Summary
لم يتم بشكل كامل تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن البؤر الناجمة عن الإشعاع (RIF) من البروتينات الإصلاح عن طريق تلطيخ المناعة في خطوط خلايا سرطان القولون البشرية بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط.
Abstract
الغرض من المخطوطة هو توفير بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء المجهر المناعي لدراسة استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع الناجم عن شعاع النيوترون غاما المختلط المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). على وجه التحديد، يتم تطبيق المنهجية المقترحة للكشف عن تنشيط البروتينات إصلاح التي يمكن تصورها البؤر باستخدام الأجسام المضادة محددة لفواصل الحمض النووي مزدوجة حبلا (DNA-DSBs). تم تقييم بؤر إصلاح الحمض النووي عن طريق الفلوروسين المناعي في خلايا سرطان القولون (HCT-116) بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط. الحمض النووي DSBs هي الآفات الأكثر سمية جينية ويتم إصلاحها في خلايا الثدييات من خلال مسارين رئيسيين: مسار غير متماثل للانضمام النهائي (NHEJ) وإصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR). الترددات من بؤر, ملطّخة مناعيا, لعلامات شائعة الاستخدام في علم الأحياء الإشعاعية مثل γ-H2AX, 53BP1 ترتبط مع الحمض النووي DSB عدد وتعتبر علامات فعالة وحساسة لرصد تحريض وإصلاح الحمض النووي DSBs. وقد ثبت أن γ-H2AX تجمع البروتينات الإصلاح, مما يؤدي إلى تركيز أعلى من عوامل الإصلاح بالقرب من DSB. لرصد تلف الحمض النووي على المستوى الخلوي، تم التخطيط لتحليل الفلور المناعية لوجود الحمض النووي-PKcs ممثل إصلاح بؤر البروتين من مسار NHEJ و Rad52 من مسار HRR. لقد قمنا بتطوير وإدخال بروتوكول تلطيخ مناعة موثوق به للكشف عن استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع مع أجسام مضادة خاصة بعوامل الإصلاح من مسارات NHEJ و HRR وocioci التي يسببها الإشعاع (RIF). ويمكن استخدام المنهجية المقترحة في فحص بروتين الإصلاح الذي يتم تنشيطه بدرجة كبيرة في حالة إشعاع الشعاع المختلط النيوترون، مما يشير إلى هيمنة مسار الإصلاح.
Introduction
لم يتم تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT) بشكل كامل. يوفر هذا البروتوكول إجراءً تدريجيًا لتنفيذ الكشف عن البؤر المستحثة بالإشعاع (RIF) من البروتينات المُعدة عن طريق تلطيخ الفلورس المناعية، على سبيل المثال، في خط الخلايا السرطانية القولونية البشرية بعد التشعيع مع الشعاع المختلط النيوتروني.
الإشعاع المؤين (IR) يحفز العديد من أنواع مختلفة من الضرر الحمض النووي (الحمض النووي DSBs، الحمض النووي-SSBs، الحمض النووي الضرر قاعدة) من الذي فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا هي الآفات الحمض النووي الأكثر سمية جينية1. يمكن أن تؤدي الفواصل غير المُعاد إصلاحها إلى موت الخلايا، بينما تثير الفواصل التي تم إصلاحها بشكل خاطئ احتمال إعادة ترتيب الكروموسومات، ونشوء الطفرات، وفقدان المعلومات الوراثية الحاسمة. وتشمل مسارات الاستجابة للأضرار استجابة DSBs مسارات إصلاح الحمض النووي مثل الانضمام نهاية غير متجانسة (NHEJ)، وهي الآلية التي تتطلب كو 70/80، الحمض النووي PKcs، Xrcc4، والحمض النووي الرابع كعوامل رئيسية2،,3،,4،,5،,6. في الثدييات، المسار الرئيسي الثاني لإصلاح الحمض النووي هو مسار إصلاح إعادة التركيب المتجانس (HRR) الذي يتطلب مكونات رئيسية - عائلة جينات الغطاس Rad52 - Rad51 و Rad52 و Rad54 و Rad55 و Rad57 و Rad587. Rad51 و Rad54 هي عوامل إعادة الكومبين البشري الرئيسية المشاركة في آليات الإصلاح المتعلقة الإجهاد النسخ المتماثل وفواصل الحمض النووي في eukaryotes. ومن المثير للاهتمام، لوحظ أن الهابط من مسار HR يعزز مسار NHEJ الذي هو عرضة للخطأ مشيرا إلى أهمية مسار الموارد البشرية للاستقرار الجينوم8.
الخطوة الأولى من تشكيل DSBs هو الفوسفور من حجر الستون γ-H2AX في سير-139 بواسطة أتاكسيا تيلانجيكتاسيا تحور كيناز (ATM) من الأسرة كيناز PI37,8. ومن المثير للاهتمام، يمكن تصور الفوسفور H2AX بسهولة عن طريق تقنية مناعية الفلوروسكين كما foci (γ-H2AX بؤري) باستخدام الأجسام المضادة محددة لH2AX6الفوسفورية . هناك علاقة 1:1 بين عدد DSBs و γ-H2AX بؤر، لذلك، DSB علامة، γ-H2AX، ودرس على نطاق واسع من خلال توصيف تشكيل بؤر، وحجم، وكمية6،,7،,8،,9،,10،,11. تشكيل γ-H2AX بؤر يؤدي إلى تجنيد وتراكم الحمض النووي استجابة الضرر (DDR) البروتينات والعوامل المعدلة الكروماتين، مثل 53BP1 (p53 بروتين ملزمة 1)، MDC1 (وسيط نقطة تفتيش الضرر الحمض النووي)، BRCA1، Mre11/Rad50/Nbs1، PARP-1، والعديد من العوامل الأخرى إصلاح تشكيل عوامل أخرى من ذلك foci الناجمة عن الإشعاع (RIF). كل هذه البروتينات تشارك في التوطين مع γ-H2AX من خلال الربط المباشر أو غير المباشر1,11,12.
من المهم الكشف عن تلف الحمض النووي وإصلاح مع اختبار حساس السليم، وبالتالي، يتم إيلاء المزيد من الاهتمام لتطوير تقنيات دقيقة للغاية13. وفي سياق دراسات تلف الحمض النووي وإصلاحه، تعتبر المنهجية حاسمة بالنسبة للكشف الحساس عن تلف الحمض النووي الجيني، ووصف فئة الضرر، وتحديد كمية الضرر بالحمض النووي وآليات الإصلاح13. للكشف عن خلايا واحدة مع الحمض النووي التالفة، ويستخدم عادة في اختبار المذنبات الدراسات البيولوجية الإشعاعية14. تتعرف الطرق الخلوية الأخرى المتاحة على الانحرافات الكروموسومية، بما في ذلك الزخرف، والتوابل، والشظايا المركزية، والخواتم، والانحرافات من النوع الكروماتي، وتلف الكروموسومات بالنواة الدقيقة (Mn). الطريقة الأكثر استخداما في البيولوجيا الإشعاعية، وخاصة في قياس الجرعات البيولوجية، هو المقايسة الكروموسوم الزناة نظرا لخصوصيته العالية للإشعاع15. على سبيل المثال، لا يمكن أن يتعرف PCR، وهو أسلوب جزيئي كلاسيكي، على نوع تلف الحمض النووي المكتشف. في هذه الحالة، طرق المناعة تمرير مستوى الحساسية لأن ردود الفعل محددة بين المستضد والأجسام المضادة. يوفر التصوير المناعي للفلوريسين دليلاً مرئياً لظهور بروتينات مختلفة في بؤر مميزة استجابة لعوامل ضارة بالحمض النووي مثل الإشعاع المؤين16. ومع ذلك ، فإن مستويات التنشيط من الضرر وإصلاح البروتينات 'مرنا مستويات يمكن اكتشافها بسهولة عن طريق PCR في الوقت الحقيقي الذي هو وسيلة كمية مناسبة لمزيد من الدراسات الجزيئية في سياق الاستجابة لتلف الحمض النووي17.
مع الأخذ في الاعتبار أن γ-H2AX بؤر جذب عوامل الإصلاح18، لرصد تلف الحمض النووي وإصلاح على المستوى الخلوي ، قمنا بتطوير إجراء تلطيخ المناعة موثوقة ، استنادا إلى تحليل بؤر البروتين إصلاح ممثل من مسار NHEJ (الحمض النووي - PKcs) و Rad52 من مسار HRR.
هنا، نقترح استخدام المناعي لهذه البروتينات باعتبارها الإجراء الفعال والحساس لرصد الحمض النووي-DSB التعريفي وإصلاح. حتى الآن، لم تكن هناك بيانات متوفرة عن الحمض النووي DSBs على أساس بؤر البروتينات إصلاح على المستوى الخلوي بعد النيوترونات شعاع مختلط تشعيع لBNCT، باستثناء γ-H2AX و 53BP1 علامات19. نقترح تكييف خط خلايا سرطان القولون HCT-116، كما هو غني في نفسه في بؤر DSBs، كخط خلية قياسي لتحليل تلف الحمض النووي، لأن RIFs يمكن اكتشافها بسهولة. هذا الخط الخلية المنضمة من السهل الحفاظ على ومناسبة لإجراءات التشعيع. ويستند الإجراء المقترح على كمية كبيرة من الدراسات السابقة المتعلقة بإجراء المناعة العامة من تلطيخ γ-H2AX. ومع ذلك، فإنه يتضمن جميع التفاصيل المتعلقة باختيار الأجسام المضادة المناسبة مع التخفيفات اختبار لكل بروتين ممثل تنتمي إلى كل مسار إصلاح. وعلاوة على ذلك، فإنه يصف استخدام شعاع فريد من نوعه النيوترون مختلطة المستخدمة في العلاج BNCT. ومع ذلك، نوصي بتوسيع الدراسات مع كلا الأسلوبين، مناعية تلطيخ أولا ثم، مع تحليل الجزيئية عالية التكلفة كما أجريت سابقا4،17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- إعداد ثقافة الخلية والإعداد التجريبي
- الحفاظ على خلايا سرطان القولون البشري، HCT-116 كما أوصى المورد، في monolayers في 75 سم2 قارورة الثقافة التي تحتوي على 10 مل من مكوي مقو 5A المتوسطة المعدلة، وتستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنينية و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية المضادة للمضادات الحيوية.
- تنمو الخلايا في بيئة مرطبة CO2 5% عند 37 درجة مئوية حتى 70% من الالتقاء مع تجديد متوسط كل 2 إلى 3 أيام.
- للحصول على شعاع BNCT (على سبيل المثال، شعاع النيوترون زائد 10BPA) وتأثير BNCT لقتل الخلايا السرطانية كجزيئات ثقيلة و تودع معظم طاقتها داخل الخلايا السرطانية المحتوية على البورون، في اليوم السابق للإشعاع، إضافة عامل توصيل البورون إلى متوسطة ثقافة الخلية – على سبيل المثال، 10BPA، 4-Borono-L-الفينيل ألانين (10 ميكروغرام 10B/mL، 0.925 mM النهائي) 12-16 ح (امتصاص الحد الأقصى من البورون) قبل التشعيع، كما سبق أن درست لخلايا سرطان القولون والخلايا السرطانية الغدة الدرقية20،21.
ملاحظة: إذا كان استخدام خط خلية آخر، والتي لا توجد بيانات في حالة دراسة BNCT، اختبار امتصاص البورون لكل خط خلية للحصول على التركيز الأمثل البورون. قياس امتصاص 10BPA الخلوية بواسطة المنظار الطيفي الانبعاثات البصرية البلازما مقرونة بشكل حثائي (ICP-OES) كما يؤديها Dagrosa المجموعة21. - بعد 12-16 ساعة من تسليم البورون، التعرق المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل من 1X PBS. ثم trypsinize الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من تريبسين EDTA حل للخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية لتعزيز مفرزة الخلية. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال، أوقف إجراء التربسين بإضافة 10 مل من المتوسط الكامل.
- استلهم تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 0.4٪ trypan الأزرق إلى 10 ميكرولتر من الخلايا، ومزيج، وling 10 ميكرولتر على شريحة العد. تخفيف تعليق الخلية إلى تركيز 1 × 106 الخلايا / مل من المتوسطة. Aliquot 1 مل من تعليق الخلية لكل اكريتوب.
- إعداد الجرعات الحرارية (TLDs) لقياس جرعات أشعة غاما ورقائق الذهب لفلوناترونوز وإرفاق TLDs إلى الأنابيب المبردة أو قارورة زراعة الخلايا قبل التشعيع.
- تشع أشعة 1 × 106 خلايا/مل مع شعاع النيوترون المختلط عند الحد الأدنى الموصى به من تدفق النيوترونات الحرارية 5.9 × 1011 (n/cm-2 min−1)4 في قارورة الاستزراع أو الأنابيب المبردة حسب قدرات المنشأة.
ملاحظة: قم بإعداد وقت التشعيع من قبل للحصول على تدفق النيوترونات الموصى به. - بعد التشعيع، البذور 1 مل من الخلايا المشععة (1 × 106 خلايا / مل) على 22 × 22 ملم يغطي في 35 ملم أطباق بيتري أو 6 لوحات جيدا، تكملة مع 2 مل من المتوسطة المطلوبة. احتضان الخلايا لمدة أقصاها 3 ساعات عند 37 درجة مئوية في بيئة5٪ CO 2 المرطبة للسماح لهم بالتصاق الأغطية. مراقبة مرفق الخلايا من وقت لآخر تحت مجهر مقلوب مع هدف 20x.
ملاحظة: بالنسبة لHCT-116 كثافة الخلايا الدنيا هو 600,000 الخلايا إلى البذور. للحصول على مزيد من إجراءات تلطيخ سريعة استخدام الشرائح الغرفة، والحد من كثافة الخلية وفقا لذلك.
2. تثبيت الخلايا
- بعد التشعيع واحتضان الخلايا، وإزالة المتوسطة من الخلايا المرفقة وغسل الخلايا مرة واحدة مع 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- قم بإصلاح الخلايا بـ 1 مل من 70% من الإيثانول لمدة 10 دقائق في RT.
ملاحظة: بدلاً من ذلك استخدم 1٪ -3.7٪ شبهformaldehyde (PFA) للتهييب كما هو موصى به سابقا19. تم إيقاف البروتوكول هنا. تخزين الخلايا الثابتة في الإيثانول في الثلاجة في -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن بضعة أسابيع لمزيد من التحليل وتلطيخ المناعة.
3. Permeabilization الخلايا
- بعد التثبيت إزالة الإيثانول من طبق بيتري وغسل مع 2.5 مل من 1X برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: لا تدع الخلايا تجف بين خطوات الشطف. - أضف 1 مل برفق من 0.2٪ من Triton X-100/PBS لتغطية الأغطية بالخلايا في أطباق بيتري.
- احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
- غسل الخلايا 3x مع 2.5 مل من 1X PBS.
ملاحظة: زيادة النسبة المئوية من Triton X-100 في برنامج تلفزيوني حتى 0.5% إذا لزم الأمر (أكثر قابلية للكشف عن بؤر، تعتمد على خط الخلية اختبار). إجراء غسل إضافية مع PBST (PBS مع 0.5٪ توين) لتجنب الربط غير محدد. - كتلة permeabilization الخطوة مع 1 مل من 2٪ BSA (البقري المصل كسر الخامس الألبومين) المخفف في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة لا تقل عن 30 دقيقة أو 1 ساعة مع 1٪ BSA.
ملاحظة: يمكن حذف هذه الخطوة وهي تعتمد على نوع الأجسام المضادة المستخدمة. بدلا من ذلك، استخدم 5٪ FBS كما هو موصى به في المرجع4.
4. وصمة المناعة
- إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأولية (المضادة ɣ-H2AX، المضادة للحمض النووي- PKcs، ومضاد-Rad52) المخفف في برنامج تلفزيوني مع BSA (2٪ الكسر المصل البقري الخامس الألبومين) على النحو الموصى به (انظر الجدول 1 مع التخفيفات الموصى بها) (100 ميكرولتر مطلوب لكل عينة).
| الأجسام المضادة الأولية | وظيفه | التخفيف الموصى به | التخزين [°C] |
| مكافحة ɣ-H2AX | الكشف عن الحمض النووي DSBs | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| المضادة للحمض النووي-PKcs | الكشف عن RIFs من البروتين DNA-PKcs التي تنتمي إلى NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| مضاد لراد52 | الكشف عن RIFs من Rad52 البروتين التي تنتمي إلى HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| جسم مضاد ثانوي | في الظلام | ||
| مكافحة الماوس IgG FITC | ɣ-H2AX بؤرة | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| الماعز المضادة للأرانب IgG H&L (اليكسا فلور 488) | لNHEJ و HRR إصلاح البروتينات foci | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
الجدول 1: التخفيفات والملاحظات الموصى بها لاستخدام الأجسام المضادة المستخدمة في القسم 4.
- غطي الطبق بيتري للحفاظ على الرطوبة في صندوق بلاستيكي مع اللجنين المرطب باستخدام الماء المقطر واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن إجراء حضانة في 4 درجة مئوية لليلة واحدة. - بعد الحضانة أداء 3 يغسل مع 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: لا تسمح للشريحة بالجفاف أثناء خطوات الشطف. - إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للماوس IgG FITC، الماعز المضادة للأرانب IgG (اليكسا فلور 488) المخفف في برنامج تلفزيوني مع BSA (انظر الجدول 1) (100 μL مطلوب لكل عينة). لهذا والخطوات التالية تعمل في الظلام.
- غطي طبق بيتري مرة أخرى للحفاظ على الرطوبة في صندوق بلاستيكي مع اللجنين المرطب واحتضان لمدة 30 دقيقة كحد أدنى عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
- بعد الحضانة أداء 3 يغسل مع 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 100 ميكرولتر من DAPI المخفف في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 1 ميكروغرام / مل لمضادة للنية.
- احتضان قريبا، لمدة أقصاها 2 دقيقة في RT.
- بعد الحضانة أداء 3 يغسل مع 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني ووضع بلطف غطاء على الجزء العلوي من المتوسطة المتصاعدة، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء وحافات ختم من الأغطية مع طلاء الأظافر. الانتظار حتى الورنيش سوف يجف وطلاء غطاء حولها.
- انتظر تصلب المتوسطة المتصاعدة (حتى 3 ساعات) قبل تحليل الصورة تحت المجهر الفلوري.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تخزين الشرائح الزجاجية في مربع من البلاستيك في 4 °C في الظلام.
5 - الحصول على الصور وتحليلها
- الحصول على الصور مع المجهر الفلوريسنس تحت الهدف 100x مع زيت الغمر.
- تحليل البؤر في النوى مع المجهر الفلوري مجهزة المرشحات التالية ل: اليكسا فلور 488: الإثارة/الانبعاث (نانومتر): 496/519، لون الانبعاثات الأخضر؛ DAPI: الإثارة/الانبعاثات (نانومتر): 358/461، لون الانبعاثات الأزرق.
ملاحظة: قد يتطلب تحليل DSBs على طول مسارات الجسيمات المفردة مجهرية متقدمة مثل المجهر المسح الضوئي بالليزر confocal بدقة أعلى.
- تحليل البؤر في النوى مع المجهر الفلوري مجهزة المرشحات التالية ل: اليكسا فلور 488: الإثارة/الانبعاث (نانومتر): 496/519، لون الانبعاثات الأخضر؛ DAPI: الإثارة/الانبعاثات (نانومتر): 358/461، لون الانبعاثات الأزرق.
- حفظ الصور المكتسبة وعملية مع برامج التصوير المناسبة على سبيل المثال، ImageJ أو صورة برو3،20.
ملاحظة: يوصى باستخدام وحدات الماكرو الفردية والمكونات الإضافية التي تم تطويرها للتحليل التلقائي أو التطوير/الشراء لبرامج المعلوماتية الحيوية الفردية. - إذا كان استخدام برنامج Image-Pro لتحليل البؤر، معالجة الصور في ملفات TIFF: حدد زر العدد/الحجم، ثم انقر فوق أنواع [اختر نوع القياس (على سبيل المثال، القطر أو المنطقة))، انقر فوق نطاقات [مجموعة نطاق القياسات]، انقر فوق كائنات تقسيم إذا لزم الأمر. لضبط السطوع، انقر فوق Bright [ضبط treshold]. ثم انقر فوق عد [الزر الأحمر].
- لتصدير البيانات، انقر على جدول البيانات | إحصائيات | التصدير إلى Excel. في برنامج جدول البيانات، رسم الرسوم البيانية مع التحليل الإحصائي المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أولا، قمنا بتحليل علامة قياسية للكشف عن الحمض النووي DSBs، γH2AX بؤر في خلايا سرطان القولون، غير مشع، وتشع مع شعاع النيوترون مختلطة. تظهر البؤرة الفلورية المتميزة في شكل γ-H2AX وتظهر تكوين الحمض النووي DSBs (حيث أن كل نقطة فلورية من نوع γ-H2AX تمثل DSB مفردة) (انظر الشكل 1).
الشكل 1: صور تمثيلية لأنماط بؤرية γ-H2AX في الخلايا السرطانية للكولون في خط الخلايا HCT-116 (بدون إشعاع) وبعد تشعيع الشعاع المختلط بالنيوترونات. تم إجراء تشعيع شعاع النيوترونات المختلطة بجرعة 2.6 Gy في الخلايا المعالجة في اليوم السابق مع BPA (N + BPA). (أ)تمثل اللوحة اليسرى تلطيخ الـ DAPI للنيات. اللوحة اليمنى، البؤر الخضراء (اليكسا 488)، يتوافق مع المناعة من γ-H2AX. يشير السهم الأصفر إلى مسار α-الجسيمات التي تعبر النواة (شريط المقياس = 10 ميكرومتر). (B) الرسوم البيانية التمثيلية التي توضح الزيادة الملحوظة في حجم البؤر المستحثة بالراديو. تم تنفيذ متوسط القطر γ-H2AX تلقائيا من قبل برنامج Image-Pro. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ومن المثير للاهتمام، في الخلايا المشعة مع شعاع النيوترون مختلطة (N + BPA) بجرعة من حوالي 2.6 غي (1،33 غي (γ) + 1،26 غي (N))، لاحظنا مستويات أعلى القطر من γ-H2AX foci(الشكل 1B). وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن مسار واحد من ارتفاع LET α الجسيمات (بسبب تفاعل BNCT النووي) عبور نواة الخلية (السهم الأصفر) (الشكل 1A). أنواع مختلفة من الإشعاع يمكن أن يسبب تأثيرات مختلفة: ارتفاع الإشعاع LET، وأكثر تعقيدا الحمض النووي DSBs، كلما كانت أكبر من البؤر γ-H2AX ومستويات أعلى من إصلاح البروتينات مرئية كما البؤر الناجمة عن الإشعاع18.
ولذلك، اختبرنا مستويات من البروتينات إصلاح تمثيلية من الحمض النووي-PKcs (من مسار إصلاح NHEJ) و Rad52 (من مسار الموارد البشرية) عن طريق المجهر immunofluorescence في نفس الظروف، والتي لم يتم إجراؤها من قبل في حالة شعاع BNCT. كنا قادرين على الكشف عن القيمة المتوسطة العالية لقطر البؤر من الحمض النووي PKcs في فواصل الحمض النووي بعد النيوترون مختلطة بالمقارنة مع خلايا التحكم (لا إشعاع) (انظر الشكل 2).
الشكل 2: صور تمثيلية لأنماط الحمض النووي-PKcs و Rad52 إصلاح بؤر في الخلايا السرطانية القولون من خط الخلايا HCT-116 (دون إشعاع) وبعد الشعاع النيوترونية المختلطة شعاع. تم إجراء تشعيع شعاع النيوترونات المختلطة بجرعة 2.6 Gy في الخلايا المعالجة في اليوم السابق مع BPA (N + BPA). (أ)تمثل اللوحة اليسرى تلطيخ الـ DAPI للنيات. وتمثل اللوحة الوسطى الكشف عن البؤر التي يسببها الإشعاع. اللوحة اليمنى هي الصورة المدمجة. (B) الرسوم البيانية التمثيلية التي توضح الزيادة الملحوظة في حجم البؤر المستحثة بالراديو. تم تنفيذ متوسط Rad52 وDNA-PKcs القطر البؤري تلقائيا باستخدام برنامج تحليل الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في هذه الحالة، لاحظنا أن الحمض النووي-DSBs متفاوت المسافات في خلايا HCT-116 المشععة بواسطة الشعاع النيوتروني المختلط حيث أن الحمض النووي متعدد الكلور (DNA-PKcs) محدد لـ أكثر تعقّدة. في الخلايا المشعة، بواسطة شعاع النيوترونات المختلطة، لوحظت هذه البؤر فقط داخل نواة الخلية باعتبارها أكثر تعقيدا، أكبر، ومتجمعة مع كثافة أعلى(الشكل 2A، B). وفي حالة Rad52، لم يكن التأثير قوياً كما هو الحال بالنسبة للحمض النووي النووي -PKcs الذي يشير إلى هيمنة مسار NHEJ في هذا النوع من الإشعاع. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى البيانات الأدبية، DSBs معقدة يتم إصلاح ببطء ويتم تجنيد الحمض النووي PKcs فقط إلى DSBs معقدة أطول عمرا مما يدل على أن شعاع النيوترونات المختلطة يؤدي إلى تشكيل DSBs معقدة وإصلاح من خلال الحمض النووي PKcs، ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث على المستوى الجزيئي لتأكيد هذه النتائج التي تم الحصول عليها سابقا22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ترددات بؤر، الملطخة مناعيا ل γ-H2AX و 53BP1 تستخدم عادة في البيولوجيا الإشعاعية وترتبط مع عدد الحمض النووي DSB وتعتبر علامات فعالة وحساسة لرصد تحريض وإصلاح الحمض النووي DSBs19. إن إجراء التلطيخ المشترك للـ γ-H2AX و 53BP1 هو إجراء قياسي للكشف عن الحمض النووي DSBs. ويرتبط تشكيل γ-H2AX مع توظيف 53BP1، وهو منظم للاستجابة لتلف الحمض النووي23. ومع ذلك، قد تختلف خطوط الخلايا المختلفة في مستويات الخلفية من γ-H2AX /53BP1 foci 11. وقد تبين أن γ-H2AX بؤر جذب عوامل الإصلاح18, تراكم تركيز أعلى من البروتينات إصلاح قريبة من موقع DSB. أكثر تعقيدا الحمض النووي DSBs، كلما كان أكبر في γ-H2AX بؤرية وأعلى مستويات البروتينات إصلاح. فهو ينشط سلسلة من مسارات الإصلاح، وإذا كانت عوامل الإصلاح تتراكم في تركيز أعلى في موقع DSB، فإنها يمكن اكتشافها بسهولة باستخدام أجسام مضادة محددة ويسمح البروتوكول المقترح بتصورها بسهولة. هنا نبرهن على منهجية لدراسة الآثار البيولوجية على المستوى الخلوي للعلاج BNCT تأثير شعاع النيوترونات المختلطة على إصلاح الحمض النووي باستخدام تقنية المناعة في خلايا سرطان القولون البشري. طور المؤلفون وأدخلوا وأدخلوا بروتوكولًا موثوقًا به خطوة بخطوة مع أجسام مضادة محددة للكشف عن مسارات إصلاح الحمض النووي استنادًا إلى تلطيخ مناعي مع جسم مضاد محدد لعوامل الإصلاح من مسار NHEJ و HRR وocioci المستحث بالإشعاع (RIF). وعلاوة على ذلك، يقترح المؤلفون استخدام خط الخلايا السرطانية القولون HCT-116 كخط خلية قياسية لتحليل تلف الحمض النووي وكخط خلية تحكم لاختبار الأجسام المضادة لإصلاح الحمض النووي لأن هذا الخط الخلية هو نفسه غني في DSBs بؤر. الحمض النووي DSBs يمكن اكتشافها بسهولة، وخطوط الخلايا المختلفة، وخاصة الخلايا السرطانية مثل خط عنق الرحم خلية تمثل مستويات خلفية مختلفة من بؤر H2AX، وكثافة24.
هناك خطوتان رئيسيتان حاسمتان في البروتوكول، تثبيت الخلايا، وإجراء الكبت المناعي. يوصي المؤلفون تثبيت الخلايا في الإيثانول 70٪ لأنه يحافظ على الخلايا لفترة طويلة ، ويتم احتضانه في الفريزر لا يزيد عن بضعة أسابيع. كما أن هذه الخطوة بالغة الأهمية لأن هذه النقطة يمكن أن تكون وقفة بعد إجراء التشعيع، مثلاً، في مؤسسة/بناء أخرى/يوم آخر. خطوة أخرى حاسمة هي التركيز السليم للجسم المضاد. وقد أرفق المؤلفون في الجدول التركيزات المختبرة للأجسام المضادة الأولية والثانوية.
الإجراء المقدم يوفر بروتوكول خطوة بخطوة للحصول على نتائج موثوقة، ومع ذلك، يمكن لبعض المعلمات تغيير نتائج التجارب، مثل الاختيار الصحيح للأجسام المضادة المستخدمة، والكواشف المختلفة المستخدمة في خطوات التثبيت والنفاذ، والوقت من الحضانة، والنسبة المئوية الحرجة من الكواشف، والخطوات الغسيل، والعمل في الظلام، والمجهر الفلورسنت السليم. يشرح المؤلفون كيفية الحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في الملاحظات.
ومن القيود الطفيفة على هذه التقنية الوصول إلى مصدر الإشعاع مثل مصدر النيوترون، ومع ذلك، يمكن استخدام البروتوكول كمكاتون عام للكشف عن مسارات إصلاح الحمض النووي التي تم الحصول عليها بعد أنواع مختلفة من الإشعاع ويمكن التعامل معها على أنها بروتوكول عالمي لأنواع مختلفة من الإشعاع على سبيل المثال، مقارنة تنشيط مسارات إصلاح الإشعاعات منخفضة التس.بي وعالية LET.
نحن نقدم منهجية عالمية جاهزة للاستخدام يمكن استخدامها على المستوى الخلوي لتحليل الآثار البيولوجية في سياق العلاج BNCT. في BNCT، البورون غير المشع-10 (على سبيل المثال، بعد العلاج مع 4-بورونو-L-فينيلالالينين، BPA - عامل توصيل البورون) يتم إشعاعها مع النيوترونات الحرارية منخفضة الطاقة ونتيجة لجزيئات التفاعل النووي ألفا ونيوية ليثيوم-7 مع ارتفاع LET يتم إنتاج25،,26. لذلك، يمكن أن يكون بروتوكولنا مفيداً لتحليل التأثيرات البيولوجية على المستوى الخلوي أيضاً للإشعاعات التي تمثلها الحزم الأخرى العالية مثل البروتونات المستخدمة في العلاج بأشعة البروتونات27،والأيونات الكربونية المستخدمة في العلاج بالهادرون28. وقد لاحظنا أن هناك حاجة إلى إجراء المزيد من البحوث التفصيلية في مجال الإشعاع عالي LET والحزم المختلطة، والمعرفة بعملية إصلاح الحمض النووي مطلوبة لتطوير علاجات فعالة لمكافحة السرطان، ولذلك، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح بالبحث عن استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع التي يتم تنشيطها من قبل الحزمة المختلطة النيوترونية. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة الفلوروسين المناعية للكشف عن استجابة تلف الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي يمكن أن تكون طريقة محتملة لتقييم وكشف الأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وتم الحصول على الشعاع النيوتروني المختلط المكون من إشعاع النيوترون/غاما من مفاعل ماريا للبحوث في المركز الوطني للبحوث النووية في بولندا. 11- وقد تلقى المركز الوطني للعلوم في بولندا (Miniatura 2) دعماً من المركز الوطني للعلوم( منحة رقم #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , Springer. Tokyo. 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M.
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , geaa011 (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), Basel. 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), Basel. 66 (2017).
