Summary
אנו מתארים פרוטוקול לזירוז טרשת עורקים אצל שורש אבי העורקים ספקיות- / - עכברים שקיבלו עם דיאטה atherogenic, באמצעות שחרור רצוף של אלדוסטרון. שיטות לאפיון הרכב הפלאק מתוארים גם.
Abstract
טרשת עורקים היא עקב תגובה דלקתית כרונית המשפיעים על אנדותל כלי הדם, הוא קידום על ידי מספר גורמים כגון יתר לחץ דם, dyslipidemia וסוכרת. נכון להיום, אין ראיות כדי לתמוך תפקיד עבור מחזור אלדוסטרון כגורם סיכון להתפתחות של מחלות לב וכלי דם. מודלים מהונדס העכבר נוצרו ללמוד תהליכים תאית ומולקולרית שמוביל טרשת עורקים. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מנצל תקינות של אלדוסטרון בעכברים- / - ספקיות ומייצר הפלאק טרשת עורקים בספריית הבסיס של אבי העורקים לאחר 4 שבועות של טיפול. אנו, לכן, ממחישים שיטה כימות ואפיון של נגעים טרשת עורקים ברמת הבסיס של אבי העורקים. הערך המוסף של אלדוסטרון אינפוזיה מיוצג על ידי הדור של עתיר השומנים ותאים דלקתיים התרדמה לאחר 4 שבועות של טיפול. נתאר בפירוט ההליכים מכתימים לכמת השומנים ותוכן מקרופאג בתוך הפלאק. ראוי לציין, ב פרוטוקול זה, אנו מבצעים לב רקמות-הטבעה ב- OCT כדי לשמר את antigenicity של רקמת הלב וכדי להקל על detectability של אנטיגנים של עניין. ניתוח של פנוטיפ הפלקיו מייצג גישה חוקית ללמוד הפתופיזיולוגיה של התפתחות טרשת עורקים, וכן לזיהוי מטרות תרופתי חדשניים לפיתוח תרופות אנטי-atherogenic.
Introduction
טרשת עורקים הוא אחד הגורמים העיקריים לתמותה ותחלואה ברחבי העולם1. הוא מאופיין על-ידי מצב דלקתי כרוני שבו כלי הדם הם הסתננו ליפידים, לויקוציטים הקובעות את היווצרות הפלאק טרשת עורקים. הרוב המכריע של אירועי לב חריפה משויכות אירועים קדחת עקב קרע פלאק. שלטי נוטה להיקרע מוגדרים "פגיע", מאופיינים על ידי חדירה מוגברת של לויקוציטים הפרו דלקתיים, גרעין נמק כיפה סיבית דק2. בעשרות השנים האחרונות, מחקרים קליניים וניסויים הבהירו הפתופיזיולוגיה המורכבת של המחלה. מספר מודלים בעלי חיים משמשים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים אינדוקציה של טרשת עורקים3. כיום, העכבר הוא המין הנפוצות ביותר לחקר טרשת עורקים למרות כמה הבדלים תלויי מין הקיים שלה פתופסיולוגיה לעומת בני אדם. בפרט, במחזור הכולסטרול מורכבת בעיקר על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (עם מאפיינים antiatherogenic) במודלים של העכבר, ואילו אצל בני אדם במחזור כולסטרול בעיקר מועבר כמו ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL), כנראה ייצוג הסיבה העיקרית למה עכברים פראי-סוג לא לפתח טרשת עורקים ספונטני4. יתר על כן, פראי סוג עכברים הם בדרך כלל עמידים בפני ספיגת כולסטרול מן הדיאטה, ואילו בני אדם לספוג בסביבות 50% כולסטרול תזונתיים4. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נוצרו מספר מודלים מהונדס גנטית עכבר. עכבר אפוליפופרוטאין E – לקויה (ספקיות−/−) ועכבר לקויה – קולטן LDL (−/LDLr−) נמצאים בשימוש נרחב. דיאטה עתירת שומן כולסטרול גבוה, עכברים− −/ספקיות להתפתח פלאק יותר במהירות בהשוואה לעכברים−−/LDLr, וכי מסיבה זו, הוא השימוש של ספקיות עכברים− −/ נפוצה יותר מזו של LDLr−/−עכברים5,6. העכברים− −/ספקיות לפתח נגעים בכל שלב של טרשת עורקים, דומות לאלה שנמדדו בבני אדם, למרות הפלאק העכבר אינם מראים על פנוטיפ לא יציב7. באופן כללי, ספקיות עכברים− −/באופן ספונטני לפתח טרשת עורקים, תהליך זה מואץ עם הדיאטה המערבית3. ניתן להעריך את חומרת טרשת עורקים ברמה של בעורק, ריאות, הירך עורק brachiocephalic ואת שורש אבי העורקים6. בפרט, בסיס אב העורקים מייצג אתר אנטומי נוטה לפתח התרדמה בעכברים. מסיבה זו, זה מנהג נפוץ כדי להעריך את היווצרות הפלאק טרשת עורקים באזור זה.
מספר מחקרים הראו שכי אלדוסטרון הוא מעורב בפיתוח של טרשת עורקים8,9,10. אלדוסטרון אינפוזיה אצל ספקיות−/− עכברים שקיבלו תזונה atherogenic מאיצה את התפתחות שורש אבי העורקים התרדמה גרימת היווצרות הפלאק מודלק ועשיר השומנים10.
לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול כולל אלדוסטרון אינפוזיה, דיאטה atherogenic האכלה, ההטמעה של רקמות הלב, כימות ואפיון של טרשת עורקים בעכברים- / - ספקיות. הליך זה מקדם מערך יעיל של הפלאק טרשת עורקים מודלק, השומנים-עשיר והוא מייצג את מודל ערך עבור המחקר של atherogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר היה אושרה על ידי האיטלקי מוסדות של הבריאות לשימוש ועדות, אישור מספר 493/2016-PR. כל ההליכים נערכו לפי ההנחיות של הקהילה האירופית לשימוש של חיות ניסוי (הדירקטיבה האירופית, 2010/63/מורה).
הערה: השתלה תת עורית של osmotic minipump המכיל הרכב (אתנול בתמיסת) או אלדוסטרון (240 µg · ק ג-1 · ד-1) בשבוע 8-10-בן זכר עכברים לקוי עבור הגן ספקיות . גנרל, שבוע 8-10-בן זכר ספקיות−/− עכברים שוקל בסביבות 25-26 g.
1. המסת אלדוסטרון
- להמיס 5 מ"ג של אבקת אלדוסטרון ב 1 מ"ל אתנול מוחלטת.
- להוסיף µL 56.7 של אלדוסטרון (מומס באתנול) µL 68.3 תמיסת מלח על מנת לקבל ריכוז של 2.27 µg / µL. למלא את minipumps osmotic שלם לחלוטין עם µL 125 של פתרון זה (קיבולת מקסימלית של כל minipump הוא 125 µL).
- השתמש בקצב זרימת minipump של 0.11 µL/h; לכן µL 2.64 של הפתרון הוא שוחרר בכל ה 24 לתת כל עכבר בסביבות 6 µg · ד-1 של אלדוסטרון במשך 28 ימים.
2. osmotic משאבת דלק, השרשה
הערה: משאבות מסופקים בשני חלקים נפרדים: הגוף העיקרי של המשאבה ואת הרגולטורים זרימה.
- מילוי וטפל את minipumps באמצעות כפפות כירורגי.
הערה: שמנים העור עלולים להפריע הביצועים של minipumps. השלבים הבאים יש לבצעו בשכונה זרימה שכבתית סטרילי. - לצרף את הצינור מילוי (מסופק עם minipumps) מזרק 1 מ"ל וצייר את הפתרון אלדוסטרון או רכב.
הערה: חשוב להימנע לתת אוויר בתוך המזרק תוך כ רפה בעברית פתרונות מהצינור כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר לתוך למשאבה. - הכנס את הצינור מילוי דרך החור בראש minipump עד שזה יכול ללכת יותר (איור 1A-1B). לאט לאט למלא את המשאבה אלדוסטרון או רכב. שים לב צל כהה בתוך המשאבה המציין את רמת הנוזלים. Watch שהזריחה רמת ביחד עם המשאבה מילוי.
- תפסיק למלא את המשאבה כאשר חרוז של נוזל עולה אל מחוץ לגוף המשאבה.
- בזהירות להסיר את הצינור מילוי והכנס את ווסת הזרימה לתוך גופו של minipump (איור 1C). ודא כי הרגולטורים מוכנס בחוזקה נגד הגוף משאבת. השאירו את המשאבות osmotic מלא גביע המכיל תמיסת סטרילית ב 37 ° C עבור עד 24 שעות לפני ההשתלה העכבר (הליך לקרקע).
- לערוך ניתוח באזור חיטוי עם אתנול 70% המקדם asepsis.
- החל 1-3 טיפות באתר החתך של 0.25% נמשך, עזים ומתנגד החיה עם 3% איזופלוריין. להפעיל את אספקת הגז מוגדר זרימה 500-1000 מ ל לדקה במקום החיה בבית הבליעה אינדוקציה, חותם העליון. הפעל את מכשיר אידוי לאיזופלוריין 5% ולאחר לפקח על העכבר עד שכיבה.
- להחליף את המערכת מזרימה nosecone. הסר את החיה החדר והמיקום ב nosecone. ב- 2-3 דקות, העכבר מתחיל להתעורר. הפעל מחדש את זרימת הגז של זרימה ב- 100-200 מ ל/דקה, מאדה ב- 3% איזופלוריין.
- להבטיח עומק נאותה של הרדמה לפני ביצוע הליכים על ידי בדיקות נסיגה פדלים ורפלקסים palpebral. לפקח על הנשימה והתגובה גירוי במהלך ההליך ולהתאים מאדה כנדרש.
- להגן על הקרנית ממנו להתייבש על-ידי החלת משחה אופטלמולוגיות.
- הכן את החיה על ידי הסרת שיער באתר כירורגית בעזרת סכין גילוח (איור 1D). האתר הרגיל עבור השתלה תת עורית של משאבות נמצאת מאחור.
- הכנת האתר כירורגית עם חומר משטח לא ארוגים רווי אלכוהול איזופרופיל 70%.
- השתמש ברווח נקי ומסור (חיטוי עם 70% אתנול) ומכוסה תלוי סטרילי. מקם הקצה של כלי הנגינה מעקר חרוז זכוכית. להתחיל את הניתוח בכלים סטיריליים וטפל מכשירי גילוח ורחיצה כירורגית.
- השתמש מספריים כירורגיים כדי להפוך 0.8-1 ס מ החתך (בערך 2 ס מ בקרבת הזנב), כפי שמוצג דמויות 1E-1F. לשמור על עקרות מאת לא לגעת בשום דבר מחוץ החלל ייעודי כירורגית עם כפפות סטריליות או טיפים של מכשירים.
- לטפל כדי לחתוך רק את העור אבל לא את רקמות הבסיסית. להשתמש ביד אחת כדי להחזיק מלקחיים כדי לפתוח את החתך. תשתמש ביד השנייה כדי להחזיק את הנקז להפיץ את העור על מנת ליצור כיס עבור המשאבה מהחלק האחורי כלפי מעלה אל עצם השכם (בצד ימין או שמאל של העכבר).
- הכנס את המשאבה לתוך החתך. דחף בעדינות את המשאבה לחלוטין לתוך הכיס (איור 1 H). צריך להיות מספיק עור בחינם לסגור את הפצע עם אין מתח או מתיחה של העור זקוק. ברגע המשאבה הוכנס, תפר את החיתוך בחוט ניתוח (polyglactin 910 עם תפר גודל 6-0...)
הערה: בראש של הרגולטורים חייב להיות שכיוונו כלפי החזית של העכבר (איור 1 ג'י). - החלת משחה povidone/יוד 10% אקטואלי עם מקלון נקי (איור 1I) ולשמור את החיה על הבמה התחממות כדור הארץ. לא להשאיר את עכברים בבית ללא השגחה עד שהם להתאושש recumbency בחזה ובצלעות. להעריך את מצב הידרציה ולפקח 0.5 מ ל תמיסת 0.9% subcutaneously במידת הצורך. להחזיר את החיה לדיור שגרתית שלה.
- עקוב אחר ההנחיות מוסדיים לתיעוד (למשל, למלא טופס ניתוח מידע פעיל ואחרי הניתוח, עדכון כרטיס כלוב עם הליך ותאריך) לספק משככי כאבים (הבופרנורפין, 0.05 מ"ג/ק"ג) כדי להפחית כאב לאחר ניתוח, אנטיביוטיקה (enrofloxacin 85 מ"ג/ק"ג) כדי למנוע זיהום לאחר ניתוח.
- נמשיך לעקוב מדי יום ולבחון סימנים של כאב. שים לב כי הפצע סגור לחלוטין, minipump נשמרת לתוך הכיס תת עורית. לפתוח הפצע, העכבר עלול לאבד את minipump.
3. ניתוח הלב
- בזמנו של הקרבה, עכברים anestethize עם 80-100 מ"ג/ק"ג של Zoletil מנוהל intramuscularly. Zoletil גורם הרדמה עמוקה. הערה: לבדוק כי עכברים הם בעומק נאותה של הרדמה לפני ביצוע הליכים על-ידי בדיקת את הדוושה ורפלקסים palpebral; להיות perfused עכברים בזמן עמוקות מורדם. פתח את חלל בית החזה, בעזרת מספריים, מלקחיים, על ידי חיתוך רוחבית הצלעות לעצם החזה, עם עצם החזה להיות מההצעה לכיוון הראש.
- Perfuse העכבר דרך החדר השמאלי על ידי מערכת זלוף המשיכה עם 10-15 מ ל תמיסת מלח של Dulbecco קר כקרח פוספט buffered (PBS) ולאחר מכן עם 40-50 מ"ל של 10% נייטרלי פורמלין במאגר כדי לתקן את להערכת. קיבוע מסומן כאשר העכברים התערוכה התכווצות שרירים נמרצת להיות נוקשה.
הערה: תהליך תיקון מתקיים בעוד 10-20 דקות. זה אפשרי לשימוש קבוע איברים ורקמות כדי לבצע immunofluorescence או אימונוהיסטוכימיה ניתוחים. חשוב, רקמות קבועים אלה אינם יכולים לשמש עבור ביטוי גנים וניתוחים סופג המערבי. - להפריד בין הלב לבין אבי העורקים על ידי החזקת את הלב עם המלקחיים וחיתוך עם מספריים או סכין אזמל, בניצב לציר של אבי העורקים, קרוב ככל האפשר ללב ללא גרימת נזק (איור 2 א). להשתמש בלהב סכין לחתוך באופן רוחבי לאורך קו ישר המחבר את הנקודות התחתון של הפרוזדור מימין ומשמאל (איור 2B).
- למלא את החלק העליון של הלב המחולקת למקטעים (דרך החלל של הלב) עם תרכובת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) (איור דו-ממדי-2E). לשים את הרקמה בתוך תבנית פלסטיק cryosection עם הציר של אבי העורקים מניחים בניצב לבסיס של עובש מלבני, לכסות עם OCT (2F איור). צריך להיות אין בועת אוויר לכוד. אם כל בועה, לנסות לתפוס אותו לקצה.
- מניחים צלחת מתכת על קרח יבש, אז בזהירות עם העובש (איור 2G). OCT הופך לבן, לעטוף את התבנית בנייר כסף ולאחר מכן אחסן ב –80 ° c
4. חיתוך חלקים של שורש אבי העורקים
- הגדר את המכונה cryostat –20 מעלות צלזיוס. לפני חיתוך, למקם את הרקמה מוטבע, להשאיר אותו שם למשך כ 15 דקות להתאמת טמפרטורה זו. הגדר את הטמפרטורה מחזיק הדגימה-17 מעלות צלזיוס (איור 3 א).
- מניחים את גוש הלב הקפוא בתוך המכונה cryostat equilibrate הטמפרטורה של גוש לזה של cryostat (איור 3B) ולהוציא מהבניין הלב הקפוא העובש (איור 3C). חותכים את ה-OCT. עודף מהגוש קפואים כדאי להתאים את מידות בלוק עם בעלי הדגימה (דמות תלת-ממד).
- הר הרחוב הלב הקפוא את המחזיק הדגימה מונחה עם פונה חדרית החוצה (איור 3E-3עכשיו) ולהוסיפה בעל הדגימה הדגימה המכוונת את הראש (איור 3J). התאם את הכיוון של בעל הדגימה כדי לאפשר חיתוך של הרחוב על מנת להפוך את בסיס אב העורקים בניצב הלהב (איור 3 K).
- חותכים את גוש ולמחוק את הפרוסות עד שורש אבי העורקים (איור 3 L-3N). איסוף מקטעים טורי ומניחים בשקופיות זכוכית (איור 3O). לפקח את הפרופיל האנטומי של בסיס אב העורקים מתחת למיקרוסקופ עד יופיעו כל השסתומים אבי העורקים 3 (איור 3 P-3Q).
- לאסוף את סעיפים 10 מיקרומטר בסעיף עבור שמן אדום O ו- Picro סיריוס אדום מכתים, ו-6 מיקרומטר/מקטע עבור MAC3 מכתים (איור 3R). לאסוף סביב 6-8 שקופיות (עבור כל לב) עד שאחד השסתומים שלושה נעלמת או אינה שלמה יותר.
5. אימונוהיסטוכימיה
הערה: כל השלבים מכתימים דיווחו הפרוטוקולים הבאים מבוצעות בצנצנות זכוכית Coplin מוכתמים.
-
שמן כתם אדום O עבור שומנים נייטרלי
- לתקן מקטעים 70 מ של 37% פורמלדהיד עבור 5 דק לשטוף היטב במי ברז, למחוק את עודף המים.
- לדלל 48 מ של שמן אדום O (0.5% אלכוהול איזופרופיל) ב- 32 מ"ל של מים מזוקקים כדי להשיג שמן אדום O 0.3%.
- כתם ובסעיף 70 מ של שמן אדום O 0.3% עבור 10 דקות לשטוף ובסעיף הקש מים למשך 10 דקות.
- כתם על 1 דקות ב- 70 מ של Hematoxylin של מאייר. רחץ מקטעים בתוך מים פושרים במשך 1 דקה.
- לטבול ובסעיף 70 מ של 0.5% ליתיום קרבונט. לשטוף במי ברז עבור 1 דקות.
- הר מקטעים עם הרכבה מימית בינונית, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על מיקרוסקופ אור.
-
סיריוס Picro אדום כתם על קולגן
- לחתוך 10 מיקרומטר קפוא מקטעים והר בתחתית של השקופית.
- לתקן מקטעים 70 מ של אצטון עבור 5 דקות, אוויר יבש, שטיפה קצרה במים מזוקקים.
- מקום סעיפים 70 מ של 0.2% חומצה phosphomolybdic עבור 5 דק שטיפה קצרה במים מזוקקים.
- מקום סעיפים 70 מ של 0.1% Picro סיריוס לפתרון 90 דקות יש לשטוף פעם אחת עם 70 מ של פתרון למחוק HCl. N 0.01.
- במקום 70 מ של HCl N 0.01 עבור 2 דק שטיפה קצרה בתוך מים מזוקקים. אוויר יבש.
- המקום בקצרה 70 מ של 70% אתנול.
- כאשר יבש לחלוטין, מקום 70 מ של ניקוי סוכן ממוצא terpene והר האיזורים השונים בחשבון בעזרת פולי (בוטיל methacrylate -co-חומצתי) המבוסס על הרכבה בינונית, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על מיקרוסקופ אור.
הערה: אחד היתרונות של ההכתמה Picro סיריוס אדום הוא שניתן להבחין בסוג אני (סיבי עבה, שבירה כפולה צהוב כתום), רשתות סיבי קולגן סוג III (סיבי דק, שבירה כפולה ירוק) על ידי מיקרוסקופ אור מקוטב11 .
-
Mac3 הכתם עבור מקרופאג מכתים
- לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר קפוא והר בתחתית של השקופית.
- לתקן מקטעים 70 מ של אצטון קר במשך 5 דק Immerse ב 70 מ של PBS למשך 2 דקות.
- באמצעות פיפטה של, לכסות חלקים עם 1% של נתרן dodecyl חומצה גופרתית (מרחביות) פתרון, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לאחזור אנטיגן. לטבול 70 מ של PBS במשך 5 דקות.
- באמצעות פיפטה של, לכסות את הפרוסות עם 0.3% חמצן עבור 20 דק. שטיפת ב 70 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- השתמש מתחמי אבידין-ביוטין (ABC)-HRP קיט על השלבים הבאים.
- באמצעות פיפטה של, לחסום מקטעים בנסיוב ארנב רגיל בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. אין לשטוף.
- כתם עם MAC3 (1:300) במשך 90 דקות בשטיפת RT. ב 70 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- כתם עם תת-biotinylated אנטי חולדה אג (1:200) עבור 45 min-שטיפה RT. 70 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- מכסים את הסעיפים עם הארנב אג ABC למשך 30 דקות ב- RT. שטיפה עם 30 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- מכסים את הסעיפים עם 3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC) במשך 10 דקות יש לשטוף עם 70 מ של מים מזוקקים עבור 10 פעמים.
- כתם על 1 דקות ב- 70 מ של Hematoxylin של מאייר. רחץ מקטעים בתוך מים פושרים במשך 1 דקה.
- לטבול ובסעיף 70 מ של 0.5% ליתיום קרבונט. לשטוף במי ברז עבור 1 דקות.
- הר מקטעים עם הרכבה מימית בינונית, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על מיקרוסקופ אור.
6. תמונות ניתוח של התרדמה בסעיפים בסיס אב העורקים
הערה: בסיס אב העורקים סעיפים מוכתמים בשמן האדום O או MAC3 או נוגדן עניין ניתן לנתח באמצעות תוכנה מתאימה (המצוין בטבלה של חומרים). פיקסלים הכולל צביעת חיובי עבור הרכיב עניין מנורמל לאזור פלאק הכוללת. תמונות שנאספו, נותחו על ידי חוקר עיוור טיפול.
-
כיול
- לפתוח את התוכנה, ולאחר מכן בחר את התמונה (ב- jpg) כדי להיות מנותח.
- בחר את דף הבית | צור | כיול מהירה.
- להגדיר את הכיול של התמונה על ידי ציור קו לאורך הבר קנה המידה של התמונה.
- שמור את הכיוונון של כיול.
-
ניתוח תמונות
- בחר הכיול ההתקנה שנשמרו מתפריט האפשרויות | אפשרות כיול מרחבית.
- בחר כיול | להחיל.
- בחר בכלי מצולע בתפריט בחר וצייר את האזור לאורך כל התרדמה.
- בחר Count/גודל | סוגים. מתפריט ', הוסף אזור ואזור אחוזים.
- מהתפריט ספירה/גודל , בחר ידני , חלון חדש יפתח.
- מן החלון לחץ על הכלי לבחור צבע על התמונה , בחר מצב HSI במצב.
- נקודת סמן העכבר על הפיקסלים חיובית של סמן עניין כדי ליצור מגוון של צבעים.
- לחץ על ספירת ומציין הערך Sum, שנצפתה המדידה בטבלה, האחוז של האזור של דה מרקר (גם הביע מיקרומטר2) ביחס שטח טרשת עורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעוד 8-10 שבועות Apo- / - עכברים, minipumps שהיו מושתלים כדי להשרות עם הרכב או אלדוסטרון (איור 1E-1I) והאכילה של דיאטה atherogenic (מנוכי עונתיות קלוריות דיאטה 42% שומן) למשך 4 שבועות. בסוף הטיפול, עכברים היו מורדמים, perfused עם PBS ו 10% פורמלין כמתואר לעיל. בסיס אב העורקים הופרד מן החלק הפסגה של הלב, הוטבע באוקטובר (איור 2). חתכי רוחב של שורש אבי העורקים הוכנו עבור צביעת שונים באמצעות מכונה cryostat (איור 3).
הרכב הפלאק טרשת עורקים ניתן לאפיין באמצעות צביעה עבור רכיבים ספציפיים, המגדירות את התפתחות פלאק. צביעת אדום O שמן משמש לקביעת תוכן שומני של טרשת עורקים כפי שמתואר בשלב 5.1, Picro סיריוס אדום מכתים משמש לקביעת תוכן קולגן כפי שמתואר בשלב 5.2 ו Mac3 מכתים מועסק כדי למדוד את תוכן מקרופאג תיאר בשלב 5.3. לאחר 4 שבועות של טיפול עם אלדוסטרון, עכברים מוצג עלייה משמעותית השומנים (איור 4A-4 C) מקרופאג תוכן (איור 4D-4F) בתוך הפלאקים טרשת עורקים ברמת הבסיס של אבי העורקים, אך אין הבדלים היו אצל קולגן תוכן (איור 4G-4I) לעומת עכברים שטופלו הרכב. אכן, אלדוסטרון מואץ atherogenesis במודל זה, וגורם לדלקת בכלי הדם אבל לא פיברוזיס (איור 4).
איור 1. השרשת osmotic minipump עם רכב או אלדוסטרון והכנה. A-B) צעדים למילוי osmotic minipumps רכב או אלדוסטרון. C) הפעולות הבאות כדי לסגור את הגוף של משאבת בווסת זרימת. D-F) השלבים ליצירת חתך עבור ההשתלה של המשאבה בחלק האחורי של העכבר. G-אני) השרשת osmotic minipump, תפירת החתך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. הכנת את הלב ואת שורש אבי העורקים הטבעה ואת חלוקתה. A-B) הלב נחתך באופן רוחבי לאורך קו ישר המחבר את הנקודות התחתון של האטריום ימינה ושמאלה. החלק הפסגה של הלב מעובד לכמת טרשת עורקים קומפוזיציה ב בסיס אב העורקים. C) בסיס אב העורקים מ בתוך הלב. D-E) מילוי של חלל הלב עם אוקטובר F) הכיוון של הלב תבנית גזור מראש מלא OCT (עם חלל הלב בכיוון של החלק התחתון של עובש) G) קפוא של הלב ביתור עם OCT העובש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. חלוקתה של שורש אבי העורקים באמצעות מיקרוטום של cryostat. A) מראש מגניב של cryostat ולהגדיר את הטמפרטורה הנכונה עבור המכונה, צ'אק. B-D) המוצק OCT בלוק מופרד כייר, OCT עודף סביב הלב חוסלה באמצעות סכין. E-אני) גוש OCT קבוע, באמצעות OCT נוזלי, על התמיכה. J-K) התמיכה יש להוסיף את הצ'אק, מונחה עם חדרית פונה החוצה. י-ם) קטע הרחוב עד הלב ביתור חשוף לחלוטין. N-O) להגדיר את העובי 10 ו/או 6 מיקרומטר ולאסוף את הפרוסות על הזכוכית. P-Q) לבדוק הנוכחות של שסתומים שלוש מתחת למיקרוסקופ. R) פרוסות עוקבים נאספים, כפי שמוצג, עד שסתומים אחד או יותר שאינם קיימים יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. כימות של הרכב הפלאק טרשת עורקים, אלדוסטרון או רכב-שטופלו ספקיות- / -. A-B) O נציג של שמן אדום צבעונית חתכי רוחב של שורש אבי העורקים בשבוע 8-10-עכברים- / - ספקיות הישן מטופלים עם הרכב (A) או אלדוסטרון (B) והאכילה של דיאטה atherogenic למשך 4 שבועות. C) כימות של תוכן שומני כאחוז של פלאק מכתים/סה כ חיובי באזור. D-E) נציג Mac3 מוכתם חתכי רוחב של שורש אבי העורקים. F) כימות של תוכן מקרופאג כאחוז של פלאק מכתים/סה כ חיובי באזור. G-H) נציג Picro סיריוס אדום מוכתם חתכי רוחב של שורש אבי העורקים. אני) כימות של קולגן תוכן כאחוז של פלאק מכתים/סה כ חיובי באזור. הערכים מבוטאים אומר ± שגיאת התקן מתכוון (SEM; n = 6 עבור כל קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טרשת עורקים היא הפרעה דלקתית כרונית המשויך כלי שיט גדולים ובינוניים, מעורבים האינטראקציות בין סוגי תאים מרובים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים, תאי אנדותל, תאי שריר חלק1. למרות המגבלות של מודלים atherogenic מאתר, גוף גדול של ראיות על תהליך טרשת עורקים הינה זמינה. מודלים אלה יש יתרון במהירות לייצר גדודים ניסיוני של גיל מסוים או מגדר. עכברים להראות גם רקע גנטי מוגדר ולא הומוגנית.
ההתפתחות של טרשת עורקים הפלאק, נצפתה במודלים של העכבר נוטה טרשת עורקים, חלקית דומה שתצפית של ניסויים, חוץ היווצרות הפלאק לא יציבה4. פקקת עוקבות, הגורם העיקרי של אוטם שריר הלב בבני אדם, ולמסמנים של פלאק לא נצפית במודלים atherogenic מאתר בעיתונים האחרונה שלנו, הראינו כי אינפוזיה של אלדוסטרון הוא מסוגל לגרום, לאחר 4 שבועות, פנוטיפ פלאק לא יציב בעכברים- / -ספקיות האכיל HFD של10. למעשה, טיפול זה הוא מסוגל להגדיל אזור פלאק, תוכן שומני ואזור דלקתיות ברמת בסיס אב העורקים, עם הבדל משמעותי בתוכן קולגן לעומת עכברים ללא טיפול10. ראוי לציין, עכברים אלה מראים מוגבר להתפתחות טרשת עורקים ללא תלות יתר לחץ דם, בהתחשב בכך לחץ דם לא שונה באופן משמעותי על ידי אלדוסטרון טיפול10.
בכתב היד הנוכחי, אנו ממחישים בפירוט ההליך הטכני כדי להטביע את רקמת הלב באוקטובר, כמו גם את השלבים רציפים, קרי, בסיס אב העורקים חלוקתה פלאק וניתוח. בהשוואה לפרפין, OCT מאפשר סעיף הכנה במגוון עוביים (1-100 מיקרומטר) גבוה עם cryostat מיקרוטום, עיבוד מינימלי רקמות. מגבלות כוללים את האיכות של רקמה קפוא, אשר מושפע באופן פוטנציאלי היווצרות גבישי קרח, ו ניתן לשנות פרטים subcellular, יצירת חפצים לזיהוי על-ידי immunohistological מכתים. אכן, הקפאה קריוגנית נחשב כדאי לשמר אנטיגן antigenicity. למעשה, רקמות קפוא לשמר את המבנה של אנטיגנים. יתר על כן, רקמות קפוא לעיבוד אימונוהיסטוכימיה מאפשרת למנוע את השימוש פורמלין, אשר הוא תרכובת רעילים ומסרטנים.
בסיס אב העורקים הוא אתר פשוטה יחסית לזהות לעיבוד היסטולוגית. אתר אנטומי זה הוא תקן הזהב ללמוד התפתחות הנגע טרשת עורקים בעכברים נוטה טרשת עורקים. נתונים שהושגו על ידי הניתוח של אזור ספציפי זה לאפשר השוואות בין עכברים השייכים לאותה קבוצה או קבוצות ניסוי שונות. למעשה, במהלך חלוקתה של שורש אבי העורקים, קל לזהות אזור מסוים מאופיין על ידי הנוכחות של שלושה שסתומים. על מנת לקבל כזה אזור מסוים, מומלץ בהחלט לשלם תשומת לב מיוחדת מספר שלבים קריטיים במהלך ההטמעה והשיוך חלוקתה. חשוב למלא את חלל הבטן של החלק העליון של הלב משרטוטי OCT כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בתוך הרקמה יכול לסכן את השלמות של הסעיפים. יתר על כן, על מנת להבטיח כי הזווית חיתוך בניצב בדיוק אבי העורקים במהלך חלוקתה, יש צורך כראוי אוריינט בלב משרטוטי העליון בניצב למשטח התחתון של העובש רקמות. על מנת לקבל פרוסות ללא פגע, הטמפרטורה של cryostat צריכה להיות בדיוק ב-20 ° C. למעשה, בטמפרטורה נמוכה יכול לסכן את האיכות של מקטעים (כלומר, הלהב יכולה להתפורר הסעיפים שהופך אותם לבלתי שמיש).
ראוי לציין, כאשר מופיעים שלושה המסתמים, מומלץ לחתוך את הרקמה בעוביים שונים, בהתאם לסוג הניתוח שיבוצעו. למעשה, אראה לכם כמה שקופיות ישמש לקביעת התקדמות פלאק, ואילו השקופיות הנותרים שיכול לשמש עבור stainings שונים (כלומר., סיריוס Picro, Mac3, וכו '.).
התרדמה עכברים שטופלו אלדוסטרון מופיעים עתיר השומנים ו מקרופאגים מאופיין על ידי שימוש שמן אדום O (עבור צביעת שומנים בדם), Mac3 (עבור צביעת מקרופאג), סיריוס אדום (עבור ההכתמה של קולגן) או אחרים נוגדנים ספציפיים עבור חלבונים עניין. חשוב להדגיש כי OCT הטבעה, בניגוד פרפין הטבעה, מונע את השימוש בממיסים אורגניים להסיר את התוכן השומנים של נגעים. לכן, השומנים מכתים עם שמן אדום O הוא ריאלי בסעיפים OCT-מוטבע, תוכן שומני של הפלאק טרשת עורקים ניתן לכמת במדויק.
בכתב היד נוכח הראינו כי אלדוסטרון אינפוזיה היא שיטה יקר כדי לקדם טרשת עורקים בעכברים- / - ספקיות. . In fact, אלדוסטרון אינפוזיה בעכברים- / - ספקיות הוא מסוגל: 1) להגדיל את ההפעלה של תאי אנדותל, כפי שמוצג על ידי ביטוי מוגבר של מולקולות מעורב הדבקה והעברה של monocytes כבר בשלבים מוקדמים של פלאק טרשת עורקים היווצרות12,13; ו- 2) להגדיל את השומנים ותוכן מקרופאגים הפרו דלקתיים-בסיס אב העורקים ברמה10,13. תופעות אלה אינן בשל בגרימת תופעות של אלדוסטרון10. לסיכום, הפרוטוקול המוצע מייצג שיטה חוקית ליצירה לאפיין טרשת עורקים אצל עכברים; . זה יכול לעזור צג בשלבים המוקדמים של המחלה ותוצאות של התערבות טיפולית ושיקום של טרשת עורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים איטלקי משרד הבריאות (החיפוש אחר Corrente, GR-2009-1594563 ו- PE-2011-02347070 כדי קונליס)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
