Summary
Ici, le sang de la souris a été recueilli en présence d’un anti-coagulant. Les plaquettes ont été purifiées par le milieu gradient Iohexol en utilisant une centrifugation à faible vitesse. Les plaquettes ont été activées avec la thrombine pour enquêter si elles étaient viables. La qualité des plaquettes purifiées a été analysée par cytométrie en flux et microscopie.
Abstract
Les plaquettes sont purifiées du sang entier pour étudier leurs propriétés fonctionnelles, qui doivent être exemptes de globules rouges (RBC), de globules blancs (WBC) et de protéines plasmatiques. Nous décrivons ici la purification des plaquettes du sang de souris en utilisant trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et la centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La récupération/rendement des plaquettes purifiées était de 18,2-38,5%, et les plaquettes purifiées étaient dans un état de repos, ce qui ne contenait aucun nombre significatif de RBC et de WBC. Les plaquettes purifiées traitées avec la thrombine ont montré une activation jusqu’à 93%, ce qui indique leur viabilité. Nous avons confirmé que les plaquettes purifiées sont suffisamment pures en utilisant l’évaluation cytométrique et microscopique du flux. Ces plaquettes peuvent être utilisées pour l’expression génique, l’activation, la libération de granule, l’agrégation et les essais d’adhérence. Cette méthode peut être utilisée pour la purification des plaquettes du sang d’autres espèces ainsi.
Introduction
Les plaquettes sont un composant du sang qui fonctionne comme un initiateur de la coagulation sanguine en réponse aux dommages dans le vaisseau sanguin. Ils se réunissent sur le site de blessure pour brancher la paroi du navire1. Les plaquettes sont des fragments anucléés de cytoplasme dérivés des mégakaryocytes de la moelle osseuse sous l’influence de la thrombopoïétine et entrent dans la circulation2. Ils sont considérés comme métaboliquement actifs et capables de détecter l’environnement extracellulaire en activant des cascades de signalisation intracellulaires qui entraînent une propagation plaquettaire, une agrégation et une formation de prise hémostatique1,3. Outre l’hémostase/thrombose et la guérison des plaies4, les plaquettes jouent un rôle important dans les réponses inflammatoires de l’hôte, l’angiogenèse et les métastatis3,5,6,7, le 8.
Les plaquettes sont purifiées du sang pour étudier leurs propriétés biochimiques et physiologiques, qui doivent être exemptes d’autres composants sanguins. Puisque les globules rouges (RBC) et les globules blancs (WBC) contiennent significativement plus d’ARN et de protéines que les plaquettes9,10, la présence même d’un petit nombre de ces cellules peut interférer avec les analyses transcriptomiques et protéomiques de l’ARN protéines dérivées de plaquettes. Nous avons constaté que les plaquettes purifiées activées avec l’anticorps de grippage de thrombine tels que l’anti-GPIIb/IIIa (JON/A) et l’anti-P-selectin plus efficacement que les plaquettes sanguines entières.
Étant donné que les plaquettes sont fragiles, il est important de traiter les échantillons aussi légèrement que possible. Si les plaquettes sont activées, elles libèrent leur contenu de granule et finissent par se dégrader. Par conséquent, pour conserver les propriétés fonctionnelles des plaquettes intactes, il est important de maintenir la quiescence plaquettaire pendant l’isolement. Plusieurs protocoles ont décrit l’isolement des plaquettes de l’homme, du chien, du rat et du primat non humain par diverses méthodes1,10,11,12. Certaines méthodes requièrent plusieurs étapes telles que la collecte de plasma riche en plaquettes par centrifugation, la filtration par colonne de séparation, la sélection négative de plaquettes avec des anticorps spécifiques de RBC et de WBC conjugués à des billes magnétiques, et ainsi de suite, qui sont temps et peut dégrader les plaquettes et leur contenu.
Ford et ses collègues ont décrit la purification plaquettaire du sang humain en utilisant l’Iohexol Medium11. Cette méthode utilise un volume similaire d’échantillon sanguin et de milieu pendant la purification. Étant donné que les humains produisent un plus grand volume de sang, il est relativement facile de purifier les plaquettes.
L’Iohexol est un milieu inerte à gradient de densité universel qui est librement soluble dans l’eau et utilisé dans la fractionnation des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides et des nucléoprotéines13,14. Il a une faible osmolalité et est non-toxique, ce qui en fait un milieu idéal pour la purification des cellules vivantes intactes11. Il s’agit d’un milieu non particulaire; par conséquent, la distribution des cellules dans un gradient peut être déterminée à l’aide d’un hémocytomètre, d’un cytomètre de flux ou d’un spectrophotomètre. Il n’interfère pas avec la plupart des réactions enzymatiques ou chimiques des cellules ou des fragments cellulaires après dilution.
La souris sert de modèle animal important pour de nombreuses maladies humaines15,16,17,18. Il y a quelques articles publiés qui décrivent la purification des plaquettes de souris19,20. Cependant, la souris donne un volume de sang relativement plus faible, ce qui rend difficile la purification des plaquettes. Si le même petit volume de milieu de gradient et d’échantillons sanguins est utilisé, la couche plaquettaire ne peut pas être clairement séparée de la couche RBC-WBC après centrifugation. Dans cet article, nous avons décrit une méthode rapide et simple de purification plaquettaire de souris avec trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et à la centrifugation à faible vitesse. Nous avons également activé les plaquettes purifiées avec la thrombine et étudié leur qualité avec la cytométrie en flux et la microscopie.
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Protocol
La collecte de sang de souris doit être effectuée avec les soins institutionnels appropriés et l’approbation du Comité d’utilisation.
Remarque: Le protocole de purification plaquettaire est décrit dans un diagramme de flux de la figure 1.
1. prélèvement de sang
- Ajouter 25 μL de citrate de sodium à 3,2% (pH 7,2) en tant qu’anti-coagulant et 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) dans un tube en polypropylène.
-
Prélever environ 200 μL de sang de la souris C57BL/6 à l’aide d’un saignement rétroorbital.
Remarque: le sang peut être recueilli à partir de n’importe quel type de souche de souris indépendamment de l’âge ou du sexe.- Utiliser 2 mL d’isoflurane dans n’importe quel type de chambre pour anesthésier la souris.
Remarque: La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par des signes d’augmentation de la respiration et une diminution du mouvement. La souris ne doit pas répondre au mouvement de la chambre d’anesthésie, ou à être manipulé. Si la souris est sensible au mouvement ou à la manipulation, alors il faut plus de temps pour garder dans la chambre d’anesthésie. - 1.2.2 Ouvrez la paupière droite ou gauche de la souris et insérez un tube capillaire de 7,5 cm (0,12 cm de diamètre) dans le plexus vasculaire de l’œil.
- Tournez le tube capillaire d’un demi-tour tout en appliquant la pression sur le tube capillaire pour briser les vaisseaux et initier le flux sanguin. Tenez l’animal à l’envers au-dessus du flacon de prélèvement à remplir par capillarité.
- Une fois que le volume approprié de sang est recueilli, retirez le tube capillaire et fermez l’œil en appliquant une légère pression pendant 30 s sur la paupière avec de la gaze. Une fois que le saignement est arrêté, retournez la souris à sa cage et surveillez le saignement.
- Vérifiez les yeux pour un traumatisme 1-2 jours après un saignement rétroorbital. Retirez toute souris de l’étude montrant des signes de traumatisme significatif à l’œil à la suite de la procédure et l’euthanasier.
Remarque: La souris ne doit subir aucun type de traitement qui peut inhiber les plaquettes pendant au moins deux semaines avant la collecte du sang. L’échantillon sanguin doit être utilisé pour la purification plaquettaire dans une heure de saignement de la souris.
- Utiliser 2 mL d’isoflurane dans n’importe quel type de chambre pour anesthésier la souris.
2. purification plaquettaire
Remarque: La purification plaquettaire doit être effectuée à température ambiante pour prévenir leur dégradation. Assurez-vous que la température des réactifs et des instruments se trouve entre 18 et 22 ° c. Pour prévenir la dégradation plaquettaire, le pipetage rapide et le tremblement vigoureux doivent être évités pendant la procédure.
- Ajouter 600 μL de milieu gradient d’Iohexol (12% de poudre d’Iohexol dans 0,85% de chlorure de sodium, 5 mM de tricine, pH 7,2)11 dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter 200 μL d’échantillon sanguin lentement sur le côté du tube au-dessus du milieu dégradé avec une pointe de pipette de large alésage de sorte que le sang et le milieu Iohexol ne se mélangent pas (figure 2a).
- Centrifuger l’échantillon contenant le tube à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c dans un rotor à godet oscillant avec accélération lente et décélération.
- Recueillir la majeure partie de la couche riche en plaquettes et une petite fraction de la couche pauvre en plaquettes (total 300 à 400 μL) à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage sans perturber les couches de RBC et de WBC (figure 2b). Transférer l’échantillon plaquettaire dans un nouveau tube.
Remarque: Si la numération plaquettaire est moins importante dans le sang ou si un plus petit volume de sang est utilisé, la couche riche en plaquettes et la couche pauvre en plaquettes peuvent être considérées comme une seule couche. - Ajouter 1 mL de PBS à l’échantillon de plaquettes, mélanger en l’invertant et centrifuger à 800 x g pendant 10 min à 20 ° c dans un rotor à godet oscillant. Jetez complètement la solution et ajoutez 200 μL de PBS pour Resuspendre les plaquettes avec un pipetage doux.
Remarque: Cette étape est facultative, car elle élimine le milieu dégradé et les protéines plasmatiques et augmente la sensibilité des plaquettes aux agonistes tels que la thrombine. Puisque différentes centrifugeuses ont des programmes différents, l’accélération lente/décélération peut être déterminée en lisant le manuel de l’utilisateur de la centrifugeuse. - Transférer 30 μL de cet échantillon dans un nouveau tube pour compter les plaquettes. Les plaquettes restantes peuvent être utilisées pour des dosages biochimiques et physiologiques tels que l’activation plaquettaire, l’agrégation, la libération de granule, etc.
- Pour l’extraction d’ARN ou de protéine, Centrifugez l’échantillon de plaquettes à 800 x g pendant 10 min pour pellets les plaquettes. Jetez le surnageant complètement sans déranger le culot. Ajouter le volume désiré de tampon d’ARN ou de protéine lyse pour lyser les plaquettes.
3. comptage des plaquettes
- Comptez les cellules sanguines entières sans dilution ni plaquettes purifiées (diluées de 2 à 5 fois avec le PBS) à l’aide d’un analyseur de cellules automatisé. Utiliser 30 à 50 μL d’échantillons pour le comptage.
- Calculez le nombre total de plaquettes en multipliant par le volume de l’échantillon.
- Calculez le pourcentage de rendement/récupération des plaquettes purifiées.
- Compter le RBC et le WBC dans l’échantillon de plaquettes purifiés (dilué 50 à 100 fois avec le PBS) avec un hémocytomètre et un microscope.
4. activation plaquettaire
- Dans un tube, ajouter 1 à 2 millions plaquettes purifiées dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration (PBS avec 2% de sérum bovin fœtal, FBS).
- Pour un nombre multiple d’échantillons, faire un mélange principal d’anticorps avec 1 μL (0,5 mg/mL) de ce qui suit: PE-Cy7 rat anti-souris TER 119, PE rat anti-souris CD45, FITC rat anti-souris CD41, et APC rat anti-souris/Human CD62P (P-selectin) pour détecter RBC, WBC, plaquettes, et plaquettes activées, respectivement. Ajouter le mélange principal aux tubes pour la coloration des cellules. Ne pas ajouter de thrombine.
- Dans un autre tube, ajouter 1 à 2 millions de plaquettes purifiées dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration et 0,4 mM de peptide GPRP. Ajouter la thrombine pour activer les plaquettes et tacher les cellules après l’étape 4,2.
Remarque: Le GPRP doit être ajouté à l’échantillon avant d’ajouter la thrombine pour empêcher la formation d’agrégats ou de caillots par activation plaquettaire. La concentration de thrombine doit être optimisée pour obtenir une bonne activation des plaquettes. Après l’activation plaquettaire, le nombre d’événements est diminué lors de l’acquisition d’échantillons par cytométrie en flux. - En tant que témoin positif, ajouter 1 μL de sang total dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration dans un tube et un peptide GPRP de 0,4 mM. Ajouter la thrombine pour activer les plaquettes. En tant que contrôle négatif, ajouter 1 μL de sang total dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration. N’ajoutez pas de thrombine dans l’échantillon de contrôle négatif. Tacher les cellules après l’étape 4,2.
- Pour le contrôle de l’isotype de cytométrie en flux, l’étiquette 5 tubes avec non teinté, PE-Cy7, PE, FITC, et APC. Ajouter 100 μL de tampon de coloration, 1 μL de sang et 1 μL de l’anticorps respectif aux tubes étiquetés pour colorer les cellules.
- Incuber les échantillons à la tache pendant 30 min à la température ambiante dans l’obscurité.
- Lavez les échantillons en ajoutant 1 mL de tampon de coloration à chaque tube. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez soigneusement le tampon de coloration sans déloger le pellet.
- Ajouter 300 μL de tampon de coloration à chaque tube, mélanger légèrement et transférer dans un tube FACS. Stockez les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient analysés avec un cytomètre de flux.
5. analyse de la cytométrie en flux des plaquettes
-
Créez une nouvelle expérience et générez des diagrammes de dispersion vers l’avant du journal par rapport aux nuages de points et affectez des portails pour Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (plaquettes) et CD62P APC (plaquettes activées) selon la stratégie de blocage choisie pour le expérience dans le logiciel FACS DIVA.
- Ouvrez la hiérarchie de population en choisissant afficher la hiérarchie de population sous l’onglet populations . modifiez la hiérarchie de population en vérifiant la stratégie de blocage et en renommant correctement les portails.
- Ouvrez la vue statistiques en choisissant créer une vue statistiques. Modifiez la vue des statistiques en fonction des préférences de l’utilisateur en cliquant avec le bouton droit sur la vue statistiques et en sélectionnant modifier la vue statistiques.
- Choisissez une couleur pour chaque porte qui améliore l’aspect visuel de la mise en page en double-cliquant sur la case correspondant à la population.
- Dans la fenêtre du cytomètre , cliquez sur l’onglet paramètres et ajustez les tensions pour les paramètres pour visualiser la population d’intérêt sur les parcelles.
- Ajustez les tensions pour chacun des paramètres de sorte que la population négative puisse être distinguée de la population positive. Avant d’enregistrer les échantillons pour le contrôle de compensation, vérifiez que les contrôles positifs à une seule teinte sont à l’échelle (Assurez-vous que les pics positifs sont visibles et pas trop loin vers la droite).
Remarque: Si les pics positifs sont hors échelle, les tensions doivent être ajustées pour voir les populations positives. - Enregistrez les cellules colorées en une seule couleur pour les contrôles de compensation (non colorées, PE-Cy7, PE, FITC et APC).
- Si les grilles de commande positives ne sont pas correctement paramétrés, réglez-les en changeant de tension.
- Accédez à expérience ≫ paramétrage de la rémunération ≫ calculer la rémunération. Choisissez appliquer uniquement dans la fenêtre résultante.
- Basculez vers la feuille de calcul globale en cliquant sur le bouton bascule dans le haut, à gauche de la fenêtre de la feuille de calcul.
- Chargez l’échantillon de contrôle positif et acquérez suffisamment de cellules pour ajuster la compensation et les barrières.
- Chargez l’échantillon à nouveau et vérifiez que chaque parcelle montre la population de cellules attendue en fonction de l’anticorps teinté fluorochrome. Acquérir et enregistrer 100 000 événements pour des échantillons de sang total et 10 000 événements pour les plaquettes purifiées. Chargez les échantillons un par un jusqu’à ce que l’acquisition soit terminée.
- Analysez les données de cytométrie de flux avec le logiciel avec des tracés et des portails appropriés (figure 3)
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Representative Results
Le résumé de la purification plaquettaire est décrit dans un diagramme de flux (figure 1). Les étapes comprennent la collecte de sang de la souris en utilisant des saignements rétroorbitaux en présence d’un anticoagulant, addition d’échantillon sanguin sur le milieu gradient Iohexol, centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La qualité des plaquettes purifiées a été évaluée avec la microscopie et la cytométrie en flux après coloration avec anticorps pour détecter les cellules contaminantes et les plaquettes activées.
Le milieu de gradient d’Iohexol et l’échantillon sanguin ont formé deux couches distinctes dans le tube si le sang a été lentement ajouté sur le milieu (figure 2a). Cependant, s’il y a un retard dans cette étape, la plupart de l’échantillon sanguin pourrait se répandre dans le milieu et il pourrait être difficile de purifier les plaquettes. Les pointes de pipette à grand alésage n’ont pas permis de stresser physiquement les plaquettes, ce qui est important pour maintenir l’intégrité des plaquettes et prévenir leur dégradation. Pendant la centrifugation, l’accélération lente a permis de prévenir le mélange accidentel de l’échantillon sanguin avec le milieu Iohexol et la décélération lente a permis de maintenir le gradient après centrifugation. La couche supérieure (couleur paille) contenait le plasma et ne contenait aucun type de globules intacts, la deuxième couche (blanchâtre) du haut contenait la majorité des plaquettes qui ont été recueillies à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage, la troisième couche (transparente) a été pauvre en plaquettes qui a été partiellement recueilli avec précaution pour éviter l’aspiration de la couche inférieure (rouge) RBC et WBC (figure 2b). La couche riche en plaquettes et la couche pauvre plaquettaire n’ont pas pu être vues séparées si le nombre de plaquettes était faible dans l’échantillon sanguin. La couche de RBC et de WBC ne pouvait pas être considérée comme des couches distinctes puisque le volume sanguin était faible. Cependant, WBC forme une couche blanche, appelée couche de Buffy entre la couche pauvre plaquettaire et le calque RBC si un plus grand volume de sang est utilisé pour la purification10, 11. Il est important d’effectuer l’ensemble de la procédure à 18 à 22 ° c. La température et la réfrigération les plus élevées des échantillons ont donné des numérations plaquettaires inférieures en raison de la dégradation.
Nous avons trouvé 18,2 à 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) récupération/rendement des plaquettes purifiées. Pour étudier leur viabilité, des échantillons de plaquettes purifiées ont été activés avec la thrombine. L’analyse cytométrique des échantillons de plaquettes a été effectuée après coloration avec les marqueurs des plaquettes, des plaquettes activées, de la RBC et de la WBC. Le sang entier montrait des populations distinctes de RBC, de WBC et de plaquettes sur une parcelle logarithmique à dispersion vers l’avant et sur un point de dispersion latérale (figure 3A), alors que les plaquettes purifiées montraient une population distincte avec un nombre négligeable de RBC et de WBC (figure 3b ). Le sang entier a montré la RBC et la WBC après les avoir tachant avec des anticorps anti-souris Ter119 et anti-souris CD45 (figure 3C) alors que les plaquettes purifiées montraient un nombre négligeable de RBC et de WBC (figure 3D). Nous avons évalué l’échantillon de plaquettes purifiée avec un microscope et nous n’avons pas vu un nombre significatif de RBC et de WBC intacts. Par conséquent, les événements RBC et WBC qui ont été montrés dans la figure 3D pourraient être les fragments de RBC et de WBC contenant respectivement TER119 et CD45. Les plaquettes purifiées qui n’ont pas été traitées avec la thrombine n’ont montré presque aucune activation indiquant leur état de repos (figure 3e), alors que les plaquettes purifiées traitées avec la thrombine ont montré une activation de 71% (jusqu’à 93% d’activation a été observée dans certains échantillons) ( Figure 3F) indiquant leur viabilité. Nous avons également effectué une évaluation microscopique d’échantillons de plaquettes purifiés non traités par thrombine qui n’ont montré aucune agrégation plaquettaire (figure 4a), cependant, les plaquettes purifiées ont formé des agrégats après avoir été traitées avec la thrombine (figure 4b), qui indiquent leur viabilité. Sur la base d’études cytométriques et microscopiques de flux, nous avons confirmé que nos plaquettes purifiées étaient de bonne qualité.
Figure 1: schéma schématique pour la purification plaquettaire de la souris. L’échantillon sanguin de la souris est recueilli en présence d’un anticoagulant. L’échantillon sanguin est ajouté lentement sur le milieu de gradient d’Iohexol et centrifugé à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La couche plaquettaire est transférée dans un nouveau tube. La qualité des plaquettes purifiées est vérifiée avec la microscopie et la cytométrie en flux. Les plaquettes peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à-80 ° c. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2:. Sang de souris avant et après centrifugation avec le milieu de gradient d’Iohexol. (A) l’Iohexol et le sang forment deux couches distinctes avant la centrifugation si l’échantillon sanguin est ajouté avec précaution. Le panneau de gauche affiche le diagramme schématique et le panneau droit affiche l’image réelle. (B) quatre couches distinctes sont observées après centrifugation du sang total avec un milieu dégradé. Le panneau de gauche affiche le diagramme schématique des calques et le panneau droit affiche l’image réelle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: analyse cytométrique de flux de plaquettes purifiées. (A) lesang total montre les populations de RBC, de WBC et de plaquettes. Bles plaquettes purifiées montrent un nombre mineur d’événements de RBC et de WBC. (C) sang total montre RBC et WBC après coloration avec anti-souris Ter119 et anti-souris CD45. (D) les plaquettes purifiées présentent un nombre négligeable d’événements de RBC et de WBC après coloration avec des Ter119 anti-souris et des CD45 anti-souris. (E) les plaquettes purifiées colorées avec l’anti-souris CD41 et l’anti-souris/Human P-selectin montrent presque aucune activation plaquettaire. (F) les plaquettes purifiées traitées avec la thrombine et colorées avec l’anti-souris CD41 et l’anti-Mouse/Human P-selectin montrent l’activation des plaquettes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: évaluation microscopique des plaquettes purifiées. (A) les plaquettes purifiées ne présentent pas d’agrégation. B) plaquettes purifiées traitées avec une agrégation de la thrombine. Les deux chiffres sont 200X grossissement, lentille oculaire 10x et objectif 20x. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Communément, les plaquettes sont isolées par centrifugation à basse vitesse qui donne un plasma riche en plaquettes qui contient un nombre significatif de cellules sanguines, de débris cellulaires et de protéines plasmatiques qui peuvent interférer avec les essais biochimiques et physiologiques et les besoins purification ultérieure21. Par conséquent, il est important d’utiliser une méthode rapide et simple qui peut produire des plaquettes pures sans contaminants majeurs. Le protocole présenté ici décrit la purification des plaquettes du sang de la souris à l’aide d’un milieu dégradé avec centrifugation à faible vitesse. Les paramètres utilisés dans ce protocole maximisent le rendement et minimisent la dégradation des plaquettes. Le milieu dégradé et les protéines plasmatiques peuvent être éliminés en incluant une étape de lavage après la collecte des plaquettes, ce qui peut augmenter la sensibilité des plaquettes à l’agoniste ou à l’anticorps. Plus important encore, les plaquettes purifiées sont en état de repos, mais elles peuvent être activées en présence d’un agoniste, comme la thrombine. Nous avons constaté que l’activité de la thrombine varie d’une source à l’autre. Par conséquent, la concentration de thrombine doit être optimisée empiriquement pour obtenir une bonne activation des plaquettes.
En raison d’un petit volume de sang de souris, il est peu commode de purifier les plaquettes parce que les plaquettes peuvent être mélangées avec RBC et WBC pendant l’aspiration. Nous avons résolu ce problème en optimisant le ratio échantillon sanguin et milieu dégradé. Nous avons constaté que trois fois plus de gradient de milieu par rapport au volume sanguin peut clairement séparer la couche plaquettaire des couches de sérum et de RBC-WBC qui facilite la collecte facile des plaquettes pures.
La purification plaquettaire doit être effectuée à température ambiante entre 18 et 22 ° c pour prévenir leur dégradation. Il a été rapporté que les plaquettes se dégradent si elles sont entreposées au réfrigérateur ou à des températures supérieures à 27 ° c11. Un pipetage rapide et un tremblement vigoureux doivent être évités pour prévenir la dégradation plaquettaire pendant la purification. Puisque différentes centrifugeuses ont des programmes différents, l’accélération/décélération doit être déterminée empiriquement pour maintenir le gradient.
Si plusieurs échantillons de sang de souris sont utilisés dans la purification, le saignement doit être fait en moins de 1 h et la purification doit être terminée dans les 1 h suivant. Si des échantillons sanguins sont laissés pendant plus de 2 h, les plaquettes ne peuvent pas être purifiées en raison de leur dégradation. Si plus de plaquettes sont nécessaires pour une étude, le sang de souris peut être recueilli par des procédures terminales telles que la perforation cardiaque ou une hémorragie de veine cave inférieure, qui donnent 800 à 1 000 μL de sang, et la purification plaquettaire doit être effectuée dans plusieurs tubes et combinés après purification.
En conclusion, nous avons décrit un protocole simple et rapide pour la purification plaquettaire à partir d’un petit volume de sang de souris. Cette méthode peut également être utilisée pour la purification plaquettaire d’autres espèces aussi bien. Les plaquettes purifiées peuvent être utilisées pour l’expression génique, l’activation et la libération de granule, l’agrégation et les essais d’adhérence sur stimulation avec divers agonistes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par un financement de démarrage de la Fondation de recherche pour enfants de Cincinnati et une bourse translationnelle pilote de l’Université de Cincinnati à M.N. Nous aimerions remercier le centre de cytométrie en flux de recherche de l’hôpital pour enfants de Cincinnati pour leurs services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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