanker härrör från mänskliga embryonala stamceller (ES) används i detta protokoll. Dock alternativ RPE cell banker från olika cell källor (människans pluripotenta stamceller, primära RPE-celler, etc.) och differentierat med en annan metod är också lämpliga för detta protokoll. Det inkluderar riktad differentiering protokoll med hjälp av cytokiner och/eller små molekyler17,18,19,20,21,22.
För att kunna transplanteras, bör konstruerade vävnaden vara beredd på en byggnadsställning. I de senaste åren, har olika ställningar utvecklats på en polymer eller på en matris av biologiskt ursprung13,23,24. Här det biologiska substrat som används är skinka, men andra substrat, som utblottad Bruch membran, kunde genomföras. Den metod som beskrivs häri har fördelen med att använda en biologisk byggnadsställning som är mer relevant för RPE infödda miljön.
Mänskliga ES cell-derived RPE-celler odlas i minst 4 veckor för att vara fullt organiserade som en kullersten enskiktslager. I det skedet epitelet erhålls är funktionell och polariserade9. Slutligen, eftersom denna vävnad rynkor lätt, den är inbäddad i ett tunt lager av hydrogel bärare att ge det mer styvhet och elasticitet och skydda den under förfarandet för injektion. Denna produkt är sedan lagras vid 4 ° C tills ympning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga material som används i detta protokoll användes i enlighet med Europeiska unionens förordningar. Den mänskliga ES cellinje som används i denna studie härrörde från ett unikt embryo. Paret som hade donerat embryot var informerad och gav sitt samtycke för en anonym donation. En klinisk-grade mänskliga ES cellinje var härrör från detta embryo, bankas, kvalificerade och dokumenteras av Roslin celler (UK). Skinka uppbringades under sterila förhållanden under ett kejsarsnitt hos mödrar som undertecknat ett informerat samtycke för moderkakan donation enligt sjukhuset riktlinjer (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. beredning av kultur Media och reagenser
-
Beredning av RPE cellodlingsmedium
- För att förbereda den RPE cellodlingsmedium, tillsätt 4% serum substitut (20 mL till en slutlig volym av 500 mL), 1000 x utspädd 2-merkaptoetanol (500 µL för en slutlig volym av 500 mL) och 1% Eagle′s minsta viktigt medium (MEM) icke-essentiella aminosyror lösning (5 mL för en slutlig volym 500 ml) till Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) hög glukos (475 mL till en slutlig volym av 500 mL).
-
Förberedelse av transport/bevarande medium
- För att förbereda transport/bevarande medium, tillsätt 1% av penicillin-streptomycin (5 mL till en slutlig volym av 500 mL) till CO2-oberoende medium (495 mL till en slutlig volym av 500 mL) och hålla den vid 4 ° C.
-
Resuspension av enzymet thermolysin
- Förberedelse av en stamlösning av thermolysin
- För att förbereda en stamlösning av thermolysin, Tina thermolysin pulvret, som förvarades vid-20 ° C, vid rumstemperatur.
- Eftersom den enzymatiska aktiviteten kan vara variabel från sats till sats, beräkna denna aktivitet utifrån analyscertifikatet som medföljer thermolysin pulvret det parti som ska användas. Dela upp den ”aktivitet neutralt proteas beräknas = ANPC” (anges i analyscertifikatet) av 181 (som är tyrosins molekylvikt). Det erhållna resultatet motsvarar de totala enzymaktivitet av medföljande thermolysin pulvret (U/injektionsflaska).
- Förbereda en stamlösning 200 U/ml genom att lägga till volymen vatten som motsvarar den totala enzymatisk aktivitet (U/injektionsflaska) dividerat med 200 (U/mL).
- Lös upp enzymet genom pipettering vattnet som lades upp och ner. Vortex lösningen för 30 s och kontrollera om pulvret helt har avbrutits. Mer pipettering kan krävas för en full upplösning.
- Alikvot stamlösning och lagra den på-20 ° C.
- Beredning av en fungerande lösning av thermolysin
Obs: Den thermolysin lösningen måste beredas på dagen för skinka behandling.- Tina de lager alikvoter av thermolysin vid 200 U/mL förvaras vid-20 ° C. Späd stamlösningen 200 x i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att erhålla en slutlig enzymatisk aktivitet 1 U/ml. Förbereda 40 mL att behandla 1 – 4 skinka patchar.
- Filtrera thermolysin lösningen genom ett 0,2 µm filter före användning.
- Förberedelse av en stamlösning av thermolysin
-
Resuspension av gelatin
- Beredning av 20% gelatin lösningen och block
Obs: 20% gelatin lösningen och block kan förberedas upp till 1 vecka före användning.- Varm av CO2-oberoende medium till 42 ° C i ett vattenbad under 30 minuter (upp till 1 h). I en 50 mL tub, lägga till 10 g gelatin till 40 mL värmde CO2-oberoende medium och vortex lösningen.
- Lös upp gelatin för 30 – 60 min vid 42 ° C. Vortex varje 10 min att homogenisera lösningen.
- När lösningen är homogen, tillsätt 4 mL 20% gelatin lösningen till fyra 6 cm kultur rätter. Undvik bubblor. Lägga till en plast paraffin film för att skydda rätterna och låt lösningen stelnar vid 4 ° C.
- Beredning av 8% gelatin lösning
Obs: 8% gelatin lösningen kan förberedas dagen innan användning och lagras vid 4 ° C.- Varm av CO2-oberoende medium till 42 ° C i 30 min (upp till 1 h). I en 50 mL tub, lägga till 4 g gelatin till 46 mL värmde CO2-oberoende medium och vortex lösningen.
- Lös upp gelatin för 30 – 60 min vid 42 ° C. Lägga till en plast paraffin film för att skydda röret och hålla den i ett vattenbad vid 37 ° C om det skall användas samma dag eller förvara den vid 4 ° C om det ska användas senare.
- Beredning av 20% gelatin lösningen och block
2. Thermolysin behandling av mänskliga fostervatten membran
-
Mänskliga fostervatten membran wash
- Har skinka levereras som små bitar (ca 30 x 30 mm) fast i en nylon byggnadsställning, antingen redan vid 4 ° C i PBS eller fryst. Om frysta, Tina membranen vid 37 ° C i en inkubator för 30 min.
- Tvätta membran:
- Placera 1 – 4 membran i 250 mL flaska innehållande 80 mL PBS. Använd så många flaskor som krävs.
- Skaka varje flaska i en tallrik shaker med hög hastighet i 5 min, sedan kassera PBS. Tillsätt 80 mL PBS och upprepa.
-
Thermolysin behandling
- Tillsätt 40 mL arbetslösning av thermolysin (1 U/mL) per flaska som innehåller membran (1 – 4 membran per flaskor; upp till 3 flaskor åt gången).
- Skaka flaskorna för 5 min vid 450 rpm och sedan vortex dem för 30 s. Upprepa 1 x.
- Kassera den thermolysin lösningen och tillsätt 80 mL PBS.
- Skaka flaskorna för 5 min vid 450 rpm. Kassera PBS och tillsätt 80 mL PBS. Upprepa 3 x.
3. fixering av mänskliga fostervatten membran på en kultur-infoga
- Använd långa steril pincett (som kan nå botten av flaskan) ta bort skinka en och överföra varje skinka till en 10 cm kultur maträtt innehållande 10 mL PBS.
- I en ny 10 cm kultur maträtt innehållande 10 mL PBS, placera en av membranen med nylon vänd nedåt. Lossa två av fyra klipp som används för att fixa membranet till nylon.
- Sätt in den mindre ringen av kultur skäret mellan nylon och membranet.
- Kontrollera att membranet täcker den mindre ringen helt. Klipp den andra delen av kultur skäret ovanpå membranet. Basalmembranet på skinkan är uppåt inuti kultur skäret. Lossa de två sista klipp.
- Skär, med steril sax, överskottet av membran utanför kultur Skäret vid behov. Använda pincett, överföra membranet fast i kultur infoga till en 12-väl tallrik, Lägg PBS och förvara plattan i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
- Upprepa dessa operationer (från steg 3,2-3,5) med andra membran.
4. upptining och sådd av Retinal Pigment epitel-celler på mänskliga fostervatten membran
-
Upptining av retinal pigment epitel-celler
- 1 miljon celler per kryogen injektionsflaskan fryst RPE cell banken i flytande kväve. Tina upp så många kryogen injektionsflaskor som krävs (350.000 celler är seedade per membran).
- Förbereda en 15 mL tub innehållande 3 mL av RPE medium per kryogen injektionsflaska. När injektionsflaskan är tinade, överföra cellerna till varje rör. Upprepa åtgärden för andra injektionsflaskorna.
- Homogenisera (Pipettera upp och ner några gånger att resuspendera cellerna i RPE mediet) och ta 10 µL av den cell lösningen och överföra den till en 1,5 mL tub. Tillsätt 10 µL av trypan blå. Plats 15 µL av denna lösning i en räknande kammare, då räknas antalet livskraftiga celler (inte färgade i blått) under ett Mikroskop med en 4 X-objektiv. Upprepa åtgärden för andra injektionsflaskorna.
- Under tiden Centrifugera 15 mL tuberna på 110 x g för 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna på 700 000 celler/mL.
-
Sådd av retinal pigment epitel-celler in i mänskliga fostervatten membran
- Ta bort 12-väl plattan som innehåller membran från inkubatorn.
- Aspirera PBS. Tillsätt 500 µL cellsuspension bereddes i steg 4.1.4 i stadens kultur skäret. Tillsätt 1 mL av RPE medium utanför kultur skäret (inuti brunnen). Upprepa för de andra membran.
- Placera 12-väl plattan som innehåller membran i inkubatorn.
5. underhåll av Retinal Pigment epitel cellkulturer på mänskliga fostervatten membran
- Förnya mediet 2 x per vecka, vanligtvis på måndag och fredag, åtminstone fram till dag 30 av kulturen.
- Aspirera på medellång i och utanför kultur insatsen för varje brunn och förnya den med färska medium (1 mL utanför kultur skäret och 500 µL inuti). Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
6. beredning av Retinal Pigment epitel Patch för Transplantation
Obs: Börjar på dag 30 av kultur, är vävnaden redo för transplantation.
- Varma 8% gelatin lösningen i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 min. Fyll den inre kammaren i vibratome med kall CO2-oberoende medium (vid 4 ° C).
-
Placera blocket 20% gelatin i vibratome.
- Ta 6 cm kultur skålen som innehåller block av 20% gelatin från kylen. Med en skalpell skära ut en 5 x 5 cm block. Klistra in den övre sidan av blocket till stöd med cyanoakrylat lim eller motsvarande.
- Placera ett nytt blad i vibratome.
- Justera nivån på blocket tills det är på samma nivå av rakbladet.
- Fyll badet runt stöd med färska CO2-oberoende medium vid 4 ° C. Skär blocket med den vibratome med en medellång hastighet tills blocket skärs jämnt, vilket leder till en slät yta. Ange position 0.
- Aspirera på medellång runt kvarteret gelatin tills den är helt torr, och sedan ta 12-väl kultur plattan som innehåller vävnader från inkubatorn vid 37 ° C.
- Med pincett, öppna försiktigt kultur skäret på toppen av gelatin blocket. Skär, med saxen, alla delar av de membran som inte innehåller celler (utanför ringen där celler inte odlades). Sug upp det hela resterande mediet.
- Tillsätt 1 mL av den flytande 8% gelatin lösningen vid 37 ° C för att täcka membran. Ta försiktigt bort överskottet. Vänta 5 – 8 min så att gelatin att stelna.
- Lägga till färska CO2-oberoende medium (vid 4 ° C) till badet tills membranet är täckt.
- Skär, med vibratome på en ställning av-100 µm, med en medellång hastighet, förbli medveten om hur blocket uppträder. I slutet av avsnittet, var noga med att bibehålla orienteringen av vävnaden.
- Med en skalpell skära ett hörn för att identifiera avsnittet orientering.
- Samla in membranet inbäddade i gelatin med en spatel och placera den i en 6-väl tallrik fylld med bevarande mediet vid 4 ° C, tills ympning det in i mottagarens ögat.
- Vid tidpunkten för transplantation, justera storleken på implantatet till storleken på mottagarens ögat under ett kirurgiskt Mikroskop (1 – 3 för råttor, 10 – 15 mm2 för icke-mänskliga primater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skinka innehåller en epitelial skikt som ska avlägsnas före odling av RPE-celler. En enzymatisk behandling av membranet utförs med thermolysin under skakning. För att inte att inte förlora polariteten av membranet (epitel är på ena sidan), det är fast på ett stöd som sammansättning kan vara olika beroende på leverantör (figur 1A). Kontrollera vidhäftningen av membranet till sitt stöd i detta steg och lägga till klipp om det behövs. Vid tidpunkten för fixering i kultur Infoga, arbeta försiktigt för att undvika att göra hål i membranet och håll dess polaritet med basalmembranet uppåt (figur 1B). När cellerna är seedade på membranen, de kunde fly från dessa hål och slutliga cellkoncentrationen kommer att minskas. Förekomsten av hål kan visualiseras under ett Mikroskop eller genom att lägga till PBS släpper kultur skäret och kontrollera om PBS läcker. Varje membran med hål ska kasseras.
Efter fixeringen på kultur Skäret är förekomsten av resterande celler i ett faskontrastmikroskop utvärderade (siffrorna 1 c och 1 D). Klassiskt, några döda celler kunde kvar på ytan av membranet, men dessa celler kommer att elimineras när odlingssubstratet ändras (figur 1 c). Fibrerna i basalmembranet kunde ses vid en högre förstoring (figur 1 d) om inga celler kvar. Om detta inte är fallet, kan tidpunkten för inkubering med thermolysin justeras.
I dagarna efter odling av RPE-cellerna, kontrollera om cellerna följer. Beroende på mikroskopet används, det kan vara svårt att tydligt se cellerna under de första veckorna, men om cellerna inte klibbar, celler ses flyter runt i cellodlingsmedium. När epitelet bildas och börjar mogna, blir det lättare att se det under ett mikroskop (siffror 2A, 2Boch 2 C). På 3 veckor bildar cellerna en komplett enskiktslager epitel typiska för RPE (kullersten organisation). Efter 4 veckor är epitelet tillräckligt mogen för dess framställning för implantation (figur 2D). Dock kunde det hållas i kultur för fler veckor av logistiska skäl.
Utarbetandet av transplantat för implantation beskrivs i figur 3. Vid apposition av membranet till 20% gelatin block, aspirera all överflödig cellodlingsmedium. Detta steg är viktigt, eftersom eventuella återstående medel kunde hindra att vidhäftningen av 8% gelatin till RPE och membranet. Medium kommer faktiskt bildar en film av vätska mellan skikten av gelatin.
Gelatin används för för inbäddning av implantatet kan vara av varierande styrka, beroende på dess Blom-index (dvs.en kvalitetskontroll test, utfört och som tillhandahålls av leverantörer, som utvärderar styrkan i en gel på en standardiserad temperatur och koncentration). Om gelatin används inte är tillräckligt styv och disaggregates under den ympning, bör referensen används gelatin ändras till en annan med en högre hållfasthet. Koncentrationen av gelatin kan också ändras, baserat på experiment, att justera sin styrka och elasticitet.
Figur 1: representativa bilder av skinkan före och efter thermolysin behandling och fixering vid en kultur infoga. (A) representativ bild av ett membran som tillhandahålls av vävnadsbanker. (B) representativ bild av en membran fast på en kultur infoga. (C) representativ bild av ett membran som behandlats med thermolysin vid låg förstoring. (D) representativ bild av ett membran som behandlats med thermolysin vid hög förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa bilder av skinkan vid sådd RPE-cellerna. (A) representativ bild av membranet före sådd. ()B och C) representativa bilder av RPE-celler på membran på 3 veckor efter sådd. Membranet kan inte vara helt plana som sett i panel C. Skalstapeln = 100 µm (C), 20 µm för förstoringen. (D) representativ bild av RPE-cellerna på ett membran på 30 dagar efter sådd, motsvarar tid för att bädda in dem i gelatin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: system som beskriver de sekventiella steg för införande av bakåtkompilerade retinala vävnaden som innehåller det RPE celllagrar på skinkan inuti en gelatin film. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrivs en metod för kulturen i RPE-celler på en biologisk byggnadsställning och dess förberedelser för implantation i djurmodeller. En av de kritiska steg i protokollet är underhåll av orientering på skinkan längs förfarandet fram till dess införande i gelatin. Faktiskt det infödda epitelet av membranet tas bort och dess basalmembranet blir exponerade9. RPE-cellerna måste vara seedad ovanpå detta basalmembranet. Vid förberedelse för gelatin inbäddning, är det viktigt att arbeta med alla produkter på definierade temperaturen. Gelatin har faktiskt egenskapen att vara stel vid 4 ° C och vätska vid kropp temperatur (37 ° C)9. Om temperaturen inte respekteras, kan gelatin stelna eller vätskeform vid ett steg där denna effekt inte är önskvärd.
Flera biologiska ställningar har föreslagits, som Descemets membran25 eller skinka26. I synnerhet påvisades skinka, från ett kejsarsnitt27, för att tolereras väl i subretinalområdet, orsakar begränsad inflammation och minska koroidal kärlnybildning26. Membranet stöder framgångsrikt kultur av mänskliga RPE celler9,28. Dessutom har dessa membran också en lång historia i kliniker29, vilket gör dem bra kandidater för en byggnadsställning för RPE cellterapi. Andra biologiska stöder kan enkelt genomföras med detta protokoll. Syntetiska ställningar baserat på polymer är redan styva och kanske inte behöver en gelatin inbäddning före implantation13,30,31,32,33. Andra system för implantation har nyligen framtagits för subretinal leverans i det mänskliga ögat av en hESC-derived RPE enskiktslager på en styv polyester byggnadsställning34 eller syntetiska parylene substrat utformade för att efterlikna Bruchs membran35 . Även om dessa strategier är lovande, anser att biologiska ställningar skulle kunna ge den bästa plattformen för RPE vävnadsteknik.
I detta protokoll härleddes seedade RPE-cellerna från mänskliga ES-celler med en spontan differentiering metod. Men olika typer av RPE-celler kan användas, antingen åtskilt från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller eller primära RPE-celler som erhållits från kadaver eller ens en RPE cell linje19,36,37, 38. Dessutom använder pluripotenta stamceller, har flera protokoll utvecklats under de senaste åren att få RPE-celler baserat på en spontan differentiering eller med hjälp av små molekyler för att vägleda den differentiering18,22. RPE-celler som erhållits från dessa olika differentiering protokoll kan också användas med den här metoden för vävnadsteknik.
En begränsning med denna metod är stabiliteten i den inbäddade vävnaden vid 4 ° C. Eftersom det ingår i gelatin strax före transporten till operationsstället, måste hållas vid denna temperatur tills engraftment. I detta sammanhang bör operationerna utföras inom 48 h.
Denna metod kan lätt överföras till kliniken. RPE vävnaden inbäddade i gelatin är bevarad vid 4 ° C i CO2-oberoende medium. Detta medium kan ersättas, om så krävs, med andra redan godkänts av den amerikanska Food and Drug Administration (FDA) för bevarande av hornhinnor som erhållits efter slakt och som används för transplantationer till människor. Vi har framgångsrikt visat effektiviteten i denna strategi för transplantation i en proof-of-concept undersökning gnagare modeller9, och vi för närvarande validerar den kirurgiska metoden i icke-mänskliga primater innan du implementerar det för en klinisk prövning behandla patienter med särskilda former av RP som påverkar RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Olivier Goureau är uppfinnaren på väntande patent relaterade till generation av näthinnans celler från mänskliga pluripotenta stamceller. De andra författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jérôme Larghero och Valérie Vanneaux (Hôpital Saint-Louis, Paris, Frankrike) för deras insatser under inrättandet av den metod som beskrivs här.
Detta arbete stöds av bidrag från ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-engineering program - DBS20140930777] och från LABEX ÅTERUPPLIVA [ANR-10-LABX-73] att Olivier Goureau och Christelle Monville. Den stöddes av NeurATRIS, en translationell forskningsinfrastruktur (Investissements pris) för bioterapier i neurovetenskap [ANR-11-INBS-0011] och INGESTEM, den nationella infrastrukturen (Investissements pris) engineering för pluripotenta och differentierade stamceller [ANR-11-INBS-000] till Christelle Monville. Karim Ben M'Barek stöddes av stipendier från DIM Stempole och LABEX ÅTERUPPLIVA [ANR-10-LABX-73]. Jag-stammen är en del av det bioterapier Institutet för sällsynta sjukdomar som stöds av den Association Française contre les myopatier (AFM)-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C.
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
