Summary
Vi præsenterer en protokol for isolering af endokardie- og koronarenendotelceller fra rottehjerter gennem sekventiel vævsfordøjelse i en fordøjelsesbuffer, cellesamling fra tilbagevendende centrifugecyklusser og cellerensning ved hjælp af anti-rotte CD31 mikroperler.
Abstract
Det er blevet påvist, at endokardie-endotelceller (EECs) og koronar endotelceller (CFC) varierer i oprindelse, udvikling, markører og funktioner. Derfor spiller disse to cellepopulationer en unik rolle i hjertesygdomme. Aktuelle undersøgelser, der involverer isolerede endotelceller, undersøger cellepopulationer bestående af både EEC'er og central- og østeuropæiske lande. Denne protokol skitserer en metode til selvstændigt at isolere disse to cellepopulationer til cellespecifik karakterisering. Efter indsamlingen af den venstre og højre ventrikelfri væg frigøres endotelceller fra den ydre overflade og indersiden separat ved hjælp af en fordøjelsesbufferopløsning. Den sekventielle fordøjelse af den ydre overflade og det indre endokardielag beholdt adskillelse af de to endotelcellepopulationer. Den særskilte isolering af eIC'er og central- og østeuropæiske lande kontrolleres yderligere ved at identificere markører, der er specifikke for hver enkelt population. Baseret på tidligere offentliggjorte enkeltcelleRNA profilering i mus hjertet, Npr3, Hapln1, og Cdh11 genekspression er unik for EECs; mens Fabp4, Mgllog Cd36-genekspression er unikke for central- og østeuropæiske lande. Cd36 qPCR-data afslørede beriget udtryk for disse karakteristiske markører i deres respektive prøver, hvilket indikerer vellykket EØF- og CEC-isolation samt vedligeholdelse af cellefænotype, hvilket muliggør yderligere cellespecifik funktionel analyse.
Introduction
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol (ændret fra Gladka et al.1) for dissektion og efterfølgende isolering af endokardie-endotelceller (EECs) og koronar endotelceller (CFC) fra rottehjerter. Evnen til at undersøge disse cellepopulationer uafhængigt ville gøre det muligt at udforske celletypespecifikke mekanismer, der ligger til grund for en række hjertesygdomme, der kan tjene som potentielle terapeutiske mål. En vellykket metode til indsamling af disse cellepopulationer uafhængigt er endnu ikke offentliggjort, dog.
De central- og østeuropæiske lande adskiller sig fra de europæiske erhvervs- og østeuropæiske lande med hensyn til deres oprindelse, markører og funktioner under hjerteudvikling og sygdom1,2,3,4,5,6,7. EECs stammer fra den ventrale overflade af hjertemesoderm3. De opstår fra Flk1+ progenitor celler som reaktion på VEGF og HIF signalering og danner det inderste lag af de tre diskrete regioner i udviklingslandene hjerte: atrium, hjertekammer, og sinus venosus3,6. Genetisk afstamning sporing tyder på, at de pluripotente endokardieceller i sinus venosus udlede venøse celler, som migrerer til at danne det subepikardielag3. Efterfølgende, det subepikardielag differentieres i kranspulsårer og vener, herunder cfcs, som forbliver på tværs af den perifere ventrikulære fri væg3,4. Denne endocardial til endotel vej er reguleret af VEGFC, ELA / APJ, og SOX17 signalering3,,4,,6,8,9. Den ventrikulære endokardiet stammer færre ccc'er af interventrikulær septum ved en ukendt mekanisme3. Efterfølgende foreslås lokaliseret differentiering mellem eIC'er og central- og østeuropæiske lande af markører, der er specifikke for disse to cellepopulationer, herunder Mgll, Fabp4 og Cd36-udtryk i central- og østeuropæiske lande eller Npr3- og Cdh11- og Hapln1-udtryk i EECs3,5,10.
EECs og central- og østeuropæiske lande spiller forskellige roller i hjertefunktion. Endokardie til mesenkymal overgang, ventil dannelse, kammer modning, udstrømning tarmkanalen regulering, og atrioventrikulære kanal udvikling er betinget af EECs6. Alternativt bidrager central- og østeuropæiske lande til vasomotorisk tone og betændelse i kranspulsårerne11. Disse udsving i funktion resulterer i individualiserede roller i sygdomsudviklingen4,12. For eksempel tyder tyder på, at funktionssvigt EECs kan føre til medfødt ventilsygdom6, noncompaction myokardi6, atrioventrikulær septal effekt6, endokardiefibroelastose13, hypoplastisk venstre hjertesyndrom13, ventrikelhypoplasi13, og hjertehypertrofi12. Tilsvarende har undersøgelser vist, at unormale central- og østeuropæiske lande bidrager til koronararteriesygdom14 og trombose11.
En vellykket isolering af e-pc'er og central- og østeuropæiske lande er nødvendig for at opnå omfattende viden om disse to cellepopulationer, som kan udnyttes i både forskning og kliniske miljøer. Fastlæggelsen af disse cellepopulationers vækst- og differentieringsfaktorer vil være en reference for differentieringen af endotelundertyper fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC). Endvidere er fuldstændig identifikation af varianserne i udviklingen, reguleringen og funktionen af e-pc'er og central- og østeuropæiske lande afgørende for forståelsen af de genomiske og epigenomiske faktorer, der er ansvarlige for talrige hjertesygdomme på en celletypespecifik måde. I denne artikel beskrives trin en vellykket samling af eIC'er og central- og østeuropæiske lande uafhængigt og giver dokumentation for adskillelse ved at vurdere genekspressionsniveauerne for celletypespecifikke markører.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af det administrative panel for laboratoriepleje (APLAC31608) på Stanford University.
1. Forberedelse af buffere
- Fordøjelsesbufferen klargør ved hjælp af de reagenser, der er anført i tabel 1.
- Klargør DNase I-stamopløsningen: Opløs DNase I i RNase-frit vand til en stamopløsning på 2.000 enheder/ml (1 mg/ml). Aliquot og opbevar stamopløsningen ved -20 °C.
- Klargør liberaseopløsningen: Opløs liberase med RNase-frit vand for en stamopløsning på 5 mg/ml. Den roteres på en rullebank ved 4 °C i 30 min. Aliquot og stamopløsningen opbevares ved -20 °C.
- Sorteringsbufferen fremstilles ved at fortynde 0,5 M ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) og 10 % kvægserumalbumin (BSA) stamopløsning med 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) til en endelig koncentration på 2 mM EDTA og 0,5% af BSA.
2. Hjerte samling
BEMÆRK: Seks Sprague Dawley rotter vejer 50-100 g blev brugt i denne protokol. Der blev ikke observeret nogen kønsforskel.
- Euthanize rotten med CO2 og placere den i en supinposition på en dissekering platform. Pin ekstremiteterne ned og sterilisere både maven og brystet med 70% ethanol.
- Åbn maven med en saks og indsæt en 21 G nål i den del af den bageste vena cava placeret bag tarmene. Træk sprøjtestemplet tilbage, trække blodet ud af venen, indtil leveren ser lysere ud i farven, og der ikke længere kan trækkes blod tilbage, hvilket indikerer tilstrækkelig fjernelse af blod.
- Brug saks, åbne brystet omhyggeligt for at undgå at beskadige lunge og hjerte. Løft aorta arch / atrium med pincet og skær aorta, lungepulsåren, lungevener, og vena cava at befri og fjerne hjertet.
- Vask hjertet med 50 ml kold 1x Hanks' balancerede saltopløsning (HBSS) buffer 3x for at fjerne overdrevent blod.
- Under et mikrodissektionsmikroskop fjernes den højre ventrikelfri væg i et 5 ml rør, der indeholder Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (Figur 1A,B).
- Læg hjertet på sin fladere, bageste ansigt til at identificere venstre og højre side.
- Find lungepulsåren, den mest forreste af venerne og arterierne forgrening fra toppen af hjertet og skære gennem lungepulsåren ned til højre ventrikulære kammer. På den anterior ansigt af hjertet, skæres langs septum indtil de når spidsen. Fortsæt med at skære fra spidsen op den bageste side af hjertet langs skillevæggen, indtil lungepulsåren og højre ventrikelkammer junction punkt (Figur 1A).
- Fra lungepulsåren og højre ventrikeljunction punkt, skæres både den anteriore og bageste side af hjertet vinkelret til den tidligere dissektion og væk fra septum, indtil højre ventrikulære fri væg er befriet fra resten af hjertet (Figur 1B).
- Under mikrodissektionsmikroskopet fjernes den venstre ventrikulære frie væg i et 5 ml rør, der indeholder DMEM (Figur 1C,D).
- Find aorta, forgrening fra toppen af hjertet bag lungepulsåren, og gentag den metode, der er beskrevet i trin 2.5 at afskære venstre ventrikulære fri væg.
3.
- Placer både højre og venstre ventrikulære fri vægvæv i en 60 cm kulturskål med den indvendige overflade fladt nedad (Figur 2).
BEMÆRK: Den indvendige overflade er den indvendige side af den let konkave formede ventrikel som vist i figur 2A,C. - Der tilsættes 0,5-1 ml fordøjelsesbuffer til skålen, og spidsen af pipetten placeres direkte under vævet. Fortsæt, indtil kun den indre overflade er nedsænket.
- Inkuber skålen i en 5% CO2, 37 °C inkubator i 5 min.
- Tilføj EF-medium til kulturskålen for at stoppe fordøjelsen.
BEMÆRK: Hold mængden af fordøjelsesbuffer til EF-medium som et 1:5-forhold. - Brug en 1 ml pipette til at skylle den indvendige overflade af hjertekamrene med EF-medium og overføre afstrømningen til et 50 ml opsamlingsrør gennem en 40 mm si (Figur 2E). Hold samlingerne på is til nedstrømsrensning.
4. CEC fordøjelse
- Skær langs den ydre overflade af venstre hjertekammer uden forurening fra det indre lag (Figur 2B,D) og anbringes hver i et separat 5 ml rør, der indeholder 1 ml fordøjelsesbuffer.
BEMÆRK: Den venstre hjertekammer kan identificeres som den tykkere hjertekammer, og den ydre overflade kan bestemmes som den udvendige side af den lidt konkave ventrikel. - Brug dissektion saks, hakke den ventrikulære væg i små, 1 mm3 stykker.
- Inkuber røret i et 37 °C vandbad i ca. 15-20 min. Vortex hver 2-3 min.
- 4 ml EF-medium pipetterer ind i 5 ml-røret for at afslutte fordøjelsen.
- Opløsningen overføres med en 5 ml serologisk pipette til et 50 ml rør gennem en 40 mm si (figur 2E). Hold samlingerne på is til nedstrømsrensning.
5. Cellesamling
- Rørene centrifugeres ved 300 x g i 10 min ved stuetemperatur (RT), og derefter aspirat er supernatanten.
- Hvis pellet'en ser rød ud, skal pelleten i 1-2 ml 1x røde blodlegemer (RBC) lysingbuffer(Figur 2F).
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen RBC'er, skal du fortsætte til trin 6. - Rørbene inkuberes i et 37 °C vandbad i 5 min.
- Pipette 10 ml PBS i 50 ml-rørene for at stoppe lysisen.
- Rørene centrifugeres ved 300 x g i 10 min ved RT, og aspirer derefter supernatanten.
6. EF-sortering
- Der tilsættes 90 μL sorteringsbuffer og 10 μL anti-CD31 PE antistof i 50 ml rørene.
- Vortex rørene og derefter inkubere dem i 10 min i en 4 °C køleskab.
- Der tilsættes 10 ml sorteringsbuffer i rørene, blandes grundigt, og centrifuger derefter ved 300 x g i 10 minutter ved RT.
- Aspirer er supernatanten, og resuspender pelleten i 80 μL sorteringsbuffer og 20 μL anti-PE mikroperler.
- Vortex rørene og inkuberved 4 °C i 15 min.
- Cellerne indrettes ved at tilsætte 10 ml sorteringsbuffer i rørene, blandes grundigt, og centrifuger dem derefter ved 300 x g i 10 minutter ved RT.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 500 μL sorteringsbuffer.
- Anbring en kolonne, der indeholder superparamagnetiske kugler, i en magnetisk separator og skylles kolonnen med 3 ml sorteringsbuffer.
- Når kolonnen er "flowstop", pipettes 500 μL af cellesuspensionen i kolonnerne, og derefter vaskes kolonnerne med sorteringsbuffer. Vask 3x gentages med 3 ml sorteringsbuffer (figur 2G).
- Fjern kolonnerne fra separatoren, og placer dem oven på et nyt 15 ml opsamlingsrør.
- Med en pipette tilsættes 5 ml EF-medium til kolonnerne, og fremdrive opløsningen ved hjælp af en kolonne stempel.
- Opsamlingsrørene centrifugeres ved 300 x g i 10 min ved RT, og overvæn derefter supernatanten.
- RNA'et udvindes af EØF- og CEC-prøverne ved hjælp af et sæt efter fabrikantens anvisninger. Der kan opnås mindst 500 NG RNA.
BEMÆRK: Efter RNA-ekstraktion kan prøven opbevares ved -80 °C. - Omvendt transskribere 500 NG af RNA for at få cDNA ved hjælp af en tilfældig primer og et kit, efter producentens anvisninger.
- Udfør kvantitativ PCR til validering af endokardie- og endotelpopulationer (figur 2H). Primersekvenser er angivet i tabel 2.
- Der tilsættes 5 μL EØF eller CEC cDNA (1 ng/μL) i brøndene på en 384 qPCR-plade. Tilsæt EØF eller CEC cDNA i nok brønde, så der er tre brønde pr. antal primere.
- 6 μL 2x qPCR SYBR grøn buffer blandes med 0,5 μL af hver 10 μM primer, herunder både frem- og tilbagevendte primere, og tilsæt dem i en enkelt brønd, der svarer til hvert kandidatgen.
- Forsegl pladen med plastfolie og centrifuge i 1 min ved 300 x g ved RT.
- Pladen anbringes i en qPCR-maskine, og programmet startes derefter ved 95 °C i 3 min, efterfulgt af 95 °C for 15 s, og derefter 55 °C for 60 s. Gentag de efterfølgende to trin i 45 cyklusser.
Representative Results
Processen med isolation af EØF og CEC er beskrevet i figur 2. Den vellykkede isolering af e-pc'er og central- og østeuropæiske lande blev bestemt ved at vurdere tilstedeværelsen af panendotelcellemarkører samt dem, der adskiller sig fra de to undertypepopulationer. Som forudsagt, qPCR afslørede, at i forhold til ββ-actin, EECs udtrykt højere niveauer af endokardiemarkører Npr3, Hapln1, og Cdh11 i forhold til central- og østeuropæiske lande (Figur 3A). På samme måde gav central- og østeuropæiske lande udtrykt højere niveauer af koronarmarkører Fabp4, Mgllog Cd36 sammenlignet med eECs (figur 3B). Desuden gav både eIC'er og central- og østeuropæiske lande udtryk for pan-EF-markørgencdh5 med lidt højere niveauer i CEC (figur 3C). Cdh5
Figur 1: Diagram over hjertedissektion. (A) Første snit lavet til at adskille højre ventrikel fri væg fra skillevæggen. (B) Andet snit lavet til at frigøre højre hjertekammer helt. (C) Første snit lavet til at adskille venstre ventrikel fri væg fra skillevæggen. (D) Andet snit lavet til at befri venstre hjertekammer helt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Diagram over opsætningen af de central- og østeuropæiske lande og eIC'er og følgende arrangement for cellesortering. (A) Inderste frie ventrikelvæg og (B) yderste ventrikelfri væg var (C) nedsænket i fordøjelsesbuffer eller (D) fordøjet i fordøjelsesbufferen. (E) Indsamling og filtrering af celleopløsninger efterfulgt af (F) rød blodcelle (RBC) lysis og (G) magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) ved hjælp af CD31-antistoffet. hh) Rensede ECs blev behandlet med henblik på verifikation af genekspression ved hjælp af qPCR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: qPCR-data, der kontrollerer isolering af central- og østeuropæiske lande og eIC'er. (A) Genekspressionsniveauerne for EØF-markørerne Npr3, Cdh11og Hapln1 i EF-plan og central- og østeuropæiske lande blev kvantificeret ved pcr i realtid. (B) Genekspressionsniveauerne for CEC-markørerne Mgll, Fabp4og Cd36 i EIC'er og central- og østeuropæiske lande blev kvantificeret ved pcr i realtid. (C) Pan-EF-mærket Cdh5 blev kvantificeret i EEC'er og central- og østeuropæiske lande ved hjælp af PCR i realtid. (n = 3 i hver gruppe). Barerne repræsenterer middelværdien ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 vs. EØF, ikke-parret t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel 1. Fordøjelsesbuffer (1,5 ml) | |||
| Aktiehandler. | Endelig Con. | Volumen | |
| Liberase TM | 5 mg/ml | 0,5 mg/ml | 150 ul |
| Dnase I | 1 mg/ml | 20 ug/ml | 30 ul |
| HEPES (HEPES) | 1 m | 10 mM | 15 ul |
| DMEM | - | - | 1305 ul |
Tabel 1: Opskrift på fordøjelsesbufferen.
| Tabel 2. Primer sekvenser | ||
| Gennavn | Frem | Omvendt |
| Npr3 (Npr3) | TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA | GGAATCTTCCCGCAGCTCTC |
| Cdh11 (Cdh11) | GTGAATGGGACTGGGACTGG | GTAATTTGGGGGGTTGC |
| Hapln1 (Hapln1) | CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG | GGGCCATTTTCAGCTTGGATG |
| Mgll (Mgll) | CCCGGGGCCCAAAGAC | GAAGATGAGGGCCTTGGGTG |
| Fabp4 delte et af de kl. | AGAAGTGGTTGGCTTCG | ACTCTCTGACCGGATGACGA |
| Cd36 (cd36) | GCAAAACGACTGCAGGTCAA | CCCGGTCACTTGGTTCTGA |
| Cdh5 (Cdh5) | CCATTGAGACAGACCCCGAC DELTE ET LINK. | TGTGGAACGTGTACTGCTGG |
| B-actin | TCTGTGTGGATTGGTGGCTC | CGGACTCATCGTACTCCTGC |
Tabel 2: Primer-sekvenser
Discussion
Central- og østeuropæiske lande og eIC'er har forskellig oprindelse, markører og funktioner og kan derfor spille en unik rolle i udvikling og sygdom. De eksisterende protokoller for endotelcelleisolation er begrænset til makrovaskulært væv, hvilket forsømmer indsamlingen af e-pc'er og begrænser således studiet af CEC- og EØF-specifikke funktioner. Det er vigtigt at isolere og undersøge disse to populationer uafhængigt, da denne viden vil danne grundlag for differentieringen af iPS'er i central- og østeuropæiske lande med henblik på fremtidige undersøgelser og lette undersøgelsen af disse cellepopulationer for potentielle terapeutiske mål for forskellige hjertesygdomme. Denne nye protokol skitserer en metode til isolering af EECs fra den indre overflade og central- og østeuropæiske lande fra den ydre overflade af ventrikelfri væg af voksne rotter.
Det er afgørende at kontrollere timingen for hvert trin meget præcist i denne protokol. Fordi antallet af EECs er meget begrænset i rotte hjertevæv, minimerede vi fordøjelsestiden for det indre lag af hjertet for at forhindre cellulære skader og endnu vigtigere, CEC forurening. Øjeblikkelig tilføjelse af EF-mediet opløsning til at afslutte den enzymatiske reaktion er også meget vigtig for at opretholde høj cellelevedygtighed. En rød pellet efter cellesamling tyder på tilstedeværelsen af et stort antal RBC'er. Afhængigt af mængden af RBC-kontaminering kan der tilsættes 1-2 ml RBC lysisbuffer for at nedbryde RBC. Ved hjælp af den nuværende protokol, var vi i stand til at isolere 105 EECs fra seks rotte hjerter. Disse celler kunne seedet på en celle kultur parabol for yderligere ekspansion og karakterisering.
Ved klargøring af vævet til fri vægopsamling blev hjertet vasket med HBSS for at fjerne størstedelen af de resterende RBC'er. HBSS er det anbefalede medium på grund af dets klare udseende, som gør det muligt at rekvirere blodceller, i modsætning til DMED indeholdende fenolrød. Sammensætningen af fordøjelsesbufferen sikrer tilstrækkelig frigørelse af endotelceller, hvor liberase fordøjelsesenzym strimler væv af de eksponerede celler, DNase Jeg fjerner DNA fra de døde celler til at fremme celle løsrivelse, der kan hæmmes af DNA's klæbende kvalitet, HEPES buffer afbalancerer pH, og DMEM er en modificeret basal medium med en højere koncentration af aminosyrer og vitaminer for bedre celle vedligeholdelse og indeholder calcium er nødvendige for at aktivere liberase.
Ifølge enkeltcelleRNA-sekvenseringen (scRNA-seq) fra både human15 og musehjertet10blev der rapporteret flere markører, der tilskrives specifikke EF-populationer. Vi valgte nogle af de mest berigede gener til at undersøge renheden af isolerede EECs (dvs. Npr3, Cdh11, og Hapln1) og EECs (dvs. Mgll, Fabp4, og Cd36). I forhold til β-Actin, Npr3, Cdh11og Hapln1-markørerne viste øget udtryk i eECs sammenlignet med central- og østeuropæiske lande. På samme måde var udtrykket af Mgll-, Fabp4-og Cd36-markører større i central- og østeuropæiske lande sammenlignet med eIC'er. De entydigt udtrykte markører for hver prøve er i overensstemmelse med markører, der er karakteristiske for henholdsvis EEC'er og central- og østeuropæiske lande, hvilket indikerer vellykket isolation.
Den nuværende protokol kan imidlertid ikke udelukke krydskontaminering mellem de to EF-populationer under isoleringen, selv ikke med omhyggeligt kontrollerede sekventielle fordøjelser. Derfor kan nogle celleoverflademarkører anvendes til yderligere rensning. F.eks. mærker NPR3 generelt endokardiet10, mens APJ kan spore et flertal af central- og østeuropæiske lande16. Da disse to markører udtrykkes på celleoverfladen, kan de anvendes til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og antistoffer, der anvendes til yderligere at rense forskellige EF-populationer. Desuden kan human15 og mus10 hjerte scRNA-seq bekræfte berigelse af Npr3 i EECs, og Cd36 kan potentielt anvendes til CEC rensning.
Afslutningsvis skitserer den fremlagte protokol den uafhængige isolering af e-pc'er og central- og østeuropæiske lande fra rottehjertet. Den omfattende identifikation af cellulære egenskaber, aktiveret af celle isolation, kan udnyttes til betydelige downstream applikationer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne sætter stor pris på Dr. Lingli Wang for hendes hjælp med dyret protokol, og Department of Pediatrics på Stanford for infrastruktur støtte. Dette arbejde blev støttet af NIH/NHLBI K99 HL135258 (til M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
- Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
- Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
- Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
- Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
- Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
- Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
- Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
- Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
