Summary
Her, mus blod blev indsamlet i nærværelse af en anti-koagulans. Trombocytterne blev renset ved Iohexol gradient medium ved hjælp af lav hastighed centrifugering. Trombocytterne blev aktiveret med thrombin for at undersøge, om de var levedygtige. Kvaliteten af de rensede blodplader blev analyseret ved flow cytometri og mikroskopi.
Abstract
Blodplader renses fra fuldblod for at studere deres funktionelle egenskaber, som bør være fri for røde blodlegemer (RBC), hvide blodlegemer (WBC), og plasmaproteiner. Vi beskriver her rensning af blodplader fra muse blod ved hjælp af tre gange mere Iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volumen og centrifugering i en svingende skovl rotor ved 400 x g i 20 min ved 20 °c. Genindvinding/udbytte af de rensede trombocytter var 18,2-38,5%, og de rensede blodplader var i hviletilstand, som ikke indeholdt et signifikant antal RBC og WBC. De rensede trombocytter, der blev behandlet med thrombin, viste en aktivering på op til 93%, hvilket indikerer deres levedygtighed. Vi bekræftede, at de rensede blodplader er tilstrækkeligt rene ved hjælp af flow cytometrisk og mikroskopisk evaluering. Disse blodplader kan bruges til genekspression, aktivering, granula frigivelse, aggregering, og vedhæftning assays. Denne metode kan bruges til rensning af blodplader fra blodet af andre arter samt.
Introduction
Trombocytter er en bestanddel af blod, der fungerer som en igangsætter af blodpropper som reaktion på skader i blodkar. De samles på stedet for skade til at sætte fartøjet væg1. Trombocytter er anucleate fragmenter af cytoplasma afledt af megakaryocytter af knoglemarv under indflydelse af trombopoietin og komme ind i cirkulation2. De betragtes som metabolisk aktive og i stand til at sensing ekstracellulære miljø ved at aktivere intracellulære signalering kaskader, der resulterer i trombocytspredning, aggregering, og hæmostatiske stik formation1,3. Udover hæmostase/trombose og sårheling4, spiller blodpladerne en vigtig rolle i Host inflammatoriske reaktioner, angiogenese, og metastatis3,5,6,7, 8. den er
Blodplader renses fra blodet for at studere deres biokemiske og fysiologiske egenskaber, som bør være fri for andre blodkomponenter. Da røde blodlegemer (RBC) og hvide blodlegemer (WBC) indeholder signifikant mere RNA og proteiner end blodplader9,10, tilstedeværelsen af selv et lille antal af disse celler kan forstyrre transkriptomic og proteomiske analyser af RNA proteiner afledt af blodplader. Vi konstaterede, at rensede blodplader aktiveret med Trombin binde antistof såsom anti-GPIIb/IIIa (JON/A) og anti-P-selectin mere effektivt end fuldblod plader.
Da trombocytterne er skrøbelige, er det vigtigt at behandle prøverne så mildt som muligt. Hvis trombocytterne er aktiveret, frigiver de deres granuler indhold og i sidste ende nedbrydes. Derfor, for at holde trombocytternes funktionelle egenskaber intakt, er det vigtigt at opretholde trombocytaggregation under isolation. Flere protokoller har beskrevet isolation af blodplader fra Human, hund, rotte, og ikke-menneskelige primat ved forskellige metoder1,10,11,12. Nogle af de metoder, der kræver flere trin såsom indsamling af trombocyttal-rige plasma ved centrifugering, filtrering ved separation kolonne, negativ udvælgelse af blodplader med RBC-og WBC-specifikke antistof konjugeret til magnetiske perler, og så videre, som er tidskrævende og kan forringe blodpladerne og deres indhold.
Ford og hans kolleger beskrev blodplade rensning fra humant blod ved hjælp af Iohexol medium11. Denne metode bruger en lignende volumen af blodprøve og medium under rensningen. Da mennesker giver en højere volumen af blod, er det relativt let at rense trombocytterne.
Iohexol er et universelt densitets gradient inert medium, der er frit opløseligt i vand og anvendes i fraktionering af nukleinsyrer, proteiner, polysaccharider og nucleoproteiner13,14. Det har lav osmolalitet og er giftfri, hvilket gør det til et ideelt medium til rensning af intakte levende celler11. Det er et ikke-partikel medium; Derfor kan fordelingen af celler i en gradient bestemmes ved hjælp af hemocytometer, flow cytometer eller spektrofotomometer. Det forstyrrer ikke det meste af den enzymatiske eller kemiske reaktion af cellerne eller cellulære fragmenter efter fortynding.
Musen tjener som en vigtig dyremodel for mange menneskelige sygdomme15,16,17,18. Der er et par udgivne artikler, der beskriver rensning af muse plader19,20. Men, musen giver en relativt mindre volumen af blod, hvilket gør det vanskeligt at rense blodplader. Hvis den samme lille mængde gradient medium og blodprøver anvendes, kan trombocytlaget ikke klart adskilles fra RBC-WBC-lag efter centrifugering. I denne artikel, vi har beskrevet en hurtig og enkel metode til mus trombocytoprensning med tre-fold mere Iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volumen og lav hastighed centrifugering. Vi har også aktiveret de rensede blodplader med Trombin og undersøgt deres kvalitet med flow cytometri og mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blodindsamling bør gennemføres med passende institutionel dyrepasning og brug udvalg godkendelse.
Bemærk: Trombocytrensnings protokollen er beskrevet i et flowdiagram i figur 1.
1. indsamling af blod
- Der tilsættes 25 μL 3,2% natriumcitrat (pH 7,2) som antikoagulerende og 0,4 mM Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) i et polypropylen-rør.
-
Der opsamles ca. 200 μL blod fra C57BL/6-musen ved hjælp af retroorbital blødning.
Bemærk: der kan indsamles blod fra enhver type musestamme uanset alder eller køn.- Brug 2 mL isofluran i en hvilken som helst type kammer til at bedøve musen.
Bemærk: Dybde af anæstesi kontrolleres af tegn på øget respiration og nedsat bevægelse. Musen bør ikke reagere på bevægelse af anæstesi kammer, eller til at blive håndteret. Hvis musen er lydhør over for bevægelse eller håndtering, så det kræver mere tid til at holde i anæstesi kammer. - 1.2.2 Åbn enten højre eller venstre øjenlåg af musen og Indsæt en 7,5 cm (0,12 cm diameter) kapillarrør i øjets vaskulære plexus.
- Drej Kapillarrøret en halv omdrejning, mens du anvender Tryk på Kapillarrøret for at bryde blodkarrene og initiere blodgennemstrømning. Hold dyret på hovedet over den samling hætteglas, der skal fyldes med kapillar handling.
- Når den passende mængde blod er indsamlet, fjerne Kapillarrøret og lukke øjet ved at anvende mildt Tryk for 30 s på øjenlåget med gaze. Når blødning er stoppet, returnere musen til sit bur og Monitor for blødning.
- Kontrollér øjnene for traumer 1-2 dage efter retroorbital blødning. Fjern enhver mus fra studiet, der viser tegn på signifikant traume i øjet som følge af proceduren og euthanize.
Bemærk: Musen bør ikke undergår nogen form for behandling, som kan hæmme trombocytter i mindst to uger før blod opsamling. Blodprøven skal anvendes til trombocytrensning inden for en time efter blødning af musen.
- Brug 2 mL isofluran i en hvilken som helst type kammer til at bedøve musen.
2. trombocytrensning
Bemærk: Trombocytrensning skal udføres ved stuetemperatur for at forhindre nedbrydning. Sørg for, at reagensernes og instrumenternes temperatur er mellem 18 og 22 °C. For at forhindre trombocytnedbrydning bør hurtig pipettering og kraftig omrystning undgås under proceduren.
- Der tilsættes 600 μL iohexolgradient medium (12% iohexolpulver i 0,85% natriumchlorid, 5 mM Tricin, pH 7,2)11 i et 1,5 ml rør.
- Tilsæt 200 μL blodprøve langsomt ned ad siden af røret oven på gradient mediet med en bred bore pipettespids, således at blod og Iohexol medium ikke blandes (figur 2a).
- Den prøve, der indeholder røret, centrifugeres ved 400 x g i 20 min ved 20 °c i en svinge skovl rotor med langsom acceleration og deceleration.
- Det meste af det trombocythæmmende lag og en lille brøkdel af det blodplade fattige lag (i alt 300 til 400 μL) opsamles ved hjælp af en bred bore pipettespids uden at forstyrre RBC-og WBC-lagene (figur 2b). Blodplade prøven overføres til et nyt rør.
Bemærk: Hvis trombocyttallet er mindre i blodet eller en mindre mængde blod bruges, kan det trombocytrige lag og trombocytfattige lag ses som et enkelt lag. - Der tilsættes 1 mL PBS til trombocytprøven, blandes ved invertering, og der centrifugeres ved 800 x g i 10 min ved 20 °c i en sving skovl rotor. Opløsningen kasseres fuldstændigt, og der tilsættes 200 μL PBS for at resuspendere trombocytterne med mild pipettering.
Bemærk: Dette trin er valgfrit, da det fjerner gradient medium og plasmaproteiner og øger følsomheden af blodplader til agonister såsom thrombin. Da forskellige centrifuger har forskellige programmer, kan den langsomme acceleration/deceleration bestemmes ved at læse brugermanualen til centrifugen. - Overfør 30 μL af denne prøve til et nyt rør for at tælle blodpladerne. De resterende blodplader kan anvendes til biokemiske og fysiologiske analyser såsom trombocytaktivering, aggregering, granula frigivelse, etc.
- Ved RNA-eller proteinekstraktion centrifugeres trombocytprøven ved 800 x g i 10 minutter for at pille trombocytterne. Kassér supernatanten helt uden at forstyrre pellet. Tilsæt det ønskede volumen af RNA eller protein lysis buffer for at lysere trombocytterne.
3. optælling af trombocytterne
- Du kan tælle hele blodcellerne uden fortynding og rensede blodplader (fortyndet 2 til 5 gange med PBS) ved hjælp af en automatiseret celle analysator. Brug 30 til 50 μL prøver til optælling.
- Det totale antal blodplader beregnes ved at multiplicere med prøvens volumen.
- Beregn procentdelen af udbytte/genvinding af rensede blodplader.
- Tæl RBC og WBC i den rensede trombocytprøve (fortyndet 50 til 100-fold med PBS) med et hemocytometer og mikroskop.
4. trombocytaktivering
- I et rør tilsættes 1 til 2.000.000 rensede blodplader i op til 100 μL farvnings buffer (PBS med 2% føtale kvægserum, FBS).
- For flere antal prøver, lav en masterblanding af antistoffer med 1 μL (0,5 mg/mL) af følgende: PE-Cy7 rat anti-mus TER 119, PE rotte anti-mus CD45, FITC rotte anti-mus CD41, og APC rotte anti-mus/Human CD62P (P-selectin) at detektere RBC, WBC, trombocytter, og henholdsvis aktiverede trombocytter. Tilsæt masterblandingen til rørene for farvning af cellerne. Tilsæt ikke thrombin.
- I et andet rør tilsættes 1 til 2.000.000 af oprensede blodplader i op til 100 μL farvnings buffer og 0,4 mM GPRP peptid. Tilsæt Trombin for at aktivere trombocytterne og plette cellerne efter trin 4,2.
Bemærk: GPRP skal tilsættes til prøven, før der tilsættes thrombin for at forhindre aggregat-eller koagulations dannelse gennem trombocytaktivering. Thrombin koncentrationen bør optimeres for at opnå god aktivering af blodplader. Efter trombocytaktiveringen reduceres antallet af hændelser under indkøbet af prøver ved flow cytometri. - Som en positiv kontrol tilsættes 1 μL fuldblod i op til 100 μL farvnings buffer i et rør og 0,4 mM GPRP peptid. Tilsæt Trombin for at aktivere trombocytter. Som negativ kontrol tilsættes 1 μL fuldblod i op til 100 μL farvnings buffer. Der må ikke tilsættes thrombin i en negativ kontrolprøve. Pletten cellerne efter trin 4,2.
- For flow cytometri isotype kontrol, etiket 5 rør med ufarvede, PE-Cy7, PE, FITC, og APC. Der tilsættes 100 μL farvnings buffer, 1 μL blod og 1 μL af det respektive antistof til de mærkede rør for at plette cellerne.
- Der inkubeeres prøver til farvning i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Prøverne vaskes ved tilsætning af 1 mL farvnings buffer til hvert rør. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Kassér farvnings bufferen forsigtigt uden at smide den ud.
- Der tilsættes 300 μL farvnings buffer til hvert rør, blandes mildt og overføres til et FACS-rør. Opbevar de farvede prøver i mørke, indtil de analyseres med et flow cytometer.
5. flow cytometri analyser af blodplader
-
Oprette et nyt eksperiment og generere log Forward scatter vs log side scatter punktplot og tildele porte til Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (trombocytter), og CD62P APC (aktiverede trombocytter) populationer i henhold til den gating strategi valgt for test i FACS DIVA-softwaren.
- Åbn befolknings hierarkiet ved at vælge Vis populations hierarki under fanen populationer . Rediger befolknings hierarkiet ved at kontrollere den gating strategi og korrekt omdøbning af portene.
- Åbn statistik visning ved at vælge Opret statistik visning. Rediger statistik visningen i henhold til brugerindstillinger ved at højreklikke på statistik visningen og vælge Rediger statistik visning.
- Vælg en farve for hver port, der forbedrer det visuelle aspekt af layoutet ved at dobbeltklikke på boksen, der svarer til befolkningen.
- I vinduet cytometer skal du klikke på fanen parametre og justere spændinger for parametre for at visualisere den population af interesse på observationsområderne.
- Juster spændinger for hver af parametrene, så den negative population kan skelnes fra den positive population. Før du optager prøverne til kompensations kontrol, skal du kontrollere, at den enkeltfarvede positive kontrol er på skalaen (Sørg for, at de positive toppe er synlige og ikke for langt til højre).
Bemærk: Hvis de positive toppe er slukket skala, spændinger bør justeres for at se de positive populationer. - Optag enkelt farve farvede celler til kompensations kontrol (ufarvede, PE-Cy7, PE, FITC og APC).
- Hvis de positive kontrol porte ikke er indstillet korrekt, skal du justere dem ved at ændre spændinger.
- Gå til eksperiment ≫ kompensations opsætning ≫ Beregn kompensation. Vælg Anvend kun i det resulterende vindue.
- Skift til det globale regneark ved at klikke på til/fra-knappen øverst til venstre i regnearksvinduet.
- Indlæs den positive kontrolprøve og erhverve nok celler til at justere kompensationen og portene.
- Stikprøven igen, og kontrollér, at hvert enkelt plot viser den forventede cellepopulation baseret på det fluorokrom farvede antistof. Få og Optag 100.000 hændelser for fuldblodsprøver og 10.000 hændelser for rensede blodplader. Indlæs prøverne én efter én, indtil anskaffelsen er fuldført.
- Analysér flow cytometri data med softwaren med passende plot og porte (figur 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resuméet af trombocytoprensningen er beskrevet i et flowdiagram (figur 1). Trin omfatter opsamling af blod fra mus ved hjælp af retroorbital blødning i tilstedeværelsen af en antikoagulerende middel, tilsætning af blodprøve på Iohexol gradient medium, centrifugering i en svingende skovl rotor ved 400 x g i 20 min ved 20 °c. Kvaliteten af de rensede blodplader blev evalueret med mikroskopi og flow cytometri efter farvning med antistof til påvisning af kontaminerende celler og aktiverede trombocytter.
Iohexolgradient mediet og blodprøven dannede to separate lag i røret, hvis blodet langsomt blev tilsat på mediet (figur 2a). Men hvis der er forsinkelse i dette trin, de fleste af blodprøven kunne diffus i mediet, og det kan være vanskeligt at rense trombocytterne. De brede pipettespidser sikrede ingen fysisk belastning af trombocytterne, hvilket er vigtigt for at opretholde integriteten af trombocytterne og forhindre deres nedbrydning. Under centrifugering hjalp langsom acceleration med at forhindre utilsigtet blanding af blodprøven med Iohexol medium og langsom deceleration hjalp med at opretholde gradient efter centrifugering. Den øverste (halm farve) lag indeholdt plasma og ikke indeholder nogen typer af intakte blodlegemer, det andet lag (hvidlig) fra toppen indeholdt størstedelen af de blodplader, som blev indsamlet ved hjælp af en bred-bore pipettespids, det tredje lag (gennemsigtig) var trombocyttal, som blev delvist indsamlet omhyggeligt for at undgå aspiration af bundlaget (rødt) RBC og WBC (figur 2b). Det trombocythæmmende lag og det blod pladefattige lag kunne ikke ses adskilt, hvis trombocyttallet var lavt i blodprøven. RBC og WBC lag kunne ikke ses som separate lag, da blodvolumen var lille. Men, WBC danner et hvidt lag, kaldet Buffy coat mellem trombocyttal fattige lag og RBC lag, hvis en større mængde blod bruges til rensning10, 11. Det er vigtigt at gennemføre hele proceduren ved 18 til 22 °C. Både den højere temperatur og køling af prøverne gav lavere trombocyttal på grund af nedbrydning.
Vi fandt 18,2 til 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) genvinding/udbytte af de rensede blodplader. For at undersøge deres levedygtighed blev de rensede trombocytprøver aktiveret med thrombin. Flow cytometrisk analyse af trombocyttal prøver blev udført efter farvning med markører for trombocytter, aktiverede trombocytter, RBC, og WBC. Hele blodet viste forskellige populationer af RBC, WBC og blodplader på en logaritmisk frem-scatter mod side scatter prik-plot (figur 3a), hvorimod de rensede blodplader viste en tydelig population med et ubetydeligt antal RBC og WBC (figur 3b ). Hele blodet viste RBC og WBC efter farvning dem med anti-mus Ter119 og anti-mus CD45-antistof (figur 3c), hvorimod de rensede blodplader viste ubetydelige antal RBC og WBC (figur 3D). Vi evaluerede den rensede trombocytprøve med et mikroskop og kunne ikke se noget signifikant antal intakte RBC og WBC. Derfor kan RBC-og WBC-hændelserne, som blev vist i figur 3D , være fragmenter af RBC og WBC, der indeholder henholdsvis TER119 og CD45. Rensede blodplader, som ikke blev behandlet med thrombin, viste næsten ingen aktivering, der indikerede deres hviletilstand (figur 3E), hvorimod rensede blodplader behandlet med thrombin viste 71% aktivering (op til 93% aktivering blev observeret i nogle prøver) ( Figur 3F) med angivelse af deres levedygtighed. Vi udførte også mikroskopisk vurdering af rensede trombocytprøver, der ikke var behandlet med thrombin, som ikke udviste trombocytaggregation (figur 4a), men rensede trombocytter dannede aggregater efter behandling med thrombin (figur 4b). som yderligere viser deres levedygtighed. Baseret på flow cytometriske og mikroskopiske undersøgelser, vi bekræftede, at vores rensede blodplader var god kvalitet.
Figur 1: skematisk diagram til rensning af muse trombocytter. Blodprøve fra mus opsamles i nærværelse af en antikoagulerende middel. Blodprøven tilsættes langsomt til Iohexol gradient medium og centrifugeres ved 400 x g i 20 min ved 20 °c. Trombocytlaget overføres til et nyt rør. Kvaliteten af rensede blodplader kontrolleres med mikroskopi og flow cytometri. Trombocytterne kan anvendes straks eller opbevares ved-80 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Muse blod før og efter centrifugering med Iohexol gradient medium. (A) Iohexol og blod danner to separate lag før centrifugering, hvis blodprøven tilsættes forsigtigt. Venstre panel viser skematisk diagram og højre panel viser det faktiske billede. B) der ses fire særskilte lag efter centrifugering af fuldblod med gradient medium. Venstre panel viser skematisk diagram af lagene og højre panel viser det faktiske billede. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: flow cytometrisk analyse af rensede blodplader. (A) fuldblod viser RBC, WBC, og trombocyttal populationer. B) oprensede blodplader udviser et mindre antal RBC-og WBC-hændelser. (C) fuldblod viser RBC og WBC efter farvning med anti-mus Ter119 og anti-mus CD45. (D) oprensede blodplader viser et ubetydeligt antal RBC-og WBC-hændelser efter farvning med anti-muse-Ter119 og anti-muse CD45. (E) rensede trombocytter plettet med anti-Mouse CD41 og anti-mus/Human P-selectin viser næsten ingen trombocytaktivering. (F) rensede blodplader behandlet med Trombin og plettet med anti-Mouse CD41 og anti-mus/Human P-selektin show aktivering af blodplader. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mikroskopisk vurdering af rensede blodplader. A) rensede blodplader udviser ingen aggregering. B) rensede blodplader behandlet med thrombin show Aggregation. Begge tal er 200x forstørrelse, okulær linse 10x og objektiv linse 20x. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Almindeligvis isoleres blodpladerne ved centrifugering med lav hastighed, hvilket giver blodpladerigt plasma, der indeholder et betydeligt antal blodlegemer, cellulære rester og plasmaproteiner, som kan forstyrre de biokemiske og fysiologiske analyser og behov yderligere rensning21. Derfor er det vigtigt at bruge en hurtig og enkel metode, som kan give rene blodplader uden større forurenende stoffer. Den protokol, der præsenteres her beskriver rensning af blodplader fra muse blod ved hjælp af et gradient medium med lav hastighed centrifugering. De parametre, der anvendes i denne protokol maksimere udbyttet og minimere nedbrydningen af blodplader. Gradient medium og plasmaproteiner kan fjernes ved at inkludere et vaske trin efter trombocytsamlingen, som kan øge følsomheden af blodplader til agonist eller antistof. Vigtigst af alt, de rensede blodplader er i hviletilstand, men de kan aktiveres i nærværelse af en agonist, såsom thrombin. Vi har konstateret, at thrombin aktivitet varierer fra den ene kilde til den anden. Derfor bør thrombin koncentrationen optimeres empirisk for at opnå god aktivering af trombocytter.
På grund af en lille mængde af muse blod, det er ubelejligt at rense blodplader, fordi blodplader kan blandes med RBC og WBC under aspiration. Vi har løst dette problem ved at optimere forholdet mellem blodprøve og gradient medium. Vi har konstateret, at tre gange mere gradient medium i forhold til blodvolumen kan tydeligt adskille trombocytlag fra serum og RBC-WBC lag, som letter nem indsamling af rene blodplader.
Trombocytrensning skal udføres ved stuetemperatur mellem 18 og 22 °C for at forhindre, at de nedbrydes. Det er blevet rapporteret, at trombocytterne nedbrydes, hvis de opbevares i køleskab eller temperaturer over 27 °C11. Hurtig pipettering og kraftig omrystning bør undgås for at forhindre trombocytnedbrydning under rensningen. Da forskellige centrifuger har forskellige programmer, bør acceleration/deceleration bestemmes empirisk for at opretholde gradienten.
Hvis der anvendes flere muse blodprøver i rensningen, bør blødningen foretages på mindre end 1 time, og rensningen skal være færdig næste inden for 1 time. Hvis blodprøverne er tilbage i mere end 2 timer, kan blodpladerne ikke renses på grund af deres nedbrydning. Hvis der er behov for flere blodplader til enhver undersøgelse, kan musens blod opsamles ved Terminal procedurer såsom hjerte punktering eller ringere Vena cava blødning, som giver 800 til 1.000 μL blod, og trombocytrensning skal udføres i flere rør og kombineret efter rensning.
Afslutningsvis har vi beskrevet en enkel og hurtig protokol for trombocytrensning fra en lille mængde muse blod. Denne metode kan også anvendes til trombocytrensning fra andre arter samt. De rensede blodplader kan bruges til genekspression, aktivering og granulater frigivelse, aggregering, og vedhæftning analyser efter stimulation med forskellige agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en opstartsfinansiering af Cincinnati children's Research Foundation og et University of Cincinnati pilot translational Grant til M.N. Vi vil gerne takke Cincinnati children's Hospital Research flow cytometry Core for deres tjenester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
