Summary

Apolipoprotein E-불충분 한 쥐에 Mineralocorticoid 수용 체의 활성화를 통해 동맥 경 화성 플 라크의 유도

Published: September 26, 2018
doi:

Summary

우리는 호르몬의 지속적인 출시를 통해 atherogenic 다이어트 먹이 ApoE-/- 쥐의 대동맥 루트에서 동맥 경화를 유발 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한 플 라크 구성 하는 방법은 설명 합니다.

Abstract

동맥 경화 혈관 내 피에 영향을 미치는 만성 염증 반응 때문 이며 고혈압, dyslipidemia, 당뇨병 등 여러 가지 요인에 의해 추진 된다. 날짜 하려면, 심혈 관 질환의 개발에 대 한 위험 요인으로 호르몬 순환에 대 한 역할을 지 원하는 증거를 있다. 유전자 변형 마우스 모델 생성 동맥 경화로 이어지는 세포질과 분자 과정 연구. 이 원고에서 우리 ApoE-/- 생쥐에서 호르몬의 지속적인 주입의 활용 및 치료 4 주 후 대동맥 루트에서 동맥 경 화성 플 라크를 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는, 따라서, 정량화 및 대동맥 루트 수준에서 동맥 경 화성 병 변의 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 부가 가치 호르몬 주입의 치료 4 주 후 동맥 경 화성 병 변 풍부한 지질과 염증 세포의 생성으로 표시 됩니다. 우리 플 라크 안에서 지질 및 macrophage 콘텐츠 계량 얼룩 절차 자세히 설명. 특히,이 프로토콜에 우리 심장 심장 조직의 antigenicity을 보존 하 고 관심의 항 원의 검출을 용이 하 게 하기 위해 10 월에 조직 포함을 수행 합니다. 플 라크의 표현 형의 분석 동맥 경화 증 개발의 이상 공부 하 고 반대로 atherogenic 약물의 개발에 대 한 새로운 약리 목표를 식별 하는 유효한 접근 방식을 나타냅니다.

Introduction

동맥 경화는 사망률과 질병 률 세계1의 주요 원인 중 하나입니다. 그것은 혈관 혈액 지질과 동맥 경 화성 플 라크의 형성을 결정 하는 백혈구에 의해 침투는 만성 염증 성 상태에 의해 특징입니다. 대부분의 급성 심장 이벤트 패 파열 때문 thrombotic 이벤트와 연결 됩니다. 플 라크 파열 하는 경향이 “취약” 정의 그리고 프로-염증 성 백혈구, 괴 사 성 코어 얇은 섬유 뚜껑2증가 침투에 의해 특징입니다. 마지막 십 년간에서 임상과 실험적인 연구는 질병의 복잡 한 이상 명백 하 게. 여러 동물 모델 롬3의 유도에 관련 된 분자 메커니즘을 조사 하는 데 사용 됩니다. 현재, 마우스는 종의 차이가 인 간에 비해 그 이상에도 불구 하 고 동맥 경화 연구에 가장 자주 사용 되 종. 특히, 콜레스테롤을 순환 주로 구성 되어 고밀도 지 단백질 (antiatherogenic 속성)을 사용 하 여 마우스 모델에서 인간에서 회람 콜레스테롤은 주로 수송 저밀도 지 단백질 (LDL)로 하는 동안 아마 왜 야생-타입 마우스 자연 경화4를 개발 하지 않습니다 주된 이유를 나타내는. 또한, 야생 타입 마우스 인간 규정식 콜레스테롤4의 50% 정도 흡수 하는 반면 일반적으로 저항 다이어트에서 콜레스테롤을 흡수 하는. 이러한 한계를 극복 하기 위해 몇 가지 유전자 변형된 마우스 모델 생성. Apolipoprotein E-결핍 마우스 (ApoE/)와 LDL 수용 체-결핍 마우스 (LDLr/) 널리 이용 된다. 높은 콜레스테롤 수치, 높은 지방 다이어트, ApoE/ 마우스 빠르게 LDLr/마우스에 비해 더 많은 플 라크를 개발 하 고 이런 이유로, ApoE/ 마우스의 사용은 LDLr/마우스5,6의 보다 더 광범위 한 ApoE/ 마우스 동맥 경화 증의 어떤 단계에서 장애를 개발 하 고 마우스 패 불안정 형7을 표시 하지 않습니다 있지만 인간에서 관찰을 비교할 수 있습니다. 일반적으로, ApoE/ 마우스 저절로 아 테 롬을 개발 하 고이 과정 서 부 다이어트3가속. 동맥 경화 증의 심각도의 경 동맥, 폐, 대 퇴 및 brachiocephalic 동맥 및 대동맥 루트6수준에서 평가할 수 있습니다. 특히, 대동맥 루트는 해 부 사이트를 생쥐에서 동맥 경 화성 병 변을 개발 하는 경향이 나타냅니다. 이러한 이유로, 그것은이 지역에서 동맥 경 화성 플 라크의 형성 평가 하 관행 이다.

몇몇 연구는 호르몬 아 테 롬8,,910의 개발에 연루 나타났습니다. ApoE/ 쥐 먹이 atherogenic 다이어트 호르몬 주입 대동맥 루트 동맥 경 화성 병 변 염증 및 지질 부유한 패 형성10유도의 개발을 가속 화 합니다.

요약, 우리는 호르몬 주입, atherogenic 다이어트 먹이, ApoE-/- 생쥐에서 심장 조직, 정량화 및 동맥 경 화성 병 변의 특성의 포함을 포함 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 절차는 염증, 지질이 풍부한 동맥 경 화성 플 라크의 효율적인 형성을 촉진 하 고 atherogenesis의 연구에 대 한 귀중 한 모델을 나타냅니다.

Protocol

연구는 건강 관리의 이탈리아 국가 학회 및 사용 위원회, 인증 번호 493/2016-홍보에 의해 승인 되었다 모든 절차는 실험 동물의 사용에 대 한 유럽 공동체 지침 당 실시 했다 (유럽 지침 2010/63/UE). 참고: 차량 (염 분 해결책에 에탄올) 또는 호르몬을 포함 하는 삼 투 minipump의 피하 주입 (240 µ g · 킬로그램-1 · d-1) 8-10 주에-오래 된 남성 쥐 ApoE 유전자에 대 한 …

Representative Results

8-10 주 apo는-/- 생쥐, minipumps 차량 또는 호르몬에 이식 되었다 (그림 1E-1I) 4 주 (조정된 칼로리 다이어트 지방에서 42%)는 atherogenic 다이어트를 먹이. 치료의 끝에, 마우스는 안락사 되었고 PBS와 10% 포 르 말린 위에서 설명한 대로 끼얹는다. 대동맥 루트는 심장의 꼭대기 부분에서 분리 되었다 고 OCT (그림 2)에 ?…

Discussion

동맥 경화 증 여러 세포 유형, 대 식 세포, T 세포, 내 피 세포 및 평활 근 세포1등 간의 상호 작용을 포함 하는 대형 및 중형 배와 관련 된 만성 염증 성 질환 이다. Murine atherogenic 모델의 한계에도 불구 하 고 동맥 경 화성 프로세스에 대 한 증거의 큰 몸은 사용할 수 있는. 이러한 모델 특정 나이 및 성별 실험 동료를 빠르게 생성의 이점이 있다. 마우스도 정의 하 고 균질 유전 배경?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 이탈리아의 보건 (검색 전류 GR-2009-1594563, 엠씨에 PE-2011-02347070)에서 교부 금에 의해 지원 되었다

Materials

Adjusted calories diet (42 % from fat) Envigo TD.88137 atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube Alzet model 1004 for continous realase
Aldosterone SIGMA A9477 hormone
Ethanol SIGMA 34852-M solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol Kendal Webcol 6818 Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0) Demas 500004 surgery
10% Povidone/iodine ointment Aplicare-Meriden 52380-0026-1 Antiseptic
Formalin 10% SIGMA HT5012 to fix vascolature
Cryomold Bio-Optica 07-MP1515 for embedding
O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583 for embedding
Cryostat Leica CM1900 instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline Aurogene AU-L0615-500 buffer solution
Adhesion Slides Polysine VWR 631-0107 microscope glasses
Cover Glasses Bio-Optica 72015 cover glasses
Formaldehyde 37% SIGMA 252549 solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) SIGMA O1391 staining solution
Mayer’s Hematoxylin SIGMA MHS32 staining solution
Lithium Carbonate SIGMA 62470 washing buffer
Acqueous Mounting Medium Thermo Scientific TA-125-AM mounting solution
Acetone SIGMA 179124 solvent
Phosphomolybdic acid solution SIGMA HT153 for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red) SIGMA 365548 staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin) Bio-Optica 06-1782D product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) SIGMA 3989 mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate Fluka 71725 powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %) SIGMA H1009 solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , Vector Laboratories PK-6100 staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole Vector Laboratories SK-4200 staining solution
Mac3 antibody BD Biosciences 553322 antibody
ImagePro Premier 9 Media Cybernetics 050910000-2534 software to analyze images

References

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Cite This Article
Marzolla, V., Armani, A., Mammi, C., Feraco, A., Caprio, M. Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice. J. Vis. Exp. (139), e58303, doi:10.3791/58303 (2018).

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