Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Opnåelse kræft stamceller kugler fra gynækologiske og brystkræft tumorer

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Formålet med denne metode er at identificere kræft stamceller (CSC) i kræft cellelinjer og primære menneskelige tumor prøver med kugledannende protokol, på en robust måde, ved hjælp af funktionelle analyser og fænotypisk karakterisering med flow cytometri og vestlige Skamplet.

Abstract

Kræft stamceller (CSC) er en lille befolkning med selvfornyelse og plasticitet, som er ansvarlige for tumorigenese, modstandsdygtighed over for behandling og tilbagevendende sygdom. Denne population kan identificeres ved overflademarkører, enzymatisk aktivitet og en funktionel profil. Disse tilgange i sig selv er begrænsede på grund af fænotypisk heterogenitet og CSC-plasticitet. Her opdaterer vi den sfæredannende protokol for at opnå CSC-sfærer fra brystkræft og gynækologiske kræftformer, vurdering af funktionelle egenskaber, CSC-markører og proteinudtryk. Kuglerne opnås med encellede såning ved lav tæthed i suspensionskulturen ved hjælp af et halvfast methylcellulosemedium for at undgå migration og aggregater. Denne rentable protokol kan bruges i kræft cellelinjer, men også i primære tumorer. Den tredimensionale ikke-tilhængere suspension kultur menes at efterligne tumor mikromiljø, især CSC-niche, suppleres med epidermal vækstfaktor og grundlæggende fibroblast vækstfaktor for at sikre CSC signalering. Med henblik på en robust identifikation af CSC foreslår vi en supplerende tilgang, der kombinerer funktionel og fænotypisk evaluering. Sphere-dannende kapacitet, selvfornyelse og sfære projektion område etablere CSC funktionelle egenskaber. Derudover omfatter karakterisering flow cytometri evaluering af markører, repræsenteret ved CD44+/ CD24- og CD133, og Vestlige blot, overvejer ALDH. Den præsenterede protokol blev også optimeret til primære tumorprøver, efter en prøve fordøjelsesprocedure, nyttig til translationel forskning.

Introduction

Kræftpopulationer er heterogene, med celler præsenterer forskellige morfoologier, spredning og invasion kapacitet, på grund af differentiale genekspression. Blandt disse celler, en minoritetspopulation findes navngivne kræftceller (CSC)1, som har kapacitet til selvfornyelse, opsummerer heterogenitet en primær tumor niche og producerer afvigende differentiere stammænd, der ikke reagerer tilstrækkeligt på homøostatisk kontrol2. CSC egenskaber kan oversættes direkte i klinisk praksis, da foreningen med begivenheder, såsom tumorigenicity eller modstandsdygtighed over for kemoterapi3. Identifikationen af CSC kan føre til udvikling af målrettede behandlinger, der kan omfatte blokering af overflademarkører, fremme af CSC differentiering, blokering af CSC signalering pathway komponenter, niche ødelæggelse, og epigenetiske mekanismer4.

Isoleringen af CSC er udført i cellelinjer og i prøver af primære tumorer5,6,7,8. Den funktionelle profil, der er beskrevet for CSC omfatter klonenisk kapacitet, sidepopulation og tumorosfæredannelse9. CD44høj/ CD24lav fænotype har været konsekvent forbundet med bryst CSC, som har vist sig at være tumorigenic in vivo og har allerede været forbundet med epitel til mesenkymale overgang5,10. Høj ALDH aktivitet har også været forbundet med stængel og epitel til mesenkymale overgang (EMT) i flere typer af faste tumorer11. ALDH-udtryk har været forbundet med resistens over for kemoterapi og CSC-fænotype in vitro12,13,14,15,16. Flere andre markører har været knyttet til CSC egenskaber i forskellige typer af tumorer, såsom CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 og andre, som beskrevet i tabel 1.

Tumorkuglerne består af en tredimensionel model for studiet og udvidelsen af CSC. I denne model dyrkes cellesuspensionerne fra cellelinjer og fra blod- eller tumorprøver i et medium suppleret med vækstfaktorer, nemlig epidermal vækstfaktor (EGF) og grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF), uden fosterserum og under ikke-klæbende tilstande17. Hæmning af cellevedhæftning resulterer i død ved anoikis af differentierede celler18. Kugler er afledt af klonale vækst af en isoleret celle. Til dette formål fordeles cellerne ved lav tæthed for at undgå cellefusion og sammenlægning19. En anden strategi omfatter brugen af halvsolid methylcellulose20.

Den sfæredannende protokol vundet popularitet i CSC isolation og ekspansion, på grund af tid og omkostninger og tekniske, rentable og reproducerbare årsager21,22. På trods af nogle reserver på, i hvilket omfang kugledannelse afspejler CSC, er der en tilbøjelighed af stamceller til at vokse i ikke-klæbende forhold med den karakteristiske fænotype, som ligner den indfødte mikromiljø21. Ingen af de metoder til rådighed for isolering af CSC fra solide tumorer har fuldstændig effektivitet, fremhæver betydningen af at udvikle mere specifikke markører eller kombinationer af metoder og markører.

I denne protokol beskriver vi isolationen af CSC med protokollen om sfæredannelse med princippet om vækst i en celle under ikke-klæbende forhold og evnen til at producere en differentieret fænotype. En skematisk repræsentation af denne procedure er repræsenteret i figur 1. Vi beskriver også karakterisering med overflademarkører og ALDH udtryk for CSC, både for bryst og gynækologiske tumorceller linjer og prøver af primære tumorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol blev udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer fra Coimbra Hospital og Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, og blev godkendt af CHUC's Etiske Komité for Sundhed og af den portugisiske nationale databeskyttelseskommission.

1. Protokol om sfæredannelse og afledte klæbende populationer fra kontinuerlige cellekulturer

BEMÆRK: Udfør alle procedurer under strenge sterile forhold.

  1. Fremstilling af ikke-klæbende suspensionskulturkolber eller plader ved at belægning vækstfladen med poly(2-hydroxyethyl-methacrylate (poly-HEMA)
    1. Der fremstilles en 15 mg/ml opløsning ved omrøring af poly-HEMA i absolut ethanol ved 65 °C. Knaldcellekulturkolber eller plader med 50 μL/cm2.
    2. Lad det tørre ved 37 °C i en tørreovn. Om nødvendigt skal pladerne pakkes ind og opbevares ved stuetemperatur.
  2. Forberedelse af sfæren snærende medier (SCM)
    1. Forbered en 2% opløsning af methylcellulose i ultrarent vand og steriliseres i autoklaven. Methylcellulose tendens til at være lettere at opløse ved køling; pulveret i vand ved 80 °C og rør derfor indtil afkølet23.
    2. Forbered en to gange koncentreret opløsning af SCM (lageropløsning). SCM arbejdsløsning indeholder DMEM-F12, suppleret med 100 mM putrescine, 1% insulin, transferrin, selen og 1% antimycotic opløsning (10.000 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin og 25 μg/mL amphotericin B).
    3. For at forberede SCM blandes lige store mængder af SCM-lageropløsningen med 2 % opløsning af methylcellulose.
    4. Mediet udfyldes umiddelbart før brug ved at tilføje 10 ng/ml epidermal vækstfaktor (EFG) og 10 ng/ml grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF).
    5. Hvis der er mere kræsne cellelinjer i brug, skal mediet suppleres med 0,4 % kreaserumalbumin, hvilket kan være en fordel.
  3. Start med en kolbe af MCF7 eller HCC1806 brystkræft eller ECC-1 eller RL95-2 endometriecancerceller (eller andre kræftcellelinje af valg) med 80% til 90% sammenløb.
  4. Kassér cellekulturmediet, vaskes med fosfatbufferede saltvandsopløsning (PBS) og afmonterecellerne med trypsin-EDTA (1 til 2 ml for en 75 cm2 cellekulturkolbe).
  5. Tilføj cellekulturmedier (2 til 4 ml for en 75 cm2 cellekulturkolbe) og centrifuger ved 200 x g i 5 minutter for at kassere enzymer.
  6. Suspendere pellet i en kendt mængde af cellekultur medier og pipette op og ned for at sikre en enkelt celle suspension. Til dette formål kan der anvendes en 40 μm cellesi.
  7. Tæl cellerne i hæmocytometeret og beregne cellekoncentrationen af cellesuspensionen. Udnyt dette trin for at sikre observation af en enkelt celle suspension. Omhyggelig celletælling er afgørende for præcist at kvantificere virkningerne af behandlinger.
  8. Suspension den bestemte mængde celleaffjedring i SCM komplet medium og overførsel til poly-HEMA belagte retter. Som referenceværdi for såningstæthed skal du overveje 500 til 2000 celler/cm2.
    BEMÆRK: Optimering af såning tæthed og tid af kultur for hver cellelinje er stærkt anbefales24.
  9. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 i 2 dage uden at forstyrre pladerne.
  10. Genetablere koncentrationen af vækstfaktorer ved at tilføje 10 ng/ml EFG og 10 ng/ml bFGF til cellekulturmedierne. Gentag dette trin hver anden dag.
  11. Inkuberved 37 °C og 5% CO2 indtil 5 dage efter plating (dette kan variere fra 3 til 12 dage i henhold til cellelinjen) for at opnå kugler, som præsenterer morfologien af suspension kugleformede cellekolonier.
  12. Brug eller indsamle kugler, ved pipetting, for eksperimenterne.
  13. For at opnå afledte klæbende populationer skal kuglerne placeres i standardkulturforhold, henholdsvis for den anvendte cellelinje. 1 til 2 dage senere, er det muligt at observere en monolayer af celler vokser omkring tilhængere kugler, som præsenterer en morfologi svarende til cellelinjen af oprindelse.

2. Kugledannende protokol fra humane tumorprøver

BEMÆRK: Anvendelsen af humane prøver til forskningsformål skal være i overensstemmelse med hvert lands lovgivning og godkendes af de involverede institutioners etiske komité.

  1. Transportmediet DMEM/F12 tilberedes suppleret med 10 % føtal kvægserum (FBS) og 2 % antimycotisk opløsning (10.000 U/mL penicillin, 10 mg/ml streptomycin og 25 μg/mLamphotericin B).
  2. Fordøjelsesmediet, der indeholder DMEM/F12, suppleret med 10% FBS, 1% antimycotic opløsning af antibiotika, 1 mg/ml iv kollagenog 100 μg/mL DNAse I.
  3. Enzyminaktiveringsmediet, der indeholder DMEM/F12, suppleret med 10% FBS og 1% antimycotic opløsning (10.000 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin og 25 μg/ml amphotericin B).
  4. Klargør SCM'en som beskrevet i afsnit 1.2.
  5. Prøven anskaffes under den makroskopiske undersøgelse af det operative stykke så hurtigt som muligt efter kirurgisk fjernelse.
  6. Prøverne anbringes i transportmedier, og overfør dem til laboratoriet til det sted, hvor forarbejdningen skal behandles. Prøvebehandling bør påbegyndes inden for 1 time efter indsamling for at forbedre succesraten for proceduren. Vær forsigtig i prøvesamlingen. Håndter prøverne omhyggeligt. Undgå brug af nekrotiske eller ætsede zoner.
  7. Under det sterile flowkammer overføres prøven til en skål og skæres i mindre stykker (ca. 1 mm3)med en skalpel.
  8. Inkuber det humane væv i et rør med fordøjelsesmedier i en roterende shaker op til 180 min ved 37 °C. Identificer dette rør som rør A.
  9. Enzymopløsningen udskiftes hver 15.
    1. Opsaml fordøjelsesmediet (uden at fjerne vævsfragmenter) og overfør det gennem en 40 μm cellesi til et nyt rør, der er halvt fyldt med enzyminaktiveringsmedier. Hold dette rør ved stuetemperatur og identificere det som rør B.
    2. Tilføj nye fordøjelsesmedier til rør A, og sæt det tilbage til den roterende shaker ved 37 °C.
    3. Ved hver samling skal du kontrollere cellelevedygtigheden ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode.
    4. Gentag denne procedure i 180 min eller indtil celletallet er betydeligt lavere.
  10. Inkuber vævsfragmenterne i rør A i en anden fordøjelsesopløsning, der indeholder lige dele accutase og trypsin-EDTA under omrøring i 10 min ved 37 °C.
  11. Tilføj enzyminaktiveringsmediet til rør A, og filtrer indholdet gennem en 40 μm cellesii i rør B.
  12. Celleaffjedringen centrifugeres i rør B ved 200 x g i 10 min.
  13. Hæng pellet i SCM og kontrollere cellekoncentration en hæmocytometer.
  14. Suspension af den bestemte mængde celleaffjedring i SCM og overføres til poly-HEMA belagte retter (se trin 1.1) med en såningstæthed på 4000 celler/cm2.
  15. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 i 2 dage uden at forstyrre pladerne.
  16. Genetablere koncentrationen af vækstfaktorer ved at tilføje 10 ng/ml EFG og 10 ng/ml bFGF til cellekulturmedierne.
    BEMÆRK: Du skal gøre dette hver anden dag.
  17. Inkuberved 37 °C og 5% CO2 indtil 5 dage efter plating (dette kan variere op til 12 dage) for at opnå kugler, som præsenterer morfologien af affjedringskugleformede cellekolonier.

Figure 1
Figur 1: Opnåelse af kræft stamceller fra menneskelige endometrie tumor prøver (A) og bryst og gynækologiske kræft cellelinjer (B). Menneskelige tumorprøver er fragmenterede, enzymatisk fordøjet og belagt i kugledyrkning medium i poly-HEMA belagte retter. Kræft cellelinjer er løsrevet, celle suspensioner tælles, og enkelte celler er fordelt ved lav tæthed i poly-HEMA belagtplader under passende forhold. De opnåede kugler producerer, når de placeres under tilhængere skulturbetingelser, afledte tilhængere. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Sphere-dannende kapacitet, selvfornyelse og sphere projektionsområde

BEMÆRK: Sphere-dannende kapacitet er evnen af en tumor celle befolkning til at producere kugler. Selvfornyelse er sfærecellernes evne til at producere nye kolonier af sfæriske celler i suspension. Området for projektion af sfæren er repræsentativt for det område, der er besat af sfæren, og udtrykker derfor deres størrelse og antallet af celleopdelinger, der er undergået i en bestemt periode.

  1. Bestemmelse af den sfæredannende kapacitet
    1. Efter afslutningen af kugledannende protokol opsamles kuglerne i et centrifugerør og centrifugerer ved 125 x g i 5 min.
    2. Kassér SCM'en, og den skal forsigtigt suspenderes i et kendt volumen af friske medier. Med det formål at koncentrere sfærerne for at lette optællingen skal kuglerne suspenderes i et lille medievolumen. Pas på ikke at forstyrre kuglerne.
    3. Brug et hæmocytometer til at tælle kuglerne med en diameter på mere end 40 μm. Alternativt kan kugler tælles direkte på pladen ved hjælp af et mikroskop udstyret med en graticule25 eller ved hjælp af et automatiseret system26,27.
    4. Beregn procentforholdet mellem de opnåede kugler i forhold til det oprindeligt forgyldte antal celler.
  2. Bestemmelse af selvfornyelse
    1. Efter afslutningen af kugledannende protokol opsamles kuglerne i et centrifugerør og centrifugerer ved 125 x g i 5 min.
    2. Kassér kuglen, der er til dyrkning, og suspenderes forsigtigt pelleten i trypsin-EDTA.
    3. Inkuber op til 5 min ved 37 °C.
    4. Tilføj enzyminaktiveringsmedier og pipette op og ned for at sikre en enkelt celleaffjedring.
    5. Ved hjælp af et hæmocytometer og trypan blå udelukkelse metode, tælle de levedygtige celler i suspensionen.
    6. Start den kugledannende protokol som beskrevet i afsnit 1.
    7. Efter 8 dage skal du bruge et hæmocytometer til at tælle kuglerne med en diameter på mere end 40 μm.
    8. Beregn procentforholdet mellem de opnåede kugler i forhold til det oprindeligt forgyldte antal celler.
  3. Bestemmelse af området storerfremt område
    1. For at evaluere det område, der er besat af kuglerne, skal du hente billeder af mindst 10 tilfældige felter pr. tilstand i et omvendt mikroskop udstyret med et billedanskaffelsesmodul. Det anbefales at forstørre 100 X til 400 X.
    2. Analyser billeder ved hjælp af billedbehandling software, såsom ImageJ software28, ved at tegne områder af interesse, der svarer til kuglerne og måle dens område i pixels.
    3. Beregn området for projektion af kugler som det gennemsnitlige målte pixelområde.

4. Cancer Stamcellemarkør vurdering med Flow Cytometri

BEMÆRK: CD44+/CD24-/lav fænotype var konsekvent forbundet med bryst- og gynækologiske stamceller fra kræft. Den beskrevne procedure kan anvendes til at evaluere denne og andre celleoverflademarkører.

  1. Efter afslutningen af kugledannende protokol opsamles kuglerne i et centrifugerør og centrifugerer ved 125 x g i 5 min.
  2. Kassér SCM'en, og hæng forsigtigt pelleten i trypsin-EDTA.
  3. Inkuber op til 5 min ved 37 °C.
  4. Tilføj enzyminaktiveringsmedier og pipette op og ned for at sikre en enkelt celleaffjedring.
  5. Centrifugeres ved 125 x g i 5 min. kasseres supernatanten, og cellerne skal forsigtigt suspenderes i PBS.
  6. Lad cellerne hvile i suspension i 30 minutter for at sikre genvinding af membranen kropsbygning.
  7. Ved hjælp af et hæmocytometer og trypan blå udelukkelse metode, tælle cellerne i suspensionen.
  8. Celleaffjedringsvolumen justeres til 106 celler/500 μL.
  9. Inkuberes med monoklonale antistoffer i henhold til leverandørernes anvisninger (koncentration, tid, temperatur og lys/mørk) og i betragtning af det eksperimentsæt, der er repræsenteret i tabel 2, eller markørerne i tabel 1.
  10. Umiddelbart efter farvning, udføre flow cytometrisk analyse ved hjælp af et flow cytometer med passende detektionsmoduler.
  11. Standardisere opsætningen af cytometer efter protokoller, der er fastlagt af EuroFlow Consortium29.
  12. Opret primære porte baseret på fremad- og sidespredningeksklusive snavs og døde celler. Dette kan forbedres ved samtidig mærkning med anneks i V og gating negative celler.
  13. Indstil fluorescensporte baseret på de ufarvede prøver og kompensation for en spektral overlapning ved hjælp af enkeltfarvede kontroller.

5. Kræft Stamcelle markør vurdering med Vestlige Blot

BEMÆRK: Ud over ALDH1 aktivitet, højt udtryk for denne markør var konsekvent forbundet med bryst og gynækologiske kræft stamceller13,14. Den beskrevne procedure kan bruges til at evaluere denne og andre cellemærker.

  1. Efter afslutningen af kugledannende protokol opsamles kuglerne i et centrifugerør og centrifugerer ved 125 x g i 5 min.
  2. Forberedelse af hele cellen lysates
    1. Anbring centrifugerørene på isen, og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    2. Pellet med 1 ml kold PBS og kassér ved centrifugering.
    3. Pellet i et lille volumen (200-500 μL) AF RIPA lysis buffer30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7.4, Triton-X100 1% vol./vol., natriumdeoxycholsyre 0,5% wt./vol., natriumdodecylsulfat 0,5% wt./vol.) suppleret med cOmplete Mini og dithiothreitol 1 mM.
    4. Vedligeholdelse af prøverne koldt (på is), indsende dem til vortex og sonikering med en 30% amplitude.
    5. Prøverne centrifugeres i 15 min ved 14.000 x g i et kølecentrifugesæt til 4 °C.
    6. Overfør supernatanterne til nye, korrekt identificerede mikrorør.
    7. Bestemme proteinkoncentrationer ved hjælp af BCA eller Bradford analyser31.
    8. Prøverne opbevares om nødvendigt ved -80 °C indtil yderligere western blot-analyse.
  3. Udfør prøvedenaturering, elektroforese, elektronoverførsel og proteindetektering i henhold til standardwestern blotting protokoller, som beskrevet32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den kugledannende protokol gør det muligt at få sfæriske kolonier ved suspension fra flere endometrie- og brystkræftcellelinjer (figur 2A) eller efter blid enzymatisk fordøjelse af væv fra humane tumorprøver (figur 2E). I begge tilfælde opnås der et par dage efter plating monoklonale sfæriske kolonier i suspension. Både endometrie- og brystkræftkugler giver anledning til et cellemonolag med lignende morfologi til cellelinien af oprindelse, 1 til 2 dage efter plating (figur 2A).

Forskellige afstamning og væv oprindelse kan sammenlignes med kugle-dannende kapacitet, selvfornyelse og projektion område. Repræsentative resultater fra cellelinjer mod brystkræft kan observeres i graferne i figur 2B-D. Den hormonelle receptor-positive brystkræft MCF7 celler viser højere sfære-dannende kapacitet, selvfornyelse og projektion område end den tredobbelte negative brystkræft celler HCC180614. For begge cellelinjer er en lille procentdel af de celler, der er belagt (mindre end 3 %) var i stand til at producere kugler understreger kræft stamceller som et mindretal befolkning inden tumorcelle heterogenitet. Kræft stamceller selvfornyelse blev patenteret af en væsentligt anderledes værdi af sfære selvfornyelse af cellelinjer repræsenteret. Sphere projektion område, som et groft mål for kuglernes dimension, korrelerer med antallet af mitotiske cyklusser og viser forskellige tidsintervaller for begge slægter.

Mens kun en lille del af cellerne er i stand til at danne tumorkugler in vitro og bevare selv-fornyelse kapacitet transporterer stamceller egenskaber, flere markører var forbundet med denne fænotype.

Den præsenterede flowcytometriprotokol giver mulighed for alsidige eksperimentelle tilgange under hensyntagen til overfladeantigener (se tabel 1). Repræsentative resultater, vist i figur 3A-B, vedrører CD44/CD24 og CD133 membranmarkører, der er blevet foreslået som svarende til en mere kræftstamcellelignende fænotype. Analyse af kugler fremstillet af endometrie RL95-2 og ECC-1 cellelinjer tillod fire populationer, der skal identificeres (figur 3A). Kugler fremstillet af endometrie RL95-2 omfattede en CD44høj/ CD24- befolkning tre gange større end forældrenes cellelinje35. For ECC-1-kuglersvarer CD44high/CD24- til den største population, som også er CD133 positiv, mens CD44low/CD24-CD44low/CD24+ og CD44-/CD24+ har negative eller lave CD133-udtryk.

Vurdering af overflade og intracellulære markører kan også udføres ved vestlige blot efter blid kuglehøst og omhyggelig proteinprøve forberedelse. Figur 3C viser typiske resultater af ALDH-ændring, en markør, hvis øgede aktivitet eller augmented protein ekspression er forbundet med kræftstamcellernes fænotype13,14 på kugler og afledte klæbende celler vedrørende den endometrielige ECC1-cellelinje af oprindelse.

Figure 2
Figur 2: Endometrie- og brystkræftceller, kugler og afledte tilhængere. (A) . Repræsentative billeder af endometrie (RL95-2 og ECC-1) og bryst (MCF7 og HCC1806) kræftcellelinjer, respektive endometrie (ES1) og bryst (MS1) kugler og afledte klæbende populationer (G1). Repræsentative billeder af RL95-2, ECC-1, MCF7 og HCC1806 kræftcellelinjer blev opnået ved en forstørrelse på 200x (Scale bar = 50 μm). Der blev indhentet repræsentative billeder af ES1 RL95-2 og ES1 ECC-1 ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). Repræsentative billeder af MS1 MCF7 og MS1 HCC1806 blev indhentet ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 100 μm). Repræsentative billeder af G1 RL95-2 og G1 ECC-1 blev opnået ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). Repræsentative billeder af G1 MCF7 og G1 HCC1806 blev opnået ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 100 μm). (B-D) . Sphere-dannende kapacitet, selvfornyelse og sfære projektion område af brystkræft kugler MCF7 og HCC1806. (E) . Repræsentative billeder af kugler fra humane endometrietumorprøver. Disse billeder blev taget ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). En del af dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation med tilladelse fra udgiveren14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kombineret evaluering af kræftstamceller markører i endometriecancerceller. (A) . Repræsentative parceller af CD44/CD24-mærkning af RL95-2-cellelinjen og RL95-2-sfærecellerne. B) . Repræsentative histogrammer for CD133-mærkning af kugleceller (ES1) fra RL95-2- og ECC-1-cellelinjer. Tætheden repræsenterer et mål for celletallet. CD44+/CD24-, CD44low/CD24-, CD44low/CD24± og CD44-/CD24+ populationer er malet i henholdsvis grøn, pink, blå og gul. C. ALDH-udtryk i ECC-1-cellelinje, kugler (ES1) og afledt klæbende population (G1). Immunblot repræsenterer ALDH og actin udtrykket for de respektive eksperimentelle betingelser. ALDH-udtrykket blev evalueret med antistoffet ALDH1/2, som registrerer isoformeraldh1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 og ALDH2 af mus, rotte og menneskelig oprindelse. En del af dette tal er blevet ændret fra tidligere publikationer med tilladelse fra udgiverne13. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over gynækologiske og brystkræft stamceller markører.

Markør Stamcelleoprindelse Referencer
CD24 Kræft i æggestokkene 60
CD29 Brystkræft 61
CD44 Kræft i æggestokkene 62,63
CD44/CD24-/lav Brystkræft 13,5,3,64
CD44+/CD24-/lav/ESA Brystkræft 65
CD44/ALDH1+/hi Brystkræft 66
CD44/CD24-/lav/ABCG2 Brystkræft 67
CD44/CD24-/lav/ALDH1 Brystkræft 43,68,69
CD44/CD24-/lav/EpCAM Brystkræft 5
CD44/CD24-/lav/SSEA-3 Brystkræft 70
CD44/CD49f/CD133/2 Brystkræft 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi Brystkræft 69
CD44/CD117 Kræft i æggestokkene 7
CD44/MyD88 Kræft i æggestokkene 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- Kræft i æggestokkene 74,75
CD44/CD24/Epcam Kræft i æggestokkene 76,77
CD44/CD24- Kræft i æggestokkene 78,79
CD44/CD166 Kræft i æggestokkene 80
CD44/CD24 Livmoderhalskræft 81
CD49f Brystkræft 4
Livmoderhalskræft 82
CD117 eller c-Kit Endometriekræft 83
Kræft i æggestokkene 62,84
CD133 Brystkræft 4,85
Kræft i æggestokkene 62,86
Endometriekræft 13,87,88,89
Livmoderhalskræft 82
CD133hi/CXCR4hi/ALDH1hi Brystkræft 90
CD133/ALDH1 Brystkræft 91
Kræft i æggestokkene 60,92
CD133/CXCR4 Endometriekræft 93
ABCG2 Brystkræft 65
Livmoderhalskræft 82,81
ALDH-1 DELTE ET LINK. Brystkræft 4
Endometriekræft 94,95
Livmoderhalskræft 82
CXCR4 eller CD184 Brystkræft 96
EpCAM/CD49f Brystkræft 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Brystkræft 70
GD2/GD3/GD3Shi Brystkræft 98
ITGA6 (ITGA6) Brystkræft 4
KR. Brystkræft 43

BEMÆRK: Denne tabel indeholder en liste over overflade epitoper udtrykt af forskellige gynækologiske og brystkræft stamceller; de fleste af disse markører udtrykkes også ved en række andre væv. Denne liste har ikke til formål at medtage alle de rapporterede markører.

Tabel 2: Liste over rør, der skal medtages i et typisk flowcytometrieksperiment for at evaluere cd24/CD44-fænotypen. Tabellen viser et minimalt sæt prøverør, der kræves til et co-farvningseksperiment, herunder nødvendige kontroller.

Tube Betingelse Antigen-fluorophore
1 Ikke-farvede celler Ingen
2 Enkelt farveset CD44 CD44-PE
3 Enkelt farveset CD24 CD24-APC
4 Dobbeltplettet CD44/CD24 CD44-PE og CD24-APC

BEMÆRK: Dette eksperiment kan udføres ved at tilføje bilag i V-FICT til rør 4 og tilføje det respektive kontrolrør for at gate annekteret i V negative celler og udelukke eventuelle celler i apoptose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol detaljer en tilgang til at opnå tumorkugler fra kræft cellelinjer og primære menneskelige prøver. Tumorkugler er beriget i en underpopulation med stamcellelignende egenskaber36. Denne berigelse i CSC afhænger af levedygtigheden i et forankringsfrit miljø, mens differentierede celler er afhængige af vedhæftning til et substrat37. Som primær plating af tumorceller i en lav overholdelse miljø, der pålægger suspension ikke sikrer berigelse i CSC i sig selv, vi giver strategier til at evaluere selv-fornyelse (sfære-dannende kapacitet og selvfornyelse), differentiering kapacitet (afledt klæbende populationer), og fænotype af CSC (med flow cytometri og / eller vestlige blot). Kræftceller kan identificeres via flere bredt beskrevne fænotypiske markører (se tabel 1).

Som menneskelige tumor primære kulturer er ofte udfordrende at etablere og vedligeholde i kulturen, den kugledannende protokol kan give et værktøj til håndtering af disse prøver. Den enzymatiske fordøjelsesprocedure, der blev foreslået, gav enkeltcellesuspensioner fra endometrievævsprøver38. Den protokol, der danner sfære, giver et betydeligt antal CSC, som er vanskelige at opnå på anden måde. Den tredimensionale model kan være mere effektiv til at efterligne in vivo situation, nemlig den fysiologiske mikromiljø og tumor heterogenitet, end konventionelle monolayer celle kulturer.

Visheden om tumorkuglernes monoklonale oprindelse er et kritisk skridt i denne protokol. Minimering sammenlægning, som har tendens til at forekomme i suspension kulturer, og en grundig optimering af såning tætheder til at distribuere encellede suspensioner er afgørende24. Andre forfattere foreslog plating af en enkelt celle pr brønd39,40. For at undgå denne besværlige procedure overvandt vi dette problem ved at sikre, at en enkeltcellesuspension er belagt med lav tæthed i et methylcelluloseberiget medium. På grund af vandbedrift og viskositetsstyrke egenskaber23, methylcellulose giver en semi-solid medium, der undgår migration og sammenlægning, der sikrer monoklonalitet af de opnåede kugler21. Antallet af dage i kulturen er et andet aspekt, som er afhængigt af optimering, da det antal dage, der er nødvendigt for at opnå kugler med diametre, der er bedre end 40 μm, afhænger af hver celletype fordoblingstid24. Det lave eller serumfrie medium er et andet kendetegn ved protokollen, da FBS-holdigt medium er relevant for differentieret cellevækst under klæbende forhold41, som i forældrecellelinjerne og i de afledte klæbende celler. Protokollen afhænger af opretholdelsen af en stabil koncentration af de specifikke vækstfaktorer. EGF-signalering spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af pluripotency veje, mens bFGF fungerer som et mitogen bidrager til dannelsen af sfærer42,43.

Den protokol, der danner sfære, og som er forbundet med passende teknikker, giver mulighed for at udvide, isolere og evaluere specifikke populationer af CSC21. Flere forfattere har peget på sin nytte i vurderingen af stamcellegenekspression44,45,46,47 og stængel i tumorer47,48, at studere epitel-mesenchymal overgang44,49 og tumorigenese45,48, at vurdere effekten af nye behandlingsformer21,50 og resistens44, 51, og at etablere kulturer fra primærprøver21,45,46. Det er imidlertid vigtigt at huske på, at det er et følsomt eksperiment, der er meget afhængigt af passende kulturforhold. Derudover, de kugler nuværende cellulære heterogenitet på grund af CSC asymmetrisk division52 og repræsenterer ikke en god model for kompleksiteten af kræft stamcelledannelse og vedligeholdelse i in vivo niche46.

Ud over den sfæredannende protokol er andre funktionelle analyser blevet brugt til påvisning af CSC. In vivo tumorigenicity indebærer vaccination af lave celletal hos immunkompromitterede mus for at opnå tumorer36,53. Dette afhænger af tilgængeligheden af ordentlige betingelser for at udføre dyreforsøg, og på grund af det ikke-artsspecifikke mikromiljø kan det være en udfordring at bjærge levende celler. En koloni danner enhed assay, evaluere celle evne til at generere kolonier, efter at de er belagt ved lav densitet52,giver lave celletal. Sidepopulationen er afhængig af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere en gruppe celler med evnen til at ekstrudere Hoescht 33342-pletten. Denne følsomme metode er baseret på udtryk for ATP bindende kassetteprotein (ABC) transportører, der er ansvarlige for narkotika efflux54. Ikke desto mindre er sidepopulationen forbundet med visse ulemper, nemlig ikke-specificitet for visse fænotyper af CSC og farvestoffets egenskaber, som er giftigog i vid udstrækning påvirket af forsøgsbetingelser (temperatur, koncentration)54,55. ALDEFLUOR er en anden flow cytometri-baseret analyse til identifikation af celler med intracellulære ALDH aktivitet. Det vigtigste spørgsmål er den manglende reproducerbarhed mellem undersøgelser , der synes at være stærkt påvirket af kulturforholdene54.

Den sfæredannende protokol kombineres ofte med fænotypisk analyse, som vi har foreslået her, og understreger nytten af komplementære metoder til at identificere CSC13,14. Vi anbefalede CSC-berigelse via protokollen om sfæredannelse og yderligere bekræftelse af stængelhed via vurdering af biokemiske markører ved flowcytometri og vestlig skamplet. Flow cytometri undersøgelser identificeret heterogene populationer inden for kuglerne. Faktisk er der en berigelse i CSC i de viste undersøgelser, repræsenteret i denne protokol af CD44høj/ CD24lav celler. På grund af CSC asymmetrisk selvfornyelse24, andre celle fænotyper blev også identificeret. For CD133-sagen viste repræsentative resultater, at befolkningen med højere stængelhed var positiv for ECC-1-cellelinjen, men negativ i RL95-2-sfærerne. Dette peger på den manglende specificitet af nogle CSC-markører, der er beskrevet, og som ikke er unikke for disse celler og kan variere med fænotypens plasticitet, og på vigtigheden af at bruge en kombination af strategier til at bekræfte stænsomheden.

Western blot er en alternativ metode, der kan være nyttig i visse tilfælde. For eksempel, mens ALDH aktivitet er stort set brugt, Det er nu kendt, at flere isoformer bidrage til ALDEFLUOR metabolisering54. Således kan specifikke antigen-antistof metoder være mere pålidelige, og vi allerede viste sammenhængen mellem ALDH protein udtryk og stængel13,14.

Sphere-forming kapacitet, selvfornyelse og afledte tilhængere populationer repræsenterer csc's evne til på ubestemt tid at opdele og producere et differentieret afkom, som klinisk kan oversættes til hændelser som tilbagefald, metastisering og modstandsdygtighed over for behandling9. Lægemiddelresistens i CSC kan forklares ved overekspression af multidrug resistens (MDR) membran proteiner, ALDH udtryk involveret i afgiftning mekanismer, DNA reparation mekanismer, beskyttelse mod reaktive ilt arter og modstandsdygtighed over for apoptose56. CSC har kapacitet til at være quiescent på grund af deres plasticitet, og dette har vist sig som en mekanisme til resistens over for lægemidler. Denne population kan skånes fra kemo- og strålebehandling på grund af celle-cyklus anholdt differentierede celler57. Kugler er en tumor population med rapporteret resistens over for cytostatiske lægemidler, der anvendes i konventionel behandling og har også været et fokus for kombination med målrettede behandlingsformer54,58,59. Følsomheden af kugler kan testes for cytostatiske, der anvendes i bryst-og endometriecancer. Desuden kan isolering af CSC fra en tumorprøve være en platform for klinisk anvendelse af terapi, der er specifik for hver tumor, forudsige resistens og deraf følgende tilbagevendende sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af det portugisiske selskab af gynækologi gennem 2016 Research Prize og CIMAGO. Cnc. IBILI støttes gennem Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) og samfinansieres af FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, der er godkendt af CHUC's Etiske Komité for Sundhed og af den portugisiske nationale databeskyttelseskommission, var kilden til endometrieprøver af patienter, der blev fulgt på institutionens gynækologitjeneste. Figur 1 blev produceret ved hjælp af Servier Medical Art, fås fra www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142 (2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours accumulating evidence and unresolved questions. Nature reviews. Cancer. 8, 755-768 (2008).
  4. Allegra, A., et al. The Cancer Stem Cell Hypothesis: A Guide to Potential Molecular Targets. Cancer Investigation. 32 (9), 470-495 (2014).
  5. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  6. Friel, A. M., et al. Functional analyses of the cancer stem cell-like properties of human endometrial tumor initiating cells. Cell Cycle. 7 (2), 242-249 (2008).
  7. Zhang, S., et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Research. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  8. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  9. Carvalho, M. J., Laranjo, M., Abrantes, A. M., Torgal, I., Botelho, M. F., Oliveira, C. F. Clinical translation for endometrial cancer stem cells hypothesis. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (3), 401-416 (2015).
  10. Morel, A. P., Lièvre, M., Thomas, C., Hinkal, G., Ansieau, S., Puisieux, A. Generation of Breast Cancer Stem Cells through Epithelial-Mesenchymal Transition. PLoS ONE. 3 (8), e2888 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. The FASEB Journal. 27 (1), 13 (2013).
  12. Ajani, J. A., et al. ALDH-1 expression levels predict response or resistance to preoperative chemoradiation in resectable esophageal cancer patients. Molecular Oncology. 8 (1), 142-149 (2014).
  13. Carvalho, M. J., et al. Endometrial Cancer Spheres Show Cancer Stem Cells Phenotype and Preference for Oxidative Metabolism. Pathology and Oncology Research. , (2018).
  14. Laranjo, M., et al. Mammospheres of hormonal receptor positive breast cancer diverge to triple-negative phenotype. The Breast. 38, 22-29 (2018).
  15. Cui, M., et al. Non-Coding RNA Pvt1 Promotes Cancer Stem Cell–Like Traits in Nasopharyngeal Cancer via Inhibiting miR-1207. Pathology & Oncology Research. , (2018).
  16. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 ALDH1), in human epithelial cancers. PloS one. 5 (4), e10277 (2010).
  17. Weiswald, L. B., Guinebretière, J. M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC Cancer. 10 (1), 106 (2010).
  18. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical Cancer Models in Tumor Biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  19. Picon-Ruiz, M., et al. Low adherent cancer cell subpopulations are enriched in tumorigenic and metastatic epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem-like cells. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  20. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  21. Ballout, F., et al. Sphere-Formation Assay: Three-Dimensional in vitro Culturing of Prostate Cancer Stem/Progenitor Sphere-Forming Cells. Frontiers in Oncology. 8 (August), 1-14 (2018).
  22. Ishiguro, T., Ohata, H., Sato, A., Yamawaki, K., Enomoto, T., Okamoto, K. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108 (3), 283-289 (2017).
  23. Noseda, M., Nasatto, P., Silveira, J., Pignon, F., Rinaudo, M., Duarte, M. Methylcellulose, a Cellulose Derivative with Original Physical Properties and Extended Applications. Polymers. 7 (5), 777-803 (2015).
  24. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  25. Zhou, M., et al. LncRNA-Hh Strengthen Cancer Stem Cells Generation in Twist-Positive Breast Cancer via Activation of Hedgehog Signaling Pathway. Stem cells (Dayton, Ohio). 34 (1), 55-66 (2016).
  26. Ha, J. R., et al. Integration of Distinct ShcA Signaling Complexes Promotes Breast Tumor Growth and Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance. Molecular cancer research MCR. 16 (5), 894-908 (2018).
  27. Jurmeister, S., et al. Identification of potential therapeutic targets in prostate cancer through a cross-species approach. EMBO molecular medicine. 10 (3), (2018).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  30. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of Proteins: The Importance of Lysis Buffer Choice. , 49-60 (2015).
  31. Olson, B. J. S. C. Assays for Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Pharmacology. , A.3A.1-A.3A.32 (2016).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), 1-2 (2010).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. Journal of Visualized Experiments. 84 (84), 1-8 (2014).
  34. Oldknow, K. J., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. 8 (93), 1-10 (2014).
  35. Serambeque, B. Células estaminais do cancro do endométrio - a chave para o tratamento personalizado? [Stem Cells of Endometrial Cancer: The Key to Personalized Treatment?]. , University of Coimbra. Master thesis (2018).
  36. Lee, C. H., Yu, C. C., Wang, B. Y., Chang, W. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti-cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), (2015).
  37. De Luca, A., et al. Mitochondrial biogenesis is required for the anchorage-independent survival and propagation of stem-like cancer cells. Oncotarget. 6 (17), (2015).
  38. Masuda, A., et al. An improved method for isolation of epithelial and stromal cells from the human endometrium. Journal of Reproduction and Development. 62 (2), 213-218 (2016).
  39. Del Rio-Tsonis, K., et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (44), 15772-15777 (2004).
  40. Wang, L., Guo, H., Lin, C., Yang, L., Wang, X. I. Enrichment and characterization of cancer stem-like cells from a cervical cancer cell line. Molecular Medicine Reports. 9 (6), 2117-2123 (2014).
  41. Chen, Y. C., et al. High-throughput single-cell derived sphere formation for cancer stem-like cell identification and analysis. Scientific Reports. 6 (April), 1-12 (2016).
  42. Kim, J., Jung, J., Lee, S. J., Lee, J. S., Park, M. J. Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling. Oncology Letters. 3 (3), 607-612 (2012).
  43. Hwang-Verslues, W. W., et al. Multiple Lineages of Human Breast Cancer Stem/Progenitor Cells Identified by Profiling with Stem Cell Markers. PloS one. 4 (12), e8377 (2009).
  44. Feng, Y., et al. Metformin reverses stem cell-like HepG2 sphere formation and resistance to sorafenib by attenuating epithelial-mesenchymal transformation. Molecular Medicine Reports. 18 (4), 3866-3872 (2018).
  45. Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. Journal of Visualized Experiments. (95), 1-11 (2015).
  46. Stebbing, J., Lombardo, Y., Coombes, C. R., de Giorgio, A., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (97), 1-5 (2015).
  47. Zhao, H., et al. Sphere-forming assay vs. organoid culture: Determining long-term stemness and the chemoresistant capacity of primary colorectal cancer cells. International Journal of Oncology. 54 (3), 893-904 (2019).
  48. Bagheri, V., et al. Isolation and identification of chemotherapy-enriched sphere-forming cells from a patient with gastric cancer. Journal of Cellular Physiology. 233 (10), 7036-7046 (2018).
  49. Kaowinn, S., Kaewpiboon, C., Koh, S., Kramer, O., Chung, Y. STAT1-HDAC4 signaling induces epithelial-mesenchymal transition and sphere formation of cancer cells overexpressing the oncogene, CUG2. Oncology Reports. , 2619-2627 (2018).
  50. Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. Journal of Visualized Experiments. (100), 1-9 (2015).
  51. Lu, H., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine. 40, 276-289 (2019).
  52. Bu, P., Chen, K. Y., Lipkin, S. M., Shen, X. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells. Oncotarget. 4 (7), (2013).
  53. Islam, F., Qiao, B., Smith, R. A., Gopalan, V., Lam, A. K. Y. Cancer stem cell: fundamental experimental pathological concepts and updates. Experimental and molecular pathology. 98 (2), 184-191 (2015).
  54. Liu, W., et al. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer research. 35 (4), 1917-1927 (2015).
  55. Broadley, K. W. R., et al. Side Population is Not Necessary or Sufficient for a Cancer Stem Cell Phenotype in Glioblastoma Multiforme. STEM CELLS. 29 (3), 452-461 (2011).
  56. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  57. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  58. Zhang, X. L., Jia, Q., Lv, L., Deng, T., Gao, J. Tumorspheres Derived from HCC Cells are Enriched with Cancer Stem Cell-like Cells and Present High Chemoresistance Dependent on the Akt Pathway. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 15 (6), 755-763 (2015).
  59. Fukamachi, H., et al. CD49fhigh Cells Retain Sphere-Forming and Tumor-Initiating Activities in Human Gastric Tumors. PLoS ONE. 8 (8), e72438 (2013).
  60. Gao, M. Q., Choi, Y. P., Kang, S., Youn, J. H., Cho, N. H. CD24+ cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells. Oncogene. 29 (18), 2672-2680 (2010).
  61. Cariati, M., et al. Alpha-6 integrin is necessary for the tumourigenicity of a stem cell-like subpopulation within the MCF7 breast cancer cell line. International Journal of Cancer. 122 (2), 298-304 (2008).
  62. López, J., Valdez-Morales, F. J., Benítez-Bribiesca, L., Cerbón, M., Carrancá, A. Normal and cancer stem cells of the human female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology. 11 (1), 53 (2013).
  63. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8 (1), 158-166 (2009).
  64. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Birnbaum, D. Breast cancer stem cells: tools and models to rely on. BMC Cancer. 9 (1), 202 (2009).
  65. Leccia, F., et al. ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells. Molecular Cancer. 13 (1), 213 (2014).
  66. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  67. Sun, M., et al. Enhanced efficacy of chemotherapy for breast cancer stem cells by simultaneous suppression of multidrug resistance and antiapoptotic cellular defense. Acta Biomaterialia. 28, 171-182 (2015).
  68. Shao, J., Fan, W., Ma, B., Wu, Y. Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular Medicine Reports. 14 (6), 4991-4998 (2016).
  69. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8b), 2236-2252 (2009).
  70. Cheung, S. K. C., et al. Stage-specific embryonic antigen-3 (SSEA-3) and β3GalT5 are cancer specific and significant markers for breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), 960-965 (2016).
  71. Meyer, M. J., Fleming, J. M., Lin, A. F., Hussnain, S. A., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. CD44 pos CD49f hi CD133/2 hi Defines Xenograft-Initiating Cells in Estrogen Receptor–Negative Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4624-4633 (2010).
  72. Ahn, S. M., Goode, R. J. A., Simpson, R. J. Stem cell markers: Insights from membrane proteomics? PROTEOMICS. 8 (23-24), 4946-4957 (2008).
  73. Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12 (3), 511-521 (2013).
  74. Alvero, A. B., et al. Stem-Like Ovarian Cancer Cells Can Serve as Tumor Vascular Progenitors. Stem Cells. 27 (10), 2405-2413 (2009).
  75. Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial–ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32 (1), 39-49 (2013).
  76. Wei, X., et al. Mullerian inhibiting substance preferentially inhibits stem/progenitors in human ovarian cancer cell lines compared with chemotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18874-18879 (2010).
  77. Meirelles, K., et al. Human ovarian cancer stem/progenitor cells are stimulated by doxorubicin but inhibited by Mullerian inhibiting substance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (7), 2358-2363 (2012).
  78. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  79. Meng, E., et al. CD44+/CD24− ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (8), 939-948 (2012).
  80. Witt, A. E., et al. Identification of a cancer stem cell-specific function for the histone deacetylases, HDAC1 and HDAC7, in breast and ovarian. Oncogene. 36 (12), 1707-1720 (2017).
  81. Wu, H., Zhang, J., Shi, H. Expression of cancer stem markers could be influenced by silencing of p16 gene in HeLa cervical carcinoma cells. European journal of gynaecological oncology. 37 (2), 221-225 (2016).
  82. Huang, R., Rofstad, E. K. Cancer stem cells (CSCs), cervical CSCs and targeted therapies. Oncotarget. 8 (21), 35351-35367 (2017).
  83. Zhang, X., et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Letters. 345 (1), 106-114 (2014).
  84. Luo, L., et al. Ovarian cancer cells with the CD117 phenotype are highly tumorigenic and are related to chemotherapy outcome. Experimental and Molecular Pathology. 91 (2), 596-602 (2011).
  85. Zhao, P., Lu, Y., Jiang, X., Li, X. Clinicopathological significance and prognostic value of CD133 expression in triple-negative breast carcinoma. Cancer Science. 102 (5), 1107-1111 (2011).
  86. Ferrandina, G., et al. Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer. International Journal of Gynecologic Cancer. 18 (3), 506-514 (2008).
  87. Rutella, S., et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clinical cancer research an official journal of the American Association for Cancer Research. 15 (13), 4299-4311 (2009).
  88. Friel, A. M., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 147 (2010).
  89. Nakamura, M., et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Human Pathology. 41 (11), 1516-1529 (2010).
  90. Saha, S. K., et al. KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate NUMB-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties. Oncogene. 36 (3), 332-349 (2017).
  91. LV, X., Wang, Y., Song, Y., Pang, X., Li, H. Association between ALDH1+/CD133+ stem-like cells and tumor angiogenesis in invasive ductal breast carcinoma. Oncology Letters. 11 (3), 1750-1756 (2016).
  92. Ruscito, I., et al. Exploring the clonal evolution of CD133/aldehyde-dehydrogenase-1 (ALDH1)-positive cancer stem-like cells from primary to recurrent high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). A study of the Ovarian Cancer Therapy–Innovative Models Prolong Survival (OCTIPS). European Journal of Cancer. 79, 214-225 (2017).
  93. Sun, Y., et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 10 (6), 976-987 (2017).
  94. Rahadiani, N., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Science. 102 (4), 903-908 (2011).
  95. Mamat, S., et al. Transcriptional Regulation of Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Gene by Alternative Spliced Forms of Nuclear Factor Y in Tumorigenic Population of Endometrial Adenocarcinoma. Genes & Cancer. 2 (10), 979-984 (2011).
  96. Mukherjee, S. A., et al. Non-migratory tumorigenic intrinsic cancer stem cells ensure breast cancer metastasis by generation of CXCR4+ migrating cancer stem cells. Oncogene. 35 (37), 4937-4948 (2016).
  97. Lim, E., et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nature Medicine. 15 (8), 907-913 (2009).
  98. Liang, Y. J., et al. Interaction of glycosphingolipids GD3 and GD2 with growth factor receptors maintains breast cancer stem cell phenotype. Oncotarget. 8 (29), 47454-47473 (2017).

Tags

Cancer Research neopplastiske stamceller brystkræft tumorkugler gynækologisk kræft kugledannende protokol kræft stamceller markører
Opnåelse kræft stamceller kugler fra gynækologiske og brystkræft tumorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laranjo, M., Carvalho, M. J.,… More

Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter