Summary
Vi beskriver en protokol for at fremkalde åreforkalkning i aorta roden af ApoE- / - mus fodret med en atherogene kost, gennem en kontinuerlig frigivelse af aldosteron. Metoder til at karakterisere plaque sammensætning er også beskrevet.
Abstract
Åreforkalkning er en kronisk inflammatorisk respons påvirker vaskulære endotel og fremmes af flere faktorer såsom hypertension, dyslipidæmi og diabetes. Til dato, er der beviser til støtte for en rolle for cirkulerende aldosteron som en risikofaktor for udvikling af hjerte-kar-sygdom. Transgene musemodeller der er genereret for at studere cellulære og molekylære processer, der fører til åreforkalkning. I dette manuskript beskriver vi en protokol, der drager fordel af kontinuerlig infusion af aldosteron i ApoE- / - mus og genererer aterosklerotiske plaques i aorta roden efter 4 ugers behandling. Vi, illustrerer derfor en metode til kvantificering og karakterisering af aterosklerotiske læsioner på aorta rodniveau. Merværdien af aldosteron infusion er repræsenteret af generation af aterosklerotiske læsioner rige i lipid og inflammatoriske celler efter 4 ugers behandling. Vi beskriver i detaljer de farvning procedurer for at kvantificere lipid og makrofag indhold i plak. Navnlig, i denne protokol udføre vi hjerte væv-indlejring i OLT for at bevare antigenicity af hjerte væv og lette sporbarhed af antigener af interesse. Analyse af plaque fænotype repræsenterer en gyldig tilgang til at studere Patofysiologi af åreforkalkning udvikling og identificere roman farmakologiske mål for udvikling af anti-atherogene narkotika.
Introduction
Åreforkalkning er en af de vigtigste årsager til dødelighed og sygelighed på verdensplan1. Det er karakteriseret ved en kronisk inflammatorisk tilstand hvor blodkar er infiltreret af lipider og leukocytter, der bestemmer dannelsen af aterosklerotiske plaques. Fleste af akut hjerte begivenheder er forbundet med tromber på grund af plaque brud. Plaques tilbøjelige til brud er defineret "sårbare" og er karakteriseret ved øget infiltration af pro-inflammatoriske leukocytter, et nekrotisk kerne og en tynd fiber cap2. I de sidste årtier, har kliniske og eksperimentelle undersøgelser afklaret de komplekse Patofysiologi af sygdommen. Flere dyremodeller er brugt til at undersøge de molekylære mekanismer involveret i induktion af åreforkalkning3. I øjeblikket, er at musen den hyppigst anvendte arter at studere åreforkalkning trods nogle artsspecifikke forskelle i sin Patofysiologi i forhold til mennesker. Især er cirkulerer kolesterol hovedsageligt komponeret af high-density lipoprotein (med antiatherogenic egenskaber) i musemodeller, mens i mennesker cirkulerer kolesterol er hovedsagelig transporteres som low-density lipoprotein (LDL), sandsynligvis repræsenterer den vigtigste grund hvorfor wild-type mus ikke udvikler spontan åreforkalkning4. Desuden er vilde type mus generelt resistente til at absorbere kolesterol fra kosten, mens mennesker absorbere omkring 50% af kolesterol4. For at overvinde disse begrænsninger, er blevet genereret flere genetisk modificerede musemodeller. Apolipoprotein E – mangelfuld mus (ApoE−/−) og LDL receptor-mangelfuld mus (LDLr−/−) er almindeligt anvendt. På en fedtrig højt kolesterol kost, ApoE−/− mus udvikler plak mere hurtigt i forhold til LDLr−/−mus, og derfor er brugen af ApoE−/− mus mere udbredt end i LDLr−/−mus5,6. ApoE−/− mus udvikle læsioner på ethvert stadium af åreforkalkning og kan sammenlignes med dem, observeret i mennesker, selvom musen plaques ikke viser en ustabil fænotype7. Generelt, ApoE−/− mus udvikle spontant åreforkalkning og denne proces er accelereret med en vestlig kost3. Sværhedsgraden af åreforkalkning kan evalueres på niveauet af carotis, pulmonal, collum og brachiocephalic arterie og aorta roden6. Aorta-roden er en anatomisk site tilbøjelige til at udvikle aterosklerotiske læsioner i mus. Af denne grund er det almindelig praksis at vurdere dannelsen af aterosklerotiske plaques i denne region.
Flere undersøgelser har vist, at aldosteron er involveret i udviklingen af åreforkalkning8,9,10. Aldosteron infusion i ApoE−/− mus fodret en atherogene kost accelererer udviklingen af aorta root aterosklerotiske læsioner inducerende betændte og lipid-rige plaque dannelse10.
I Resumé beskriver vi en protokol, herunder aldosteron infusion, atherogene kost fodring, integrering af hjertet væv, kvantificering og karakterisering af aterosklerotiske læsioner i ApoE- / - mus. Denne procedure fremmer en effektiv dannelsen af betændt, lipid-rige aterosklerotiske plaques og repræsenterer en værdifuld model for studiet af atherogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af den italienske nationale institutter for Health Care og brug udvalg, tilladelse nummer 493/2016-PR. Alle procedurer blev gennemført pr. retningslinjerne i det Europæiske Fællesskab for brugen af forsøgsdyr (europæiske direktiv 2010/63/UE).
Bemærk: Subkutan implantation af osmotisk minipump indeholdende køretøj (ethanol i saltopløsning) eller aldosteron (240 µg · kg-1 · d-1) i 8-10 ugers-gamle mandlige mus mangelfuld for ApoE -genet. I generelle, 8-10 ugers-gamle mandlige ApoE−/− mus vejer omkring 25-26 g.
1. opløsning af aldosteron
- Opløses 5 mg af aldosteron pulver i 1 mL af absolut ethanol.
- Tilføj 56.7 µL af aldosteron (opløst i ethanol) til 68.3 µL af saltopløsning for at opnå en koncentration af 2,27 µg / µL. Fyld det hele osmotisk minipumps helt med 125 µL af denne løsning (maksimal kapacitet for hver minipump er 125 µL).
- Bruge en minipump gennemstrømningshastighed på 0,11 µL/h; Derfor 2,64 µL af opløsningen er udgivet hver 24 h. Give hver mus omkring 6 µg · d-1 af aldosteron i 28 dage.
2. osmotisk pumpe påfyldning og Implantation
Bemærk: Pumper leveres i to adskilte dele: hoveddelen af pumpen og flow regulator.
- Fylde og håndtere minipumps ved hjælp af kirurgiske handsker.
Bemærk: Hud olier kan påvirke ydeevnen af minipumps. Følgende trin skal udføres i en steril laminar flow hætte. - Tillægger en 1 mL sprøjte påfyldning røret (leveres med minipumps) og udarbejde aldosteron løsning eller køretøj.
Bemærk: Det er vigtigt at undgå at lade luften inde i sprøjten mens sugning løsninger fra rør til at forhindre dannelsen af luftbobler ind i pumpen. - Indsæt påfyldning røret gennem hullet i toppen af minipump, indtil det ikke kan gå længere (figur 1A-1B). Langsomt fyld pumpen med aldosteron eller køretøj. Bemærk den mørke skygge inde i pumpen med angivelse af væskeniveau. Se denne niveau stigning sammen med fyldet pumpe.
- Stoppe fylde pumpen når en perle af væske stiger ud af pumpen kroppen.
- Forsigtigt fjerne påfyldning røret og indsætte flow regulator i kroppen af minipump (figur 1 c). Sørg for at den regulerende myndighed sidder stramt mod pumpehuset. Forlade de fyldte osmotisk pumper i et bægerglas, der indeholder steril saltvandsopløsning ved 37 ° C i op til 24 timer før implantation i mus (priming procedure).
- Udføre kirurgi i et desinficeres med 70% ethanol, der fremmer aseptik.
- Påfør 1-3 dråber på indsnit stedet for 0,25% bupivacaine og bedøver dyr med 3% isofluran. Tænde levering gas og indstille flowmåler til 500-1000 mL/min. sted dyret i salen, induktion og forsegle toppen. Tænd vaporizer til 5% isofluran og overvåge mus indtil liggende.
- Skifte system til at flyde til nosecone. Fjerne dyret fra salen og position i nosecone. I 2-3 minutter begynder musen at vække. Genstart gasflow med flowmeter på 100-200 mL/min og vaporizer på 3% isofluran.
- Sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi før udførelse procedurer ved at teste pedal tilbagetrækning og øjenlågenes reflekser. Overvåge respiration og respons på stimulation under proceduren og justere vaporizer efter behov.
- Beskytte hornhinder mod udtørring ved at anvende en oftalmologiske salve.
- Forberede dyret ved at fjerne hår fra operationsstedet ved hjælp af en razor (fig. 1 d). Den sædvanlige site for subkutane implantation af pumper er på bagsiden.
- Forberede operationsstedet med nonwoven pad materiale mættet med 70% isopropylalkohol.
- Brug en ren og dedikeret plads (desinficeres med 70% ethanol) og dækket med en steril drapere. Placer spidsen af instrumenterne i et glas perle sterilizer. Begynde kirurgi med steriliserede instrumenter og håndtere instrumenter under aseptiske forhold.
- Brug kirurgisk saks til at gøre en 0,8-1 cm indsnit (ca 2 cm tæt på halen), som vist i tal 1E-1F. Opretholde sterilitet ved ikke at røre noget uden for den kirurgiske dedikeret plads med sterile handsker eller tips af instrumenter.
- Sørge for at skære kun huden, men ikke de underliggende væv. Brug én hånd til at holde pincet til at åbne snittet. Bruge anden hånden til at holde trokar at sprede huden for at skabe en lomme til pumpen fra bagsiden opad til scapula (på den højre eller venstre side af musen).
- Indsæt pumpen i snit. Forsigtigt skubbe pumpen helt ind i lommen (figur 1 H). Der bør være nok hud gratis at lukke såret med nogen spænding eller strækning af huden behov. Når pumpen er blevet indsat, sutur snit med kirurgi wire (polyglactin 910 med sutur størrelse 6-0)
Bemærk: Lederen af den regulerende myndighed skal være orienteret mod fronten af musen (figur 1 g). - Anvend aktuel 10% povidon/jod salve med en ren vatpind (figur 1I) og holde dyret på en opvarmning scene. Efterlad ikke mus i uden opsyn, indtil de inddrive brystbenet recumbency. Evaluere hydrering status og administrere 0,5 mL 0,9% saltopløsning subkutant, hvis nødvendigt. Returnere dyret til sin rutinemæssige boliger.
- De institutionelle retningslinjer for dokumentation (f.eks. udfylde en kirurgisk form med operativ og postoperativ information, opdatering buret kortet med procedure og dato) og give analgetika (buprenorphin, 0,05 mg/kg) for at mindske post-operative smerter og antibiotika (enrofloxacin 85 mg/kg) at undgå post-kirurgisk infektion.
- Fortsætte dagligt overvågning og undersøges for tegn på smerte. Være opmærksom på, at såret er helt lukket og minipump vedligeholdes i den subkutane lomme. Såret kan åbne og musen kan miste minipump.
3. dissektion af hjertet
- På tidspunktet for offer, anestethize mus med 80-100 mg/kg i Zoletil administrerede intramuskulært. Zoletil inducerer dyb anæstesi. Bemærk: Kontroller, at musene er i en passende dybde af anæstesi før udførelse procedurer ved at teste den pedal og øjenlågenes reflekser; mus vil være perfunderet mens dybt bedøvede. Åbn brysthulen, ved hjælp af saks og pincet, ved at skære ribbenene lateralt til brystbenet med brystbenet bliver trukket mod hovedet.
- Perfuse musen via venstre hjertekammer af tyngdekraften perfusion system med 10-15 mL iskold Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og derefter med 40-50 mL 10% af neutrale bufferet formalin til fix Vaskulaturen. Fiksering er indiceret, når musene udstille kraftige muskelsammentrækninger og bliver stiv.
Bemærk: Fastsættelse processen finder sted i 10-20 min. Det er muligt at bruge fast organer og væv til at udføre immunofluorescens eller Immunhistokemi analyser. Vigtigere, kan sådanne faste væv bruges til genekspression og western blotting analyser. - Adskille hjertet fra aorta ved at holde hjertet med pincet og skære med saks eller en skalpel klinge, vinkelret akse af aorta, så tæt som muligt til hjertet uden at forårsage skade (figur 2A). Bruge en skalpel kniv til at skære paa tvaers langs en lige linje, der forbinder de nederste punkter i højre og venstre atrium (figur 2B).
- Fyld den øverste del af sektioneret hjertet (gennem hulrum af hjertet) med optimal opskæring sammensatte (OLT) (figur 2D-2E). Sat væv inden for en cryosection plast skimmel med akse af aorta placeret vinkelret til bunden af rektangulære mug og dække med OCT (figur 2F). Der bør være nogen luftboble fanget. Hvis nogen boble er til stede, forsøge at fortrænge det til kanten.
- Placere en metal plade på tøris og derefter forsigtigt sætte formen på (fig. 2 g). Når OLT bliver hvid, wrap mug med sølvfolie og derefter opbevares ved –80 ° C.
4. skære dele af aorta-roden
- Indstil kryostaten machine til – 20 ° C. Før skæring, placere den indlejrede væv og lade det der for ca 15 min til at tilpasse sig til denne temperatur. Sat modellen holder temperatur-17 ° c (figur 3A).
- Læg den frosne hjerteblok inde i kryostaten maskinen til Reagensglasset temperatur af blok at der af kryostaterne (figur 3B) og tage ud de frosne hjerteblok fra mold (figur 3 c). Skær overskydende OLT fra den frosne blok at tilpasse blok dimensioner til præparatholderen (figur 3D).
- Montere de frosne hjerteblok på præparatholderen orienteret med den ventrikulære vender udad (figur 3E-3I) og indsætte præparatholderen i modellen orientere hoved (figur 3J). Justere retningen af præparatholderen tillade opskaering af blokken for at gøre aorta roden vinkelret på blade (figur 3 K).
- Skære blokken og kassér skiver indtil aorta roden er nået (figur 3 L-3N). Indsamle seriel sektioner og placere dem på glas dias (figur 3O). Overvåge aorta root anatomiske profil under mikroskop, indtil alle 3 aorta ventiler vises (figur 3 P-3Q).
- Indsamle sektioner på 10 µm/sektion for olie røde O og Picro Sirius rød farvning, og 6 µm/sektion for MAC3 farvning (figur 3R). Indsamle omkring 6-8 dias (for hver hjerte) indtil en af de tre ventiler forsvinder eller er ikke intakt længere.
5. Immunohistokemi
Bemærk: Alle farvning trin rapporteret i følgende protokoller er udført i glas Coplin farvning krukker.
-
Olie røde O pletten for neutrale fedtstoffer
- Løse dele i 70 mL af 37% formaldehyd i 5 min. Skyl godt i vand fra hanen og duppes off overskydende vand.
- 48 mL olie røde O (0,5% i isopropanol) fortyndes i 32 mL destilleret vand at få olie røde O 0,3%.
- Pletten sektioner i 70 mL olie røde o 0,3% for 10 min. vask sektionerne i tap vand i 10 min.
- Bejdse for 1 min i 70 mL af Mayers hæmatoxylin. Vask sektioner i vand fra hanen i 1 min.
- Fordyb sektioner i 70 mL af 0,5% lithium carbonat. Vaskes i rindende vand i 1 min.
- Montere sektioner med en vandig montering medium og tage billeder med et digital kamera monteret på en lysmikroskop.
-
Picro Sirius rød plet for kollagen
- Skær 10 µm frosne sektioner og montere i bunden af diaset.
- Løse dele i 70 mL af acetone i 5 min, luft tørre og skyl kort i destilleret vand.
- Placer sektioner i 70 mL 0,2% phosphormolybdæn syre i 5 min. Skyl kort i destilleret vand.
- Placer sektioner i 70 mL af 0,1% Picro Sirius løsning for 90 min. Skyl én gang med 70 mL 0,01 N HCl. kassér løsning.
- Sted i 70 mL 0,01 N HCL i 2 min. Skyl kortvarigt i destilleret vand. Lufttørre.
- Sted kort i 70 mL af 70% ethanol.
- Når helt tørt, sted i 70 mL clearing agent af terpen oprindelse og montere sektioner ved hjælp af poly (butyl methacrylat -co-methylmethacrylat) baseret montering medium og tage billeder med et digital kamera monteret på en lysmikroskop.
Bemærk: En af fordelene ved Picro Sirius rød farvning er, at det er muligt at skelne mellem typen I (tyk fibre, Gul-Orange dobbeltbrydning) og Type III (tynde fibre, grønne dobbeltbrydning) kollagen fiber netværk af polariseret lys mikroskopi11 .
-
Mac3 plet for makrofag farvning
- Skær 6 µm frosne sektioner og montere i bunden af diaset.
- Løse dele i 70 mL af kolde acetone i 5 min. Fordyb i 70 mL PBS for 2 min.
- Ved hjælp af en pipette, dække sektioner med 1% af sodium dodecyl sulfat (SDS) løsning og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur (RT) for antigen hentning. Fordyb dig i 70 mL PBS i 5 min.
- Ved hjælp af en pipette, dække skiver med 0,3% hydrogenperoxid i 20 min. Skyl i 70 mL PBS 3 gange i 5 min.
- Bruge begærlighed-Biotin komplekser (ABC)-HRP Kit til følgende trin.
- Ved hjælp af en pipette, blokere sektioner i Normal kanin serum ved stuetemperatur i 20 min. Ikke skylles ud.
- Pletten med MAC3 (1: 300) i 90 min. på RT. Wash i 70 mL PBS 3 gange i 5 min.
- Pletten med sekundær-biotinylated anti-rotte IgG (1:200) for 45 min på RT. skylles med 70 mL PBS 3 gange i 5 min.
- Dække sektioner med kanin IgG ABC for 30 min på RT. skylles med 30 mL PBS 3 gange i 5 min.
- Dække sektioner med 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) i 10 min. Skyl med 70 mL destilleret vand for 10 gange.
- Bejdse for 1 min i 70 mL af Mayers hæmatoxylin. Vask sektioner i vand fra hanen i 1 min.
- Fordyb sektioner i 70 mL 0,5% Lithiumcarbonat. Vaskes i rindende vand i 1 min.
- Montere sektioner med en vandig montering medium og tage billeder med et digital kamera monteret på en lysmikroskop.
6. billedanalyse af aterosklerotiske læsioner i aorta Root sektioner
Bemærk: Aorta root sektioner farves med olie røde O eller MAC3 eller et antistof interesse kan analyseres ved hjælp af passende software (angivet i Tabel af materialer). Total pixels farvning positive for komponenten af interesse er normaliseret til området samlede plak. Billeder blev indsamlet og analyseret af en behandling-blindet investigator.
-
Kalibrering
- Åbn software og vælg derefter billede (i jpg) der skal analyseres.
- Vælg Forside | Oprette | Hurtig kalibrering.
- Oprette kalibrering af billedet ved at tegne en linje langs baren skala af billedet.
- Gem opsætningen af kalibrering.
-
Billedanalyse
- Vælg den gemte setup kalibrering fra menuen Indstillinger | Rumlige kalibrering indstilling.
- Vælg kalibrering | Anvende.
- Vælg polygonværktøjet i menuen skal du vælge og trække kanten langs alle aterosklerotiske læsioner.
- Vælg Antal/størrelse | Typer. Fra menuen, tilføje område og Procent område.
- Antal/størrelse menuen, vil Vælg Manual og et nyt vindue åbne.
- I dette vindue skal du klikke på værktøjet Vælg farve på billedet og vælg HSI tilstand.
- Punkt musemarkøren på de positive pixels markering af interesse at skabe en vifte af farver.
- Klik på Count og værdien summen, observeret i Måling tabelAngiver procentdelen af området af markør (også udtrykt i µm2) med hensyn til det samlede areal af aterosklerotiske læsioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 8-10 uger Apo- / - mus, minipumps blev implanteret for at indgyde med køretøjet eller aldosteron (figur 1E-1I) og fodres en atherogene kost (justerede kalorier kost 42% fra fedt) i 4 uger. For enden af behandling blev mus aflivet og perfunderet med PBS og 10% formalin som beskrevet ovenfor. Aorta-roden blev adskilt fra den apikale del af hjertet og var indkapslet i oktober (figur 2). Tværsnit af aorta rødderne var forberedt på forskellige farvning ved hjælp af en kryostaten maskine (figur 3).
Aterosklerotisk plaque sammensætning kan karakteriseres gennem farvning for bestemte komponenter, som definerer plaque udviklingstrin. Olie røde O farvning bruges til at bestemme lipid indhold af aterosklerotiske læsioner, som beskrevet i trin 5.1, Picro Sirius rød farvning bruges til at bestemme kollagen indhold som beskrevet i trin 5.2 og Mac3 farvning er ansat til at måle makrofag indhold beskrevet i trin 5.3. Efter 4 ugers behandling med aldosteron, mus vises en betydelig stigning i lipid (figur 4A-4 C) og makrofag indhold (figur 4D-4F) i atherosklerotisk plaques på aorta rodniveau, men ingen forskelle var observeret i kollagen indhold (figur 4 g-4I) i forhold til mus behandlet med køretøjet. Faktisk, aldosteron accelereret atherogenesis i denne model, inducerende vaskulære betændelse men ikke fibrose (figur 4).
Figur 1. Forberedelse og implantation af osmotisk minipump med køretøjet eller aldosteron. A-B) foranstaltninger for at fylde osmotisk minipumps med køretøjet eller aldosteron. C) skridt til at lukke organ pumpe med flow regulator. D-F) Trin for at oprette et snit til implantation af pumpen på bagsiden af musen. G-jeg) Implantation af osmotisk minipump og sutur af incision. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Udarbejdelse af hjertet og aorta roden for indlejring og skæring. A-B) hjertet er skåret tværs langs en lige linje, der forbinder de nederste punkter i den højre og venstre atrium. Den apikale del af hjertet er behandlet for at kvantificere aterosklerotiske læsioner sammensætning i aorta-roden. C) aorta roden fra inde i hjertet. D-E) Fyldning af hjertet hulrum med oktober F) orientering af dissekerede hjertet i en mold fyldt med OCT (med hjertet hulrum i retning af bunden af mug) G) frysning af dissekerede hjertet med OCT i formen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skæring af aorta rod ved hjælp af en kryostaten mikrotom. A) pre cool kryostater og angive den rette temperatur til maskine og chuck. B-D) Solid OCT blok er adskilt fra formen og overskydende OLT omkring hjertet er elimineret ved hjælp af en vinge. E-jeg) Blok i OLT er fast, bruger flydende OLT, på støtte. J-K) Støtte er indsat i chuck og orienteret med den ventrikulære vender udad. L-M) Afsnit blokken indtil dissekeret hjertet er fuldstændigt eksponeret. N-O) Angive tykkelsen til 10 og/eller 6 µm og indsamle skiver på glasset. P-Q) Kontrollere tilstedeværelsen af alle tre ventiler under mikroskop. Rasmussen) efterfølgende skiver er indsamlet, som vist, indtil et eller flere ventiler ikke overholdes længere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af aterosklerotiske plak sammensætning i aldosteron - eller køretøj-behandlede ApoE- / -. A-B) repræsentative rød olie O farves tværsnit af aorta rod i 8-10 ugers-gamle ApoE- / - mus behandlet med køretøjet (A) eller aldosteron (B) og fodres en atherogene diæt i 4 uger. C) kvantificering af lipid indhold procentdel af positive farvning/total plak. D-E) Repræsentant Mac3 farves tværsnit af aorta rod. F) kvantificering af makrofag indhold procentdel af positive farvning/total plak. G-H) Repræsentant Picro Sirius røde farves tværsnit af aorta rod. jeg) kvantificering af kollagen indhold som en procentdel af positive farvning/total plaque område. Værdier udtrykkes som betyder ± standardafvigelse betyde (SEM; n = 6 for hver gruppe). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Åreforkalkning er en kronisk inflammatorisk sygdom forbundet med store og mellemstore fartøjer, der involverer samspillet mellem flere celletyper, såsom glat muskel celler1, endothelial celler, makrofager og T-lymfocytter. Trods murine atherogene modellers begrænsninger findes en stor mængde af beviser på den aterosklerotiske proces. Disse modeller har fordel af hurtigt genererer eksperimentelle kohorter af en bestemt alder og køn. Mus også vise en veldefineret og homogen genetiske baggrund.
Udvikling af aterosklerotiske plaques, observeret i musemodeller tilbøjelige til åreforkalkning, delvist ligner der observeret i forsøgspersoner, med undtagelse af ustabile plaques dannelse4. Plaque brud og efterfølgende trombose, den vigtigste årsag til myokardieinfarkt hos mennesker, er ikke observeret i murine atherogene modeller. I vores seneste papirer, viste vi, at infusion af aldosteron er i stand til at fremkalde, efter 4 uger, en ustabil plaque fænotype i ApoE- / -mus fodret en HFD10. I virkeligheden, er denne behandling stand til at øge plaque område, lipid indhold og inflammatoriske område på aorta rodniveau, med ingen signifikant forskel i kollagen indhold i forhold til ubehandlede mus10. Bemærk Vis disse mus øget udvikling af hypertension-uafhængig åreforkalkning, eftersom blodtryk ikke var væsentligt ændret af aldosteron behandling10.
I det foreliggende manuskript illustrere vi detaljeret teknisk procedure for at integrere hjertet væv i OLT samt sekventielle trin, dvs, aorta root afsnitsinddeling og plaque analyse. I forhold til paraffin, giver OCT afsnittet forberedelse med et højt udvalg af tykkelser (1-100 µm) med en kryostaten mikrotomen og minimal væv behandling. Begrænsninger kan omfatte kvaliteten af frosne væv, som er potentielt påvirket af dannelsen af iskrystaller og ændre subcellulært detaljer og generere artefakter kan spores af immunohistological farvning. Faktisk, kryopræservering menes at bedre bevare antigen og antigenicity. Faktisk bevare frossen væv strukturen af antigener. Derudover frossen væv behandling for Immunhistokemi gør det muligt for at undgå brugen af formalin, som er et giftigt og kræftfremkaldende stof.
Aorta-roden er en forholdsvis ligetil at identificere for histologiske behandling. Denne anatomiske site er en guld-standard til at studere aterosklerotisk læsion udvikling i mus tilbøjelige til åreforkalkning. Data opnået ved analyse af dette specifikke område tillade sammenligninger af mus tilhører samme gruppe eller forskellige eksperimentelle grupper. I virkeligheden, ved skæring af aorta-roden, er det let at genkende en bestemt region karakteriseret ved tilstedeværelsen af alle tre ventiler. For at opnå en bestemt region, er det strengt anbefales at være særligt opmærksomme på flere vigtige skridt under indlejring og skæring. Det er vigtigt at fylde hulrummet i den øverste del af sektioneret hjertet med OCT at undgå dannelsen af luftbobler i væv, der kan kompromittere integriteten af afsnittene. Desuden, for at sikre, at opskæring vinklen er nøjagtig vinkelret på den opstigende aorta ved skæring, det er nødvendigt at korrekt orientere øverste sektioneret hjertet vinkelret på bunden overfladen af væv skimmel. For at opnå intakt skiver, bør temperatur af kryostaterne være præcis ved-20 ° C. I virkeligheden, en lavere temperatur kan forringe kvaliteten af sektioner (dvs. bladet kunne smuldre afsnittene gør dem ubrugelige).
Af note, når de tre ventiler vises, er det anbefales at skære væv med forskellige tykkelser, afhængigt af den analyse, der skal udføres. I virkeligheden, nogle dias vil blive anvendt til bestemmelse af plaque progression, mens de resterende dias kan bruges til forskellige stainings (dvs., Picro Sirius, Mac3, osv.).
Aterosklerotiske læsioner i mus behandlet med aldosteron vises rig i lipid og makrofager karakteriseret ved brugen af olie røde O (for lipid farvning), Mac3 (for makrofag farvning), Sirius rød (for farvning af kollagen) eller andre specifikke antistoffer for proteiner af interesse. Det er vigtigt at fremhæve, OCT indlejring, i modsætning til paraffin indlejring, undgår brug af organiske opløsningsmidler, der fjerne lipid indholdet af læsioner. Derfor, lipid farvning med olie røde O er muligt i OCT-embedded sektioner og lipid indhold af aterosklerotiske plaques kan kvantificeres præcist.
I det foreliggende manuskript viste vi, at aldosteron infusion er en værdifuld metode til at fremme åreforkalkning i ApoE- / - mus. In fact, aldosteron infusion i ApoE- / - mus er i stand til at: 1) øge aktiveringen i endothelial celler, som det fremgår af den øgede udtryk for molekyler involveret i vedhæftning og migration af monocytter i de tidlige faser af aterosklerotiske plak dannelsen12,13; og 2) øge lipid og pro-inflammatoriske makrofager indhold på aorta root niveau10,13. Disse virkninger skyldes ikke hæmodynamiske virkninger af aldosteron10. Til sidst vil repræsenterer den foreslåede protokol en gyldig metode til at generere og karakterisere åreforkalkning i mus; Dette kunne hjælpe skærm tidlige stadier af sygdommen og resultater af terapeutisk intervention og rehabilitering i åreforkalkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den italienske sundhedsministerium (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 og PE-2011-02347070 til M.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
