Summary
हम पाचन बफर में अनुक्रमिक ऊतक पाचन के माध्यम से चूहे के दिलों से एंडोकार्डियल और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, आवर्ती अपकेंद्रित्र चक्रों से सेल संग्रह, और एंटी-रैट सीडी 31 माइक्रोमोतियों का उपयोग करके सेल शुद्धि।
Abstract
यह दिखाया गया है कि एंडोकार्डियल एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईईसी) और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाएं (सीईसी) मूल, विकास, मार्कर और कार्यों में भिन्न होती हैं। नतीजतन, ये दोनों सेल आबादी हृदय रोगों में अनूठी भूमिका निभाती है। अलग-थलग करने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं से जुड़े वर्तमान अध्ययन ईईसी और सीईसी दोनों से मिलकर सेल आबादी की जांच करते हैं। यह प्रोटोकॉल सेल-विशिष्ट लक्षण वर्णन के लिए इन दो सेल आबादी को स्वतंत्र रूप से अलग करने की एक विधि को रेखांकित करता है। बाएं और दाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार के संग्रह के बाद, बाहरी सतह और आंतरिक सतह से एंडोथेलियल कोशिकाओं को पाचन बफर समाधान का उपयोग करके अलग से मुक्त किया जाता है। बाहरी सतह के अनुक्रमिक पाचन और आंतरिक एंडोकार्डियल परत ने दो एंडोथेलियल सेल आबादी के अलगाव को बनाए रखा। प्रत्येक आबादी के लिए विशिष्ट मार्कर की पहचान के माध्यम से ईईसी और सीईसी के अलग अलगाव को और सत्यापित किया जाता है । माउस दिल में पहले से प्रकाशित एकल सेल आरएनए प्रोफाइलिंग के आधार पर, एनपीआर 3, हैप्लन1और सीडीएच11 जीन अभिव्यक्ति ईईसी के लिए अद्वितीय है; जबकि फैब4, एमजीएलऔर सीडी36 जीन अभिव्यक्ति सीईसीएस के लिए अद्वितीय है। क्यूपीसीआर डेटा ने अपने-अपने नमूनों में इन विशिष्ट मार्कर की समृद्ध अभिव्यक्ति का खुलासा किया, जो सफल ईईसी और सीईसी अलगाव का संकेत देता है, साथ ही सेल फेनोटाइप का रखरखाव, आगे सेल-विशिष्ट कार्यात्मक विश्लेषण को सक्षम करता है।
Introduction
यह लेख चूहे के दिलों से एंडोकार्डियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईईसी) और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) के विच्छेदन और बाद के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल (ग्लैडका एट अल1से संशोधित) प्रदान करता है। इन सेल आबादी की स्वतंत्र रूप से जांच करने की क्षमता हृदय रोगों की एक किस्म है कि संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में सेवा कर सकता अंतर्निहित सेल प्रकार विशिष्ट तंत्र की खोज सक्षम होगा । इन सेल आबादी के संग्रह के लिए स्वतंत्र रूप से एक सफल तरीका अभी तक प्रकाशित किया जाना है, लेकिन ।
सीईसीएस ईईसी से हृदय विकास और,रोग,,1,,2,23,4,5,6,,7के दौरान उनके मूल, मार्कर और कार्यों के संबंध में ईईसी से भिन्न होता है। ईईसी कार्डियक मेसोडरम3की वेंट्रल सतह से स्टेम करते हैं । वे VEGF और HIF सिग्नलिंग के जवाब में Flk1+ जनक कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं और विकासशील दिल के तीन असतत क्षेत्रों की अंतरतम परत बनाते हैं: एट्रियम, वेंट्रिकल, और पापनस नॉयसस3,,6। जेनेटिक वंश अनुरेखण से पता चलता है कि सिनोस वेनसस की प्लुरीशक्तिशाली एंडोकार्डियल कोशिकाएं वेष्म कोशिकाओं को प्राप्त करती हैं, जो सबपिकार्डियल लेयर3बनाने के लिए माइग्रेट होती हैं। इसके बाद, उपपिकार्डियल परत सीईसी सहित कोरोनरी धमनियों और नसों में अंतर करती है, जो परिधीय वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार3,,4के पार रहती है। एंडोथेलियल पाथवे के लिए यह एंडोकार्डियल VEGFC, ईला/एपीजे, और SOX17 सिग्नलिंग3,,4,,6,,8,,9द्वारा विनियमित है । वेंट्रिकुलर एंडोकार्डियम एक अज्ञात तंत्र द्वारा इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम के कम सीईसी प्राप्त करता है3। इसके बाद, ईईसी और सीईसी के बीच स्थानीयकृत विभेदन का सुझाव इन दो सेल आबादी के लिए विशिष्ट मार्कर द्वारा दिया जाता है, जिसमें एमजीएल, फैब4 और सीईसी में सीडी36 अभिव्यक्ति, या एनपीआर 3, सीडी11 और ईईसी3,5,5,10 में हैप्लन 1 अभिव्यक्तिशामिलहै।
ईईसी और सीईसी कार्डियक फंक्शन में अलग-अलग भूमिकानिभाते हैं। मेसेंचिमल संक्रमण, वाल्व गठन, कक्ष परिपक्वता, बहिर्वाह पथ विनियमन, और एट्रिवेनेट्रिकुलर नहर विकास ईईसी6पर आकस्मिक हैं। वैकल्पिक रूप से, सीईसीएस वासोमोटर टोन और कोरोनरी धमनियों11की सूजन में योगदान देते हैं। इन विचरण के परिणामस्वरूप रोग विकास4,12में व्यक्तिगत भूमिकाएं होती हैं . उदाहरण के लिए, सबूत ों से पता चलता है कि खराब होने से ईईसी जन्मजात वाल्व रोग6,नॉनकॉम्पक्शन मायोकार्डियम6,एट्रिओवेन्ट्रिकुलर सेप्टल इफेक्ट6,एंडोकार्डियल फाइब्रोलेस्टेरोसिस13,हाइपोप्लास्टिक लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम13,वेंट्रिकुलर हाइपोप्लासिया13और कार्डियक हाइपरट्रॉफी12हो सकता है । इसी तरह, अध्ययनों में पाया गया है कि असामान्य सीईसी कोरोनरी धमनी रोग14 और थ्रोम्बोसिस11में योगदान देते हैं ।
इन दो सेल आबादी के व्यापक ज्ञान को प्राप्त करने के लिए ईईसी और सीईसी का सफल अलगाव आवश्यक है, जिसका उपयोग अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में किया जा सकता है। इन सेल आबादी के विकास और भेदभाव कारकों का निर्धारण प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से एंडोथेलियल उपप्रकारों के भेदभाव के लिए एक संदर्भ प्रदान करेगा । इसके अलावा, ईईसी और सीईसी के विकास, विनियमन और कार्य में भिन्नताओं की पूरी पहचान कोशिका प्रकार-विशिष्ट तरीके से कई हृदय रोगों के लिए जिम्मेदार जीनोमिक और एपिजेनोमिक कारकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यह लेख स्वतंत्र रूप से ईईसी और सीईसी के सफल संग्रह के लिए कदमों की रूपरेखा तैयार करता है, और सेल प्रकार-विशिष्ट मार्कर के जीन अभिव्यक्ति स्तरों का आकलन करके अलगाव के सबूत प्रदान करता है।
Protocol
स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु देखभाल (APLAC31608) पर प्रशासनिक पैनल द्वारा सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई ।
1. बफ़र्स की तैयारी
- टेबल 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके पाचन बफर तैयार करें।
- DNase I स्टॉक समाधान तैयार करें: २,००० इकाइयों/mL (1 मिलीग्राम/mL) के एक शेयर समाधान के लिए RNase मुक्त पानी में DNase I भंग । अलीकोट करें और स्टॉक सॉल्यूशन को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- लिबरसे सॉल्यूशन तैयार करें: 5 मिलीग्राम/mL के स्टॉक समाधान के लिए RNase-मुक्त पानी के साथ लिबरेज़ को भंग करें। इसे 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रोलर बैंक पर घुमाएं। - अलीकोट करें और स्टॉक सॉल्यूशन को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ईटीए के 2 मीटर और बीएसए के 0.5% की अंतिम एकाग्रता के लिए 1x फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ 0.5 मीटर एथिलीनडायमिनेटेट्राटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) और 10% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) स्टॉक सॉल्यूशन को कमजोर करके छंटाई बफर तैयार करें।
2. हार्ट कलेक्शन
नोट: इस प्रोटोकॉल में 50-100 ग्राम वजनी छह स्प्राग डाले चूहों का उपयोग किया गया था। कोई लिंग अंतर नहीं देखा गया ।
- सीओ2 के साथ चूहे को इच्छामृत्यु दें और इसे विच्छेदन मंच पर एक सुपीन स्थिति में रखें। हाथ-पैरों को पिन करें और 70% इथेनॉल के साथ पेट और छाती दोनों को स्टरलाइज करें।
- कैंची के साथ पेट खोलें और आंतों के पीछे स्थित पीछे वेन कावा के हिस्से में 21 जी सुई डालें। सिरिंज प्लंजर वापस खींचो, नस से रक्त वापस लेने जब तक जिगर रंग में हल्का दिखाई देता है और कोई और अधिक रक्त वापस लिया जा सकता है, पर्याप्त रक्त हटाने का संकेत है ।
- कैंची का प्रयोग करते हुए फेफड़ों और दिल को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए छाती को सावधानी से खोलें। संदंश के साथ महाधमनी आर्क/एट्रियम उठाएं और दिल को आजाद कराने और हटाने के लिए महाधमनी धमनी, फेफड़े की नसें और वेना कावा काट लें ।
- अत्यधिक रक्त को हटाने के लिए ठंड 1x हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) बफर 3x के 50 मिलील के साथ दिल को धोएं।
- एक माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप के नीचे, सही वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार को 5 एमएल ट्यूब में हटा दें जिसमें डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम)(चित्रा 1A,बी)होते हैं।
- बाईं और दाईं ओर की पहचान करने के लिए अपनी चापलूसी, पीछे चेहरे पर दिल रखना।
- फेफड़े की धमनी का पता लगाएं, नसों और धमनियों के सबसे पूर्वकाल दिल के ऊपर से शाखाओं में बंटी और फेफड़े की धमनी के माध्यम से सही वेंट्रिकुलर कक्ष के लिए नीचे कटौती । दिल के पूर्वकाल चेहरे पर, शीर्ष तक पहुंचने तक पट के साथ काट ें। फेफड़े की धमनी और दाएं वेंट्रिकुलर चैंबर जंक्शन पॉइंट(चित्रा 1A)तक पट के साथ दिल के पीछे की ओर से शीर्ष से काटना जारी रखें।
- फेफड़े की धमनी और दाएं वेंट्रिकुलर जंक्शन पॉइंट से शुरू होकर, दिल के पूर्वकाल और पीछे की ओर दोनों को पिछले विच्छेदन और पट से दूर काट दें, जब तक कि सही वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार दिल के बाकी हिस्सों(चित्रा 1 बी)से मुक्त न हो जाए।
- माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप के नीचे, बाएं वेंट्रिकुलर फ्री वॉल को डीएमईएम युक्त 5 एमएल ट्यूब(चित्रा 1 C,D)में हटा दें।
- महाधमनी धमनी के पीछे दिल के ऊपर से शाखाओं में बंटी, महाधमनी का पता लगाएं, और बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार को काटने के लिए चरण 2.5 में वर्णित विधि को दोहराएं।
3. ईईसी पाचन
- दोनों सही और बाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार ऊतकों को 60 सेमी संस्कृति पकवान में रखें, जो आंतरिक सतह के साथ फ्लैट झूठ बोल रहे हैं, नीचे का सामना करना पड़ रहा है(चित्रा 2)।
नोट: भीतरी सतह थोड़ा अवतल आकार वेंट्रिकल का आंतरिक चेहरा है जैसा कि चित्रा 2ए,सीमें दिखाया गया है । - डिश में पाचन बफर का 0.5-1 mL जोड़ें, सीधे टिश्यू के नीचे पिपेट की नोक रखें। जब तक केवल भीतरी सतह डूबी न हो जाए तब तक जारी रखें।
- 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिन के लिए डिश इनक्यूबेट करें।
- पाचन को रोकने के लिए संस्कृति पकवान में ईसी माध्यम जोड़ें।
नोट: पाचन बफर की मात्रा को 1:5 अनुपात के रूप में ईसी माध्यम में रखें। - ईसी माध्यम के साथ वेंट्रिकल्स की आंतरिक सतह को फ्लश करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें और 40 मिमी छलनी(चित्रा 2E)के माध्यम से अपवाह को 50 मीटर संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। नीचे शुद्धि के लिए बर्फ पर संग्रह रखें।
4. सीईसी पाचन
- आंतरिक परत(चित्रा 2B,डी)से संदूषण के बिना बाईं वेंट्रिकल की बाहरी सतह के साथ कट और पाचन बफर के 1 mL युक्त एक अलग 5 mL ट्यूब में प्रत्येक जगह है ।
नोट: बाएं वेंट्रिकल को मोटा वेंट्रिकल के रूप में पहचाना जा सकता है, और बाहरी सतह को थोड़ा अवतल वेंट्रिकल के बाहरी चेहरे के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। - विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, वेंट्रिकुलर दीवार को छोटे, 1 मिमी3 टुकड़ों में कीमा करें।
- ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लगभग 15-20 डिग्री के लिए इनक्यूबेट करें। 2-3 मिन हर 2-3 मिन से भंवर।
- पाचन को समाप्त करने के लिए 5 mL ट्यूब में ईसी माध्यम के पिपेट 4 mL।
- एक 40 मिमी छलनी(चित्रा 2E)के माध्यम से एक 50 मीटर ट्यूब में 5 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ समाधान स्थानांतरित करें। नीचे शुद्धि के लिए बर्फ पर संग्रह रखें।
5. सेल संग्रह
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 न्यूनतम के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें और फिर सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
- यदि गोली लाल दिखाई देती है, तो 1x लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लिजिंग बफर(चित्रा 2F)के 1-2 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
नोट: यदि कोई आरडीसी नहीं हैं, तो 6 कदम आगे बढ़ें। - ट्यूबों को 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
- लिसिस को रोकने के लिए 50 मीटर ट्यूब में पीबीएस के 10 एमएल पिपेट।
- आरटी में 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें, और फिर सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
6. ईसी छंटाई
- छंटाई बफर के 90 μL और एंटी-सीडी 31 पीई एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन को 50 एमएल ट्यूबों में जोड़ें।
- ट्यूबों को भंवर करें और फिर उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में 10 मीटर के लिए इनक्यूबेट करें।
- ट्यूबों में छंटाई बफर के 10 mL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण है, और फिर आरटी में 10 min के लिए ३०० x ग्राम पर अपकेंद्री ।
- अधिनायक को एस्पिरेट करें और छंटाई बफर के 80 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें और एंटी-पीई माइक्रोमोतियों के 20 माइक्रोमोतियों को निलंबित करें।
- भंवर ट्यूब और 15 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- ट्यूबों में छंटाई बफर के 10 mL जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर उन्हें आरटी में 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
- अधिनायक को एस्पिरेट करें और छंटाई बफर के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें।
- सुपरपैरामैग्नेटिक क्षेत्रों वाले कॉलम को चुंबकीय विभाजक में रखें और 3 मीटर छंटाई बफर के साथ कॉलम को कुल्ला करें।
- कॉलम "फ्लो स्टॉप" होने के बाद, कॉलम में सेल निलंबन के 500 माइक्रोन को पिपेट करें और फिर कॉलम को सॉर्टिंग बफर के साथ धोएं। धोने 3x दोहराएं, प्रत्येक छंटाई बफर के 3 mL के साथ(चित्रा 2G)।
- विभाजक से कॉलम निकालें और उन्हें एक नया 15 mL संग्रह ट्यूब के शीर्ष पर रखें।
- एक पिपेट के साथ, कॉलम में ईसी माध्यम का 5 mL जोड़ें, और कॉलम प्लंजर का उपयोग करके समाधान को प्रेरित करें।
- आरटी में 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर संग्रह ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और फिर सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, किट का उपयोग करके ईईसी और सीईसी नमूनों की सेल पैलेट से आरएनए निकालें। आरएनए के न्यूनतम 500 एनजी प्राप्त किए जा सकते हैं।
नोट: आरएनए निष्कर्षण के बाद, नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - रिवर्स ट्रांसक्रिब 500 एनजी आरएनए के निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक यादृच्छिक प्राइमर और किट का उपयोग करके सीडीएनए प्राप्त करने के लिए।
- एंडोकार्डियल और एंडोथेलियल आबादी(चित्रा 2H)के सत्यापन के लिए मात्रात्मक पीसीआर करें। प्राइमर सीक्वेंस टेबल 2में सूचीबद्ध हैं ।
- 384 क्यूपीसीआर प्लेट के कुओं में ईईसी या सीईसी सीडीएनए (1 एनजी/माइक्रोन) के 5 माइक्रोन जोड़ें। ईईसी या सीईसी सीडीएनए को पर्याप्त कुओं में जोड़ें ताकि प्राइमर की प्रति संख्या में तीन कुएं हों।
- 2x क्यूपीसीआर एसवाईबीआर ग्रीन बफर के 6 माइक्रोन को मिलाएं जिसमें प्रत्येक 10 माइक्रोन प्राइमर के 0.5 माइक्रोन के साथ, जिसमें आगे और रिवर्स प्राइमर दोनों शामिल हैं, और उन्हें प्रत्येक उम्मीदवार जीन के अनुरूप एक अच्छी तरह से जोड़ें।
- आरटी पर 300 x ग्राम पर 1 मिन के लिए प्लास्टिक फिल्म और अपकेंद्रित्र के साथ थाली सील करें।
- प्लेट को क्यूपीसीआर मशीन में रखें और फिर 3 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रोग्राम शुरू करें, इसके बाद 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और फिर 60 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस। 45 चक्रों के लिए बाद के दो चरणों को दोहराएं।
Representative Results
ईईसी और सीईसी अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन चित्रा 2में किया गया है । ईईसी और सीईसी के सफल अलगाव का निर्धारण पैन-एंडोथेलियल सेल मार्कर की उपस्थिति का आकलन करके किया गया था, साथ ही दो उपप्रकार आबादी के लिए अलग थे। जैसा कि भविष्यवाणी की गई β-actinथी, क्यूपीसीआर ने खुलासा किया कि ईसीसी(चित्रा 3ए)की तुलना में ईईसी ने एंडोकार्डियल मार्कर एनपीआर 3, हैप्लन1 और सीडीएच11 के उच्च स्तर को व्यक्त किया है। इसी तरह, सीईसी ने ईईसी(चित्रा 3बी)की तुलना में कोरोनरी मार्कर फैब4, एमजीएलऔर सीडी36 के उच्च स्तर को व्यक्त किया। इसके अतिरिक्त, ईईसी और सीईसी दोनों ने पैन-ईसी मार्कर जीन Cdh5को व्यक्त किया, जिसमें सीईसी(चित्रा 3सी)में थोड़ा उच्च स्तर था।
चित्र 1: हृदय विच्छेदन का आरेख। (A)पहली कट पट से सही वेंट्रिकल मुक्त दीवार को अलग करने के लिए बनाया गया है । (ख)सही वेंट्रिकल को पूरी तरह से मुक्त करने के लिए बनाई गई दूसरी कट । (ग)बाएं वेंट्रिकल मुक्त दीवार को पट से अलग करने के लिए बनाया गया पहला कट। (D)बाएं वेंट्रिकल को पूरी तरह से मुक्त करने के लिए बनाया गया दूसरा कट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: पाचन का आरेख सीसी और ईईसी के सेट-अप और सेल छंटाई के लिए निम्नलिखित व्यवस्था। (A)अंतरतम मुक्त वेंट्रिकुलर दीवार और(B)सबसे बाहरी वेंट्रिकुलर मुक्त दीवारक्रमशःपाचन बफर या(डी)में डूबी हुई थी । (ई)सीडी31 एंटीबॉडी का उपयोग करके(एफ)रेड ब्लड सेल (आरबीसी) लाइसिस और(जी)चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई (एमएएस) के बाद सेल समाधानों का संग्रह और निस्पंदन । (ज)क्यूपीसीआर का उपयोग करजीन अभिव्यक्ति सत्यापन के लिए शुद्ध ईसीएस पर कार्रवाई की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: सीसी और ईईसी के अलगाव की पुष्टि करने वाला क्यूपीसीआर डेटा। (A)ईईसी मार्कर एनपीआर 3, सीडीएच11और ईईसी और सीईसी में हैप्लन1 के जीन अभिव्यक्ति स्तर ों को वास्तविक समय पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। (ख)ईईसी और सीईसी में सीईसी मार्कर एमजीएल, फैब4और सीडी36 के जीन अभिव्यक्ति स्तर ों को वास्तविक समय पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। (ग)पैन-ईसी मार्कर सीडीएच5 को वास्तविक समय पीसीआर द्वारा ईईसी और सीईसी में निर्धारित किया गया था। (n = 3 प्रत्येक समूह में) । बार मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं । * पी एंड एलटी; ०.०५, * * पी एंड एलटी; ०.०१ बनाम ईईसी, अनपेयर टी-टेस्ट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| तालिका 1. पाचन बफर (1.5 मिलीलीटर) | |||
| स्टॉक कांग्रेस। | अंतिम कांग्रेस । | आयतन | |
| लिबेरेज़ टीएम | 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर | 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर | 150 उल |
| डीएनएस मैं | 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर | 20 यूजी/एमएल | 30 उल |
| हेप्स | 1 एम | 10 एमएम | 15 उल |
| डीएमईएम | - | - | 1305 उल |
तालिका 1: पाचन बफर के लिए नुस्खा।
| तालिका 2। प्राइमर सीक्वेंस | ||
| जीन नाम | आगे | उल्टा |
| एनपीआर3 | TCCTTGCAATCATGTGGCCTA | GGAATCTTCCCGCAGCTCTCCC |
| सीडीएच11 | GTGAATGACTGACTGG | GTAATTTCTGGCCCTTGC |
| हैप्लन1 | CCAGCTAAGTGACTCGAAG | GGGCCATTCAGCTTGGATG |
| एमजीएल | CCCGGGGCCCAAAAGAC | GAAGATGAGGGCCTTGTGG |
| फैब4 | AGAAGTGGGAGTTCTCTCG | ACTCTCTGACCGGGGAA |
| सीडी36 | GCAAaaACGACTGCAGGTCAA | CCCGGTCACTTGGTTTCTGA |
| सीडी5 | CCATTGAGACAGACCCCGAC | TGTGGAACGTGTACTGCTGG |
| बी-ऐक्टिन | TCTGTGTGGATTGGCTC | सीजीजीACTकैटसीजीसीटीसीटीजीसी |
तालिका 2: प्राइमर सीक्वेंस
Discussion
सीईसीएस और ईईसी मूल, मार्कर और कार्यों में भिन्न होते हैं, और इस प्रकार विकास और रोग में अद्वितीय भूमिका निभा सकते हैं। एंडोथेलियल सेल अलगाव के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल मैक्रोवस्कुलर ऊतकों तक सीमित हैं, ईईसी के संग्रह की उपेक्षा करते हैं, इस प्रकार सीईसी और ईईसी-विशिष्ट कार्यों के अध्ययन को सीमित करते हैं। इन दोनों आबादी को स्वतंत्र रूप से अलग-थलग और अध्ययन करना आवश्यक है, क्योंकि यह ज्ञान भविष्य के अध्ययनों के लिए आईसीईसी और ईईसी में आईपीएससी के भेदभाव के लिए एक संदर्भ प्रदान करेगा और विभिन्न हृदय रोगों के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों के लिए इन कोशिका आबादी की जांच को सुगम बनाएगा । यह उपन्यास प्रोटोकॉल वयस्क चूहों की वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार की बाहरी सतह से आंतरिक सतह और सीईसीएस से ईईसी के अलगाव के लिए एक विधि तैयार करता है।
इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण के लिए समय को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। क्योंकि चूहे के दिल के ऊतकों में ईईसी की संख्या बहुत सीमित है, हमने सेलुलर क्षति को रोकने के लिए दिल की आंतरिक परत के पाचन समय को कम किया और अधिक महत्वपूर्ण बात, सीईसी संदूषण। एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए ईसी माध्यम समाधान के तत्काल अलावा उच्च सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए भी बहुत महत्वपूर्ण है। एक लाल गोली के बाद सेल संग्रह आरबीसी की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति का सुझाव देता है । आरबीसी संदूषण की मात्रा के आधार पर, आरबीसी लिसिस बफर के 1-2 mL को आरबीसी को नीचा दिखाने के लिए जोड़ा जा सकता है । कोशिकाओं को महत्वपूर्ण नुकसान से बचने के लिए इनक्यूबेशन को सावधानीपूर्वक समय पर जोड़ा जाना चाहिए, और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए पीबीएस को तुरंत जोड़ा जाता है । वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम छह चूहे के दिलों से 105 ईईसी को अलग करने में सक्षम थे। इन कोशिकाओं को आगे विस्तार और लक्षण वर्णन के लिए एक सेल संस्कृति पकवान पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है ।
मुफ्त दीवार संग्रह के लिए ऊतक तैयार करते समय, शेष आरडीसी के बहुमत को हटाने के लिए दिल को एचबीएसएस के साथ धोया गया था। एचबीएसएसएस अपनी स्पष्ट उपस्थिति के कारण अनुशंसित माध्यम है, जो फेनोल लाल युक्त डीएमईडी के विपरीत रक्त कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। पाचन बफर की संरचना एंडोथेलियल कोशिकाओं की पर्याप्त मुक्ति सुनिश्चित करती है, जहां लिबरेज पाचन एंजाइम उजागर कोशिकाओं के ऊतकों को स्ट्रिप्स करता है, DNase मैं मृत कोशिकाओं से डीएनए को समाप्त करता है ताकि डीएनए की चिपकने वाली गुणवत्ता से बाधित होने वाली कोशिका टुकड़ी को बढ़ावा दिया जा सके, HEPES बफर पीएच को संतुलित करता है, और डीएमईएम एक संशोधित बेसल माध्यम है जिसमें बेहतर सेल रखरखाव के लिए अमीनो एसिड और विटामिन की उच्च एकाग्रता होती है और इसमें लिबरेज को सक्रिय करने के लिए आवश्यक कैल्शियम होता है।
मानव15 और माउस हार्ट10दोनों से प्राप्त एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सीक्यू) के अनुसार, विशिष्ट ईसी आबादी के लिए जिम्मेदार कई मार्कर की सूचना दी गई थी। हमने अलग-थलग ईईसी (यानी एनपीआर3, सीडी11,और हैप्लन1)और ईईसी (यानी, एमजीएल, फैब4और सीडी36)की शुद्धता की जांच करने के लिए कुछ सबसे समृद्ध जीन का चयन किया। सीईसी कीतुलना में ईईसी मेंएक्सेलिन, एनपीआर 3, सीडीएच11और हैप्लन1 मार्कर के सापेक्ष वृद्धि अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। इसी तरह, ईईसी की तुलना में सीईसी में एमजीएल, फैब4और सीडी36 मार्कर की अभिव्यक्ति अधिक थी। प्रत्येक नमूने के लिए विशिष्ट रूप से व्यक्त किए गए मार्कर क्रमशः ईईसी और सीईसी के लिए विशेषता मार्कर के अनुसार है, जो सफल अलगाव का संकेत देता है।
हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल अलगाव के दौरान दो चुनाव आयोग की आबादी के बीच क्रॉस संदूषण से इंकार नहीं कर सकता, यहां तक कि सावधानी से नियंत्रित अनुक्रमिक पाचन के साथ। इसलिए, आगे शुद्धिकरण के लिए कुछ सेल सतह मार्कर लागू किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, एनपीआर 3 आम तौर पर एंडोकार्डियम10को लेबल करता है, जबकि एपीजे अधिकांश सीईसी16का पता लगा सकता है। क्योंकि इन दो मार्कर सेल की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं, वे फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एंटीबॉडी आगे अलग चुनाव आयोग आबादी को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया । इसके अलावा, मानव15 और माउस10 दिल स्क्रैना-सीक्यू ईईसी में एनपीआर 3 के संवर्धन की पुष्टि कर सकता है, और सीडी36 का संभावित रूप से सीईसी शुद्धिकरण के लिए उपयोग किया जा सकता है।
निष्कर्ष में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहे के दिल से EECs और CECs के स्वतंत्र अलगाव की रूपरेखा । सेल अलगाव द्वारा सक्षम सेलुलर गुणों की व्यापक पहचान, महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक पशु प्रोटोकॉल के साथ उसकी मदद के लिए डॉ Lingli वांग की बहुत सराहना करते हैं, और बुनियादी सुविधाओं के समर्थन के लिए स्टैनफोर्ड में बाल रोग विभाग । इस काम को एनआईएच/एनएचएलबीआई के99 एचएल135258 (एमजी) ने सपोर्ट किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
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