Summary
여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.
Abstract
리보솜 프로파일링 기법(RIBO-seq)은 현재 생체 내에서단백질 합성 과정을 연구하는 가장 효과적인 도구이다. 이 방법의 장점은 다른 접근법과 비교하여 mRNA 성적 증명서에서 리보솜의 위치와 수를 정확하게 매핑하여 번역을 모니터링할 수 있다는 것입니다.
본 기사에서는 실험의 계획 및 실행과 관련된 세부 사항을 강조하여 박테리아에서 RIBO-seq 방법에 대한 샘플 수집 및 준비의 연속 단계를 설명합니다.
RIBO-seq는 그대로 리보솜 및 관련 mRNAs에 의존하기 때문에, 중요한 단계는 번역의 급속한 억제 및 세포의 적당한 붕괴입니다. 따라서, 우리는 박테리아에서 번역을 체포하는 클로람페니콜과 선택적 전처리와 함께 세포 수확을위한 액체 질소에 여과 및 플래시 동결을 제안한다. 붕괴를 위해, 우리는 기계적으로 세포 벽을 방해하기 위해 알루미늄 산화물의 존재에 박격포와 유봉냉동 세포를 분쇄 제안한다. 이 프로토콜에서, 자당 쿠션 또는 단량 정화를 위한 자당 그라데이션 초원심분리가 필요하지 않다. 대신, 폴리아크릴아미드 겔 전기포고증(PAGE)을 이용한 mRNA 분리가 리보소탈 발자국 절제(28-30 nt band)를 적용하고 만족스러운 결과를 제공한다. 이렇게 하면 메서드가 크게 간소화될 뿐만 아니라 절차에 대한 시간과 장비 요구 사항을 줄일 수 있습니다. 도서관 준비를 위해, 우리는 최적화의 어느 정도 제조 업체의 지침에 따라, 뉴 잉글랜드 생물 연구소에서 일루미나 염기서열에 대한 상업적으로 사용할 수있는 작은 RNA 키트를 사용하는 것이 좋습니다.
생성된 cDNA 라이브러리는 차세대 시퀀싱(NGS)에 필요한 적절한 수량과 품질을 제공합니다. 설명된 프로토콜에 따라 제조된 라이브러리의 시퀀싱은 샘플당 2~10mln고유매핑된 판독으로 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 제공한다. 우리가 제시하는 프로토콜은 빠르고 상대적으로 쉬우며 표준 실험실 장비로 수행 할 수 있습니다.
Introduction
리보솜 프로파일링 기법 (RIBO-seq)은 캘리포니아 대학, 샌프란시스코1의조나단 바이스만의 실험실에서 개발되었다. 번역 수준에서 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 다른 방법과 비교하여, RIBO-seq는 mRNA에 각각의 리보솜 결합에 초점을 맞추고 성적 증명서에 리보솜의 위치와 상대적 수에 대한 정보를 제공합니다. 생체 내에서 단백질 합성 공정을 모니터링할 수 있으며 단일 코돈 분해능 및 정확도를 제공하여 개별 mRNA 및 세포 내 전체 전사체를 따라 리보솜 밀도를 측정할 수 있습니다. RIBO-seq 기술의 기초에 리보솜은 mRNA 분자를 결합하고 따라서 ribonuclease 소화에서 녹취록의 매장 된 조각을 보호한다는 사실을 거짓말. 리보나클로스를 첨가하면 보호되지 않은 mRNA가 소화되고 리보솜에 의해 동봉된 파편(일반적으로 ~28-30nt 길이)은 그대로 유지됩니다. 리보솜 발자국(RF)이라고 불리는 이러한 조각들은 리보솜의 정확한 위치를 감지하여 유래한 녹취록에 격리, 시퀀스 및 매핑될 수 있다. 실제로, mRNA 단편을 보호하는 리보솜 능력은 리보솜 결합 및 번역 개시 사이트(TIS)2,3,4를연구하기 위해 1960년대부터 사용되어 왔다. 그러나, 심층시퀀싱 기술의 발전과 함께, RIBO-seq는 번역모니터링을 위한 금 본위제가 되어 있으며, 이는 리보솜 교전을 통해 단백질 합성6에대한 게놈 차원의 정보를 제공할 수 있다. 리보솜 프로파일링은 전사와 프로테오메6을정량화하는 사이에 존재하는 기술적 격차를 채웠다.
리보솜 프로파일링을 수행하려면 조사 된 조건하에서 성장 한 유기체의 세포 리세이트를 얻어야합니다. 세포 수집 및 lysis 동안 이러한 조건을 방해하는 것은 신뢰할 수없는 데이터를 제공 할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 번역 억제제, 액체 질소의 신속한 수확 및 플래시 동결이 일반적으로 사용됩니다. 세포는 믹서 밀7,8 또는 비드 비터9와같은 기계적 균질화로 극저온 연삭에 의해 용해될 수 있으며, 파이펫 10을 통해 또는바늘(11)을통해 트리튜션에 의해 서두를 수 있다. 리시스 버퍼는 세포의 분쇄 직전 또는 직후에 추가할 수 있습니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 모르타르와 유봉을 미리 냉각하기 위해 액체 질소뿐만 아니라 알루미늄 산화물을 세균 세포 벽의 중단에 대한 부드러운 접근 법으로 사용하며, 이는 소화와 같은 방법이 적용될 때 종종 발생하는 RNA 전단을 방지합니다. 분쇄 후, 우리는 박격포의 냉각 된 내용물으로 얼음 차가운 용해 버퍼를 추가합니다. 리보소말 발자국의 최상의 해상도를 얻는 데 적합한 용해 버퍼를 선택하는 것이 중요합니다. 이온 강도는 RF 크기와 판독 프레임 정밀도 모두에 영향을 미치기 때문에, 버퍼 조성이 mRNA11,12에리보소피 점유에 영향을 미치지 않는 것으로 나타나더라도, 현재 낮은 이온 강도 및 버퍼 용량을 가진 용해 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 리시스 완충제의 중요한 성분은 마그네슘 이온이며, 그 존재는 리보솜 서브유닛의 해리를 방지하고 세균리보솜(11,13)의자발적인 형성 변화를 억제한다. 칼슘 이온은 또한 중요한 역할을 하며 세균성 리보솜 프로파일링방법(14)에사용되는 소우주 뉴클레아제(MNase)의 활성에 필수적이다. 과노신 5′-[β,γ-이미도]triphosphate (GMP-PNP), GTP의 비 가수분해성 아날로그, 클로람페니콜과 함께 리시스15동안 번역을 억제한다.
용해가 얻어지면, 원심분리에 의해 명확화되고, RIBO-seq 및 고처리량 총 mRNA 시퀀싱(RNA-seq)에 대해 각각 두 부분으로 나뉘며 동시에 수행되기때문에(도 1). RNA-seq는 데이터 분석 중에 RIBO-seq 및 RNA-seq 모두에서 데이터를 비교할 수 있는 기준점을 제공합니다. 조사된 경질은 mRNA 풍부(16)로리보소말발자국의 정상화에 의해 정의된다. RNA-seq의 데이터는 복제 또는 시퀀싱아티팩트(17)를식별하는 데 도움이 될 수 있다.
그림 1. RIBO-seq 및 RNA-seq를 위한 mRNA 견본 제제의 회로도. RIBO-seq 라이브러리 제제의 경우 RNA는 MNase(A)로 소화되고, 그 다음으로 ~28-30nt 길이(B)의 RF 크기 선택; RNA-seq RNA는 절연(C), rRNA(D)의 고갈, 및 결과 mRNA는 임의로 다양한 길이(E)의 단편으로 단편화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
RIBO-seq 및 RNA-seq에 대한 시료 제제의 초기 단계는 약간 다릅니다(도1). 리보솜 프로파일링을 위해, 리보솜에 의해 보호되지 않는 mRNA 분자를 저하시키기 위하여 특정 엔소나트리에 의해 소화될 필요가 있습니다. 표준 프로토콜에서, 얻어진 단량은 자당 쿠션 초원심분리 또는 자당 그라데이션 초원심분리8,14에의해 회수된다. 본 기사에서는, 이러한 단계가진핵세포(18)에대해 마찬가지로, 박테리아에서 RIBO-seq에 필요한 RF를 분리할 필요가 없으며, 폴리아크릴아미드 겔로부터 적절한 길이 mRNA 단편의 크기 선택이 충분하다는 것을 보여준다.
RNA-seq의 경우, mRNA는 전체 RNA로부터 rRNA의 고갈에 의해 얻어진다- rRNA 분자는 연쇄타비딘 코팅 자기 구슬에 결합하는 생체개화 된 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화된다. rRNA-올리고뉴클레오티드-비드 복합체는 자석으로 샘플에서 제거되어 rRNA 고갈된샘플(19,20)이된다. 정제 된 mRNA 분자는 알칼리성 가수 분해에 의해 무작위로 단편화됩니다. mRNA의 얻어진 단편뿐만 아니라 리보소말 발자국은 cDNA 라이브러리로 변환되고 깊은 시퀀싱(그림2)에대비한다. 이것은 알칼리성 가수 분해 (mRNA용) 및 효소 소화 (RF에 대한) 후에 필요한 수리를 종료합니다 : 3'끝의 탈포질화 는 5'끝의 인산화에 선행됩니다. 다음 단계는 일루미나 플랫폼을 사용하여 차세대 시퀀싱(NGS)에 필요한 서열에 의해 프레임된 cDNA 인서트를 만드는 어댑터 결찰 및 역전사이다. 라이브러리 준비의 마지막 단계는 한 채널에서 여러 가지 샘플을 멀티플렉스링하고 시퀀싱할 수 있도록 시료 특정 바코드로 구문이 증폭되고 레이블이 지정된 PCR 반응입니다. 시퀀싱 하기 전에, 라이브러리의 품질 과 수량은 고감도 DNA 온 칩 전기 포에 의해 평가됩니다. 그런 다음 적절한 매개 변수가 있는 cDNA 라이브러리를 풀로 만들고 시퀀싱할 수 있습니다. 시퀀싱은 라이브러리 수에 따라 MiSeq, NextSeq 또는 HighSeq와 같은 다양한 일루미나 플랫폼에서 수행할 수 있으며, 필요한 읽기 길이 및 시퀀싱 깊이를 수행할 수 있습니다. 시퀀싱 후 생체 정보 분석이 수행됩니다.
그림 2. 도서관 준비. 라이브러리 준비에는 엔드 수리, 어댑터 결찰, 역전사 및 바코딩증폭이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리보솜 프로파일링은 과학적 질문에 따라 쉽게 수정하고 조정할 수 있는 보편적인 방법입니다. 원래 효모1에서사용되었지만 곧 세균세포(21)뿐만 아니라 진핵모델 유기체에 마우스10,제브라피쉬(22, 과일 플라이23, 아라비도시스 탈리아나24)를포함한다. 또한 세포질, 미토콘드리아25,26 및 엽록소세포27,28등 다른 리보성 유형을 연구하는 데 사용되었다. 진핵산자RIBO-seq에서 일반적으로 개시 10,11,29,30,31,32,연신1,10,11,31,33,리보솜 실속 33 및 형태 변화33을 포함하여 번역의 특정 측면을 조사하기 위해 적응 및 정제된다. 수정의 대부분은 다른 번역 억제제의 사용을 포함한다. 그러나 박테리아에서는, 유사한 연구는 행동의 필수 기계장치와 억제제의 빈약함 때문에 수행하기 어려웠다(34). 박테리아에서 가장 일반적으로 사용되는 번역 억제제는 펩디딜 트랜스퍼라제 센터(PTC)에 결합하고 A-부위에 아미노아틸-tRNA의 올바른 위치를 방지하는 클로람페니콜(CAM)이다. 그 결과, CAM은 긴리보솜(35)을체포하는 펩티드 결합의 형성을 방지한다. 박테리아에서 번역 억제제의 다른 예는 테트라사이클린 (TET)36,retapamulin (RET)34 및 Onc11237 번역 개시 사이트를 조사하는 데 사용되었습니다. TRNA를 A-부위에서 tRNA의 항코돈 줄기 루프와 직접 겹쳐리게 하여 리보솜에 tRNA 전달을 방지하는 TET는 원래 CAM 치료로부터 얻은 결과를 확인하기위해 적용되었다. TET는 기본 TIS를 검출하는 것으로 밝혀졌지만 내부 TIS36을밝힐 수 없었습니다. RET는 세균성 리보솜의 PTC에 결합하고, A 부위에서 길쭉한 아미노실-tRNA를 방해함으로써 제1 펩티드 결합의 형성을 방지한다. RET를 적용하면 1차 및 내부TISS 34모두에서리보솜이 체포됩니다. Onc112는 프롤린이 풍부한 항균 펩타이드로 출구 터널에 결합하고 리보소말 A 부위에 아미노틸-tRNA 결합을 차단한다. 그 결과, Onc112는 연신단계37에진입하는 개시 복합체를 방지한다.
주요 정보 리보솜 프로파일링은 리보솜 밀도와 mRNA에 대한 위치입니다. 다양한 성장 조건에서 번역 수준에서 차등 유전자 발현을 성공적으로적용하였으며,번역 효율1,38,39를 측정하고 리보소말 일시중지(10)와같은 번역 조절 이벤트를 검출하는 데 성공했다. RIBO-seq는 또한 새로운 및/또는 매우 짧은 단백질 코딩 유전자10,12, 22,30,37의식별으로 이어지는 음부된 ncRNA, 의사 유전자 및 잘 통칭되지 않은 작은 독서 프레임(ORF)의 번역을 발견할 수 있다. 이러한 경우, RIBO-seq미세 조정 및 게놈 성화를 향상시킬 수 있습니다. 번역된 ORF및 그 정량적 특성의 식별에 대한 높은 민감도를 가진 리보솜 프로파일링은 프로테오메 결정또는 프로테오믹스 연구31,34,39를돕는 데 도움이 되는 프록시역할을 할 수 있다. TIS를 매핑함으로써 리보솜 프로파일링은 알려진 단백질10,32의N 단말 확장 및 잘린 등형을 밝혀낸다. RIBO-seq는 또한 단백질14,21,24의공동 번역 접이식을 연구하도록 조정되었다. 이 방법은 개별 코돈의 연신율1,10,39 또는 디코딩 속도를 측정할 수 있게 해주며,번역(17)의정량적 모델을 개발하는 데 도움이 된다. 리보솜프로파일링 방법은 또한 박테리아7,15,17,프레임 변속40,스톱 코돈판독21,종단/재활용 결함41, 42 및 리보소말 형성 변화33진핵생물에서 의 리보솜 일시 정지에 대한 기계적 통찰력을 제공할 수 있다. RIBO-seq는 또한 진핵생물(16,43)에서miRNAs6 및 RNA 결합 단백질과 같은 번역에 대한 특정 트랜스 작용 인자의 영향을 검사하도록 조정되었다. 그러나, RIBO-seq의 실험 설계 및 획득된 해상도가 결과 시퀀싱데이터(12)로부터추출될 수 있는 정보의 양을 결정하는 것이 중요하다.
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Protocol
1. 샘플 컬렉션
- 세균 문화를 준비하십시오. 샘플당 100mL의 배양량을 권장합니다.
- 샘플 수집을 위한 장비 및 시약 준비: 시료 당 스푸뮬라 2개, 멸균 0.45 μm 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(MCE) 필터, 50mL 멸균 튜브, 액체 질소, 50 mg/mL 클로람페니콜 70% (vol/vol) 에탄올(선택 사항). 액체 질소 증발을 허용하고 폐쇄 튜브의 폭발을 방지하기 위해 50 mL 튜브의 뚜껑을 펑크. 실험실 세제와 70% 에탄올로 스쿠뮬라를 오염 제거합니다.
- 여과 장비와 스쿠쿨라 중 하나를 세균 배양의 성장 온도에 미리 데우지.
참고: 깔때기, 프릿베이스, 접지 조인트 플라스크 및 47mm Ø 스프링 클램프가 있는 올글래스 여과 장치를 추천합니다. - 시료 수확 전에, 100 μg/mL의 최종 농도에 클로람페니콜을 세균 배양에 추가하고 1분(선택 사항)을 배양한다.
- 액체 질소를 50mL 멸균 튜브에 붓고 두 번째 스푸쿨라를 튜브 내부에 배치하여 식힙니다.
주의! 액체 질소는 증발 시 압력 변화로 인해 밀폐 된 용기가 폭발할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 액체 질소 증발을 허용하기 위해 50 mL 튜브의 뚜껑에 몇 개의 구멍을 만들어야합니다. - 여과로 세포를 수집합니다. 매체가 멤브레인을 통과했을 때 필터링을 중지하지만 필터가 완전히 건조되는 것을 허용하지 않습니다.
- 미리 따뜻해진 스쿠쿨라를 사용하여 필터 디스크에서 세포를 빠르게 긁어 내어 세균성 펠릿을 수집합니다. 즉시 액체 질소로 채워진 50 mL 튜브에 수확 된 세포와 함께 전체 스쿠쿨라를 놓습니다. 수확된 펠릿은 액체 질소로 완전히 덮여 있어야 합니다.
- 펠릿을 철저히 동결하고 이전에 냉각 된 두 번째 스쿠쿨라를 사용하여 얼어 붙은 세포를 제거하십시오. 구멍이 뚫린 뚜껑을 닫고 튜브를 -80°C. STOP 포인트로 옮춥시다.
참고: 각 시료 수확 후 스쿠뮬라를 소독합니다.
2. 셀 리시스
- 10m Tris pH 8, DNase I 및 1.5mL 반응 튜브에서 0.1 M GMP-PNP를 준비하여 용액을 보관하고 얼음 위에 보관하십시오. 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
- 준비 용해 버퍼 (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0.4% TRITON X-100, 6 mM β-메르카토에탄올, 5 mM CaCl2 및 옵션 1 m m 클로람페니콜). 시료당 리시스 버퍼의 Aliquot 500 μL을 1.5mL 반응 튜브로 넣고 얼음 위에 놓습니다.
- 실험실 세제와 70% 에탄올로 박격포와 유봉을 오염시키고 건조시다. 박격포를 식히고 액체 질소를 박격포에 부어 유봉하십시오.
- 냉동 펠릿을 미리 차가운 박격포로 옮기고 분말로 갈아줍니다. 주걱으로 약 1부의 알루미늄 산화물을 추가하고 계속 연마합니다. 필요할 때 액체 질소를 부어 박격포, 유봉 및 세포를 시원하게 유지, 해동 모르타르의 내용을 하지 마십시오.
- 용해 버퍼를 사용하기 직전에 GMP-PNP 및 DNase I를 용해 버퍼 알리쿼트에 각각 2mM 및 100 U/mL의 최종 농도에 추가합니다. 용액을 셀 및 알루미늄 산화물으로 박격포로 옮기고 계속 연마합니다. 연삭하는 동안 용해가 천천히 해동하고 혼합물을 미리 냉각된 1.5mL 반응 튜브로 옮기고 즉시 얼음 위에 놓습니다.
- 원심분리기는 4°C에서 5분간 20 000 x g로 용해됩니다. 초자연체를 새로운 사전 냉각된 1,5mL 반응 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.
- 나노 드롭으로 각 샘플의 RNA 농도를 측정합니다. 1:10 희석 시료를 사용하고 핵이 없는 물에 용해 버퍼1:10 희석을 빈물로 사용하십시오.
참고: 클로람페니콜은 260 nm에서 상당한 흡수를 나타낸다는 점에 유의하십시오. - 각 용액을 RIBO-seq (0.5 - 1 MG의 RNA)와 RNA-seq (나머지)에 대한 두 번째 의 두 부분으로 나눕니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 RNA 정화 키트를 사용하여 RNA-seq용 샘플을 청소하십시오.
참고 : Zymo RNA 클린 및 농축 -25 키트 (재료 표 참조)를사용하는 것이 좋습니다. 또한 짧은 RNA 단편의 정제 효율을 높이기 위해 리보소말 발자국 및 단편화된 mRNA를 위한 샘플 및 바인딩 버퍼의 혼합에 4.5부 분량의 에탄올(샘플 부피 비교)을 추가하는 것이 좋습니다. - RNA-seq를 위한 샘플을 -80°C에 저장합니다. RNA-seq에 대한 절차는 5단계에서 계속됩니다.
3. RIBO-seq에 대한 샘플의 MNase 소화
- RNA 1 mg에 10mM Tris pH 8에 187.5 U/μL MNase의 3.8 μL을 추가하고 500 μL의 총 부피에 용해 버퍼로 위로 얹습니다.
- 25°C, 300 RPM에서 45분간 열믹서에서 배양합니다.
- 시판되는 RNA 정리 키트(2.9단계)로 시료를 청소합니다.
- RIBO-seq용 샘플을 -80°C(STOP 포인트)에 저장하거나 크기 선택을 진행합니다.
4. 폴리 아크릴아미드 젤 전기 포하 (PAGE) 및 RIBO-seq에 대한 샘플의 크기 선택
- 8M 우레아로 15% 폴리아크릴아미드-TBE 젤을 준비하고 TBE 버퍼가 있는 탱크에 놓습니다. 200 V의 일정한 전압에서 최소 10분 동안 사전 실행합니다.
- 샘플을 TBE-Urea 샘플 버퍼와 혼합하고 95°C에서 1분간 분해하여 얼음 위에 즉시 놓습니다.
- 주사기를 사용하여 TBE 버퍼를 젤 웰에 주입하여 우레아를 씻어 내보라고 합니다. 샘플을 적재하여 각 샘플을 분리하고 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 하나의 우물 공간을 남깁니다. 29 nt 올리고뉴클레오티드및 26nt 및 32 nt 올리고뉴클레오티드의 혼합을 마커로 사용한다. 180 V의 일정한 전압에서 전기 전도를 실행합니다.
- 야간 인큐베이션(5mM EDTA, 10m NaOAc pH 5)용 멸균 버퍼를 준비한다.
- 전기 포근 후, 약 2-3 분 동안 SYBR 골드 목욕에 젤을 염색하고 뉴클레아제없는 물로 젤을 헹구십시오.
- 멸균 바늘 또는 면도날을 가진 26 그리고 32 nt 사이 젤의 조각을 소비하고 각 견본을 위한 별도의 1.5 mL 관에 젤 조각을 놓습니다. 샘플 사이에 바늘이나 면도날을 변경합니다.
- 각 반응 튜브에 하룻밤 배양 버퍼의 200 μL을 추가합니다.
- 시료를 10°C, 1000 RPM에서 밤새 열믹서에서 배양한다.
- 다음 날, 단계 2.9에서와 같이 샘플을 청소합니다. 뉴클레아제없는 물의 80 μL에서 발자국을 엘테.
- 샘플을 -80°C. STOP 지점에 저장합니다. RIBO-seq에 대한 절차는 7단계에서 계속됩니다.
5. RNA-seq에 대한 샘플에서 rRNA 고갈에 의해 세균 성 mRNA의 정화
- 세균성 mRNA 정제 키트(예: 인비트로겐 MICROBExpress)를 사용하여 샘플에서 rRNA를 제거하십시오. 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.
- 2.9 단계에서와 같이 샘플을 청소하십시오. 핵이 없는 물의 50 μL에서 mRNA를 엘테.
- RNA-seq용 샘플을 -80°C(STOP point)에 저장하거나 알칼리성 단편화를 계속합니다.
6. RNA-seq에 대한 샘플의 알칼리성 단편화
- 알칼리성 가수 분해 버퍼 준비(0.1 M NaHCO3의220 μL, 0.1 M Na2CO3 및 0.5M EDTA의 1 μL의 30 μL)을 준비하십시오. 알칼리성 버퍼의 1부피(50 μL)를 샘플의 1부피(50μL)와 혼합하고 95°C에서 25분간 배양한다.
- 반응을 중지하려면 3M NaOAc pH 5.5의 5 μL을 추가합니다.
- 2.9단계에서와 같이 샘플을 청소하고 뉴클레아제없는 물의 80 μL에서 샘플을 엘로우.
- 가능한 정지 지점: RNA-seq 샘플을 -80°C에 저장합니다. 그러나 불필요한 동결 및 해동을 피하기 위해 7 단계로 직접 이동하는 것이 좋습니다.
7. RNA-및 RIBO-seq 모두에 대한 샘플의 탈포스포릴화 및 인산화
- 각 샘플에 10x 반응 버퍼 PNK 및 5 μL T4 PNK의 10 μL을 추가합니다. 3'끝을 탈포하기 위해 37 °C에서 1.5 시간 동안 배양하십시오.
- 1m ATP의 3 μL을 추가하고 5'끝을 인계하기 위해 1 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 단계 2.9에서와 같이 샘플을 청소하고, 30 μL 뉴클레아제없는 물에 엘ute.
- 샘플을 -80°C. STOP 지점에 저장합니다.
8. 일루미나를 위한 NEBNext 멀티플렉스 스몰 RNA 라이브러리 준비 세트를 이용한 도서관 준비
- 뉴클레아제 없는 물의 6μL에 입력 RNA(mRNA 단편 및 리보소말 발자국)의 100-1000 ng를 준비하고 3'SR 어댑터의 1 μL을 추가합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.
- 제조업체의 프로토콜이 지정한 대로 3'Ligation 반응 버퍼(2X)의 10 μL과 3μL의 3μL을 37°C에서 2.5시간 동안 37°C에서 배양하고 배양합니다.
- 수정된 프로그램으로 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 프라이머를 혼성화: 75°C에서 5분, 37°C에서 30분, 4°C에서 유지한다.
- 5' SR 어댑터를 리게이트합니다. 한 가지 변화와 함께 제조업체의 프로토콜을 따르십시오 : 25 °C에서 1 시간 대신 2.5 시간 동안 37 °C에서 인큐베이션을 수행하십시오.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사를 수행합니다.
- 가능한 정지 점: 70°C에서 합성 된 cDN을 포함하는 샘플을 15 분 동안 배양하여 역 전사를 비활성화하고 -80 °C에 저장합니다. 그러나 시료의 불필요한 동결 및 해동을 피하기 위해 다음 단계로 직접 진행하는 것이 좋습니다.
- 백업으로 -80 °C에 각 cDNA 라이브러리의 절반을 저장합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행합니다. 반응 믹스의 절반을 사용하십시오. -80°C. STOP 지점에 획득한 라이브러리를 저장합니다.
9. 페이지를 사용하여 cDNA 라이브러리의 크기 선택
- 6% 폴리아크릴아미드-TBE 젤을 준비하고 TBE 버퍼가 있는 탱크에 놓습니다. 200 V의 일정한 전압에서 최소 10분 동안 사전 실행합니다.
- 샘플을 젤 로딩 염료, 블루(6X)와 혼합하여 젤에 적재합니다. 빠른 부하 pBR322 DNA-MspI 다이제스트를 사다리로 사용하십시오. 처음에, DNA가 젤을 입력한 다음 전압을 180 V로 변경할 수 있도록 120 V의 일정한 전압에서 전기 전경을 실행합니다.
- 전기포고가 끝나면 SYBR 골드 배스(SYBR Gold-bath)에 젤을 약 2-3분 동안 염색하고 뉴클레아제가 없는 물로 젤을 헹구십시오.
- 라이브러리를 포함하는 절제 젤 조각. RNA-seq 샘플의 경우 135-180 nt 사이와 135-170 nt 사이의 RIBO-seq 를 소비한다. 멸균 바늘 이나 면도날을 사용 하 고 별도 1.5 mL 반응 튜브에 절제 된 젤 조각을 배치 합니다. 샘플 사이에 바늘이나 면도날을 교체해야 합니다.
참고: 일루미나에 대한 NEBNext 멀티플렉스 스몰 RNA 라이브러리 준비 세트의 어댑터 및 바코드는 총 119nt로 절단된 절단을 결정합니다. - 각 절제된 젤 단편에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.
- 젤 조각을 10°C, 450 RPM에서 밤새 열믹서에서 배양한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 DNA 정리 키트로 cDNA 라이브러리를 청소하고 농축합니다.
참고 : Zymo DNA 클린 및 농축 -5 키트를 사용하는 것이 좋습니다 (재료 표 참조). - -80 °C. STOP 지점에 정제 된 cDNA 라이브러리를 저장합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 모범적인 결과는 WT 바실러스 subtilis 세포를 포자하는 번역 규정을 검토하는 연구 결과에서 얻어졌습니다. 야간 배양물은 풍부한 배지의 100mL에서 0.1에 해당하는 OD600으로 희석되었고, 37°C에서 배양하여 OD600이 0.5-0.6에 도달할 때까지 격렬한 흔들림을 하였다. 그 후 풍부한 배지는 포자 공정을 유도하기 위해 최소한의 매체로 대체되었고 인큐베이션은 최대 4시간 동안 계속되었다. 세포는 T0 - 포자 유도로 시작하는 매 시간마다 수확되어 5 개의 시간 점을 초래했습니다. 수확 1 분 전에, 배양은 위의 프로토콜에 설명된 대로 클로람페니콜로 처리되었다. 세포는 0.45 μm 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(MCE) 필터를 사용하여 예열된 유리 여과 시스템에서 여과에 의해 수집되었고 액체 질소에서 플래시 냉동하였다.
용사에서 얻은 리보핵산의 양은 성장 조건, 배양 량 및 밀도에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜에 따라, 세균 배양의 100 mL(바실러스 subtilis)평균 RNA의 1-4 mg을 산출합니다. 전술한 실험에서 얻은 리스의 예는 표 1에도시된다.
| RNA 농도[ng/μL] | RNA 양 [mg] | A260/A280 | A260/A230 | |
| WT0 | 5845 | 3.21 | 1.57 | 0.83 |
| WT1 | 6275 | 3.45 | 1.58 | 0.79 |
| WT2 | 3525 | 1.94 | 1.38 | 0.56 |
| WT3 | 3717 | 2.04 | 1.37 | 0.61 |
| WT4 | 1653 | 0.91 | 1.11 | 0.43 |
표 1. RNA 농도 및 B. 서브틸리스의 대표적인 샘플에서의 양은 lysates. 표에는 포라기 유도(0) 및 1시간(1), 2시간( 2), 3개( 3) 또는 4시간 포스트 포자 유도 전에 수확된 야생형(WT) B. 서브틸리스의 샘플을 포함한다. 리시스는 클로람페니콜을 함유한 용해 완충제 550μL로 수행되었다. 포자가 진행됨에 따라 얻어진 RNA의 양이 감소한다는 것을 알아차리지 못할 수 있습니다.
RNA의 양이 1 mg보다 낮을 때, 0.25 mg의 RNA가 1-0.5 mg 대신 RIBO-seq에 사용되며 MNase의 양은 각각 조정된다. 핵소화 후 대표적인 RNA 양 및 농도가 표 2에도시된다. 소화 및 세척 후 RNA의 평균 양은 RNA 입력0.5 mg에서 50 μg이다.
| RNA 농도[ng/μL] | RNA 양 [μg] | A260/A280 | A260/A230 | |
| WT0-R | 1015 | 50.75 | 2.12 | 1.84 |
| WT1-R | 1157.4 | 57.87 | 2.10 | 2.19 |
| WT2-R | 847.2 | 42.36 | 2.10 | 2.00 |
| WT3-R | 983.6 | 49.18 | 2.09 | 2.16 |
| WT4-R | 206 | 10.30 | 2.13 | 1.00 |
표 2. RIBO-seq에 대한 대표적인 시료의 핵분해 소화 후 RNA의 양 및 농도. 표에는 포라기 유도(0) 및 1시간(1), 2(2), 3개( 3) 또는 4시간 후 포자 유도 전에 수확한 야생형(WT) B. 부틸리스의 샘플을 포함; 문자 "R"은 RIBO-seq에 대한 샘플을 나타냅니다. WT4-R 샘플의 RNA 농도가 낮았기 때문에, 0.25 mg의 RNA가 소화되었고, 나머지 시료에 대한 RNA의 0.5 mg은 리보소말 발자국 생성을 위해 사용되었다. 소화를 위한 MNase의 양은 WT4-R에서 RNA의 0.25 mg을 위한 178.125 U, 및 다른 견본에서 RNA의 0.5 mg을 위한 356.25 U이었다. 소화 후 시료는 상용 RNA 정화 키트및 리보핵산 농도로 세척되어 나노드롭으로 측정하였다.
MNase 소화 후, 크기 선택은 PAGE의 도움으로 수행됩니다. 소화된 샘플을 가진 15% TBE-urea 폴리아크라이알라미드 겔의 예가 도 3에도시된다. 26에서 32 nt 사이의 젤 조각은 멸균 면도날로 절단되고 하룻밤 동안 인큐베이션 버퍼에서 하룻밤 동안 배양되었습니다. 다음 날, 리보소말 발자국은 상용 RNA 정화 키트로 청소되었습니다.
그림 3. MNase 소화 후 대표적인 샘플을 가진 15% TBE-urea 폴리아크라이알라미드 젤. 그림은 포라기 유도 (0) 및 1 시간 (1), 2 (2), 3 개 또는 4 시간 포스트 포자 유도 전에 수확 된 야생 유형 (WT) B. 부틸리스로부터의 샘플을 포함한다; 문자 "R"은 RIBO-seq에 대한 샘플을 나타냅니다. 15μL의 변성 시료는 순으로 젤 우물에 적재되었다: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R 및 나머지 부피는 백업으로 -80°C에 저장되었다. 29 nt 올리고뉴클레오티드 및 26 nt 및 32 nt 올리고뉴클레오티드의 혼합은 마커로 사용되었다. 전기포고는 상술한 바와 같이 수행되었고 겔은 SYBR 골드 배스에서 염색되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
핵소화와 병행하여, RNA-seq용 리세이트는 상용 RNA 정화 키트로 세척되었고, RNA의 얻어진 농도는 NanoDrop로 측정하였다. 대표적인 결과는 표 3에표시됩니다. 세척 후 리보핵산의 양은 40-500 μg로 감소하였다.
| RNA 농도[ng/μL] | RNA 양 [μg] | A260/A280 | A260/A230 | |
| WT0-m | 10274.1 | 513.70 | 2.14 | 2.35 |
| WT1-m | 10118.3 | 505.92 | 2.12 | 2.33 |
| WT2-m | 5599.7 | 279.98 | 2.15 | 2.29 |
| WT3-m | 6562.2 | 328.11 | 2.08 | 2.31 |
| WT4-m | 757 | 37.85 | 2.01 | 1.95 |
표 3. RNA 정제 후 RNA-seq에 대한 샘플의 RNA 양 및 농도. 표에는 포라기 유도(0) 및 1시간(1), 2(2), 3개( 3) 또는 4시간 후 포자 유도 전에 수확한 야생형(WT) B. 부틸리스의 샘플을 포함; 문자 "m"은 RNA-seq (mRNA)에 대한 샘플을 의미한다.
RNA-seq를 위한 샘플의 얻어진 RNA 농도는 rRNA 고갈을 위한 RNA 입력을 정의하는 데 사용되었다. 각 RNA-seq 샘플에서 RNA의 8 μg는 제조업체의 프로토콜에 따라 MICROBExpress 세균mRNA 정제 키트(재료표참조)와 함께 사용되었고 그 후 상용 RNA 정화 키트로 세척하였다. rRNA 고갈의 대표적인 결과는 표 4에도시된다.
| RNA 농도[ng/μL] | A260/A280 | A260/A230 | RNA 양 [μg] | |
| WT0-m | 62.7 | 1.99 | 1.75 | 3.1 |
| WT1-m | 59.3 | 2.00 | 2.16 | 2.9 |
| WT2-m | 93.7 | 1.97 | 1.69 | 4.7 |
| WT3-m | 68.3 | 1.99 | 2.33 | 3.4 |
| WT4-m | 85.0 | 1.97 | 2.00 | 4.2 |
표 4. rRNA 고갈 후 대표적인 RNA 양 및 농도. 표에는 포라기 유도(0) 및 1시간(1), 2(2), 3개( 3) 또는 4시간 후 포자 유도 전에 수확한 야생형(WT) B. 부틸리스의 샘플을 포함; 문자 "m"은 RNA-seq에 대한 샘플을 의미한다. RNA-seq를 위한 견본에서 RNA의 8 μg는 rRNA 고갈을 위해 이용되고 그 후에 상업적인 RNA 정화 키트로 세척되었습니다.
다음으로, 얻어진 mRNA는 알칼리성 가수분해에 의해 단편화되고 프로토콜에 설명된 바와 같이 상업적 키트로 세척하였다. 단편화된 mRNA 및 리보소말 발자국은 위의 프로토콜에 따라 3'끝에서 탈포되고 5'끝에서 인포로 매화되었다. 샘플은 프로토콜에 설명된 대로 일루미나 시퀀싱을 위한 cDNA 라이브러리를 구성하는 데 사용되었습니다. 도 4는 얻어진 라이브러리를 가진 6% 폴리아크릴아미드 겔의 예를 나타낸다. RNA-seq용 135-180nt 및 RIBO-seq용 135-170nt 범위의 겔 단편은 멸균 면도날로 절제되고 핵이 없는 물에서 하룻밤 동안 배양되었다. 라이브러리는 Agilent 2100 Bio analyzer를 사용하여 고감도 DNA 온칩 전기포에 의해 평가된 상용 DNA 클린업 키트와 품질 및 양으로 세척되었다.
그림 4. 크기 선택 전후 cDNA 라이브러리의 6% 폴리 아크라이글아미드 젤. 빠른 부하 pBR322 DNA-MspI 다이제스트는 사다리로 사용되었다. 샘플의 25 μL은 다음 순서로 젤에 적재되었다: 3 개의 RIBO-seq 라이브러리 와 6 개의 RNA-seq 라이브러리. 나머지 샘플 부피가 백업으로 -80°C에 저장하였다. 그림은 1시간(1), 2개(2), 3시간 또는 4시간 후 포자 유도를 수확한 야생형(WT) B. 서브틸리스로부터의 샘플을 포함한다. 문자 "R"은 RIBO-seq에 대한 샘플을 의미하며 문자 "m"은 RNA-seq에 대한 샘플을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
민첩성 2100 바이오 분석기로부터 얻은 가상 젤 영상 및 일렉트로페로그램의 예는 도 5에도시된다. RIBO-seq 라이브러리를 나타내는 대역과 피크는 RNA-seq 라이브러리를 나타내는 이들에 비해 더 좁고 더 잘 정의됩니다. 온칩 전기포에 따르면 라이브러리는 약 150bp 길이로 예상되는 라이브러리 크기입니다. 라이브러리 준비에 사용되는 어댑터 및 바코드는 119nt 길이이고 인서트는 29-30 nt 길이(RIBO-seq용) 또는 25~50nt(RNA-seq용)의 범위입니다. RIBO-seq 라이브러리에서 얻은 200bp에 가까운 추가 피크는 시퀀싱에서 얻은 데이터가 트리밍되고 rRNA/tRNA가 필터링될 때 생물정보 분석 중에 버려질 수 있는 PCR 유물을 나타낼 수 있다. DNA의 평균 양은 차세대 시퀀싱에 필요한 물질의 충분한 양을 제공하는 32 ng이다.
그림 5. 고감도 DNA 온칩 전기포고에서 온칩 전기포고에서 전기 페로그램 및 가상 젤 이미지의 예. 그림은 포라기 유도 (0) 및 1 시간 (1), 2 (2), 3 개 또는 4 시간 포스트 포자 유도 전에 수확 된 야생 유형 (WT) B. 부틸리스로부터의 샘플을 포함한다; 문자 "R"은 RIBO-seq 라이브러리를 말하며 문자 "m"은 RNA-seq 라이브러리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
온칩 전기포고증에 의한 품질 관리 후, 일루미나의 NextSeq500 플랫폼(채널당 라이브러리 10개, 채널당 최소 350mln 읽기)에서 단단 50bp 시퀀싱을 위해 라이브러리를 풀링하였다. 시퀀싱은 RNA-seq 라이브러리에 대한 샘플당 30-5700만 개의 판독을 산출하고 RIBO-seq 라이브러리의 샘플당 30-5000만 개의 판독을 산출했습니다. 어댑터와 품질 이열을 트리밍하면 RNA-seq 샘플에 대한 샘플당 24-47 mln 판독이 생성되고 RIBO-seq 샘플의 샘플당 25-50 mln 판독이 발생했습니다. STAR44로수행된 매핑은 RNA-seq 샘플(전체 판독 수의 8-16.8%)과 2.3-1040만 개의 고유 매핑 된 읽기 (7.7-22.1%)에 대한 샘플 당 24-960 만 개의 고유 매핑 된 읽기를 산출했습니다. RIBO-seq 샘플용. 획득된 데이터는 FastQC45로검사된 품질 관리였습니다. trimmed 시퀀스에 대한 FastQC에 의해 생성된 품질 플롯의 예는 도 6에도시된다. RIBO-seq및 <50 nt에 대한 < 관심 의 길이의 서열은 매우 좋은 품질을 제시했다. 모든 다듬어진 시퀀스에 걸쳐 GC 콘텐츠 의 플롯 및 시퀀스 길이의 분포의 예는 그림 7에표시됩니다. RIBO-seq 라이브러리의 GC 분포 플롯에서 72%의 추가 피크는 rRNA 여과46,47,48에의해 생물정보 분석 중에 제거될 수 있는 rRNA오염을잠재적으로 나타낼 수 있다. 시퀀스 길이 분포는 RIBO-seq 라이브러리에 대해 매우 좁으며, RNA-seq 라이브러리의 길이 분포는 15~50nt 사이인 반면, 26-27nt의 피크가 있습니다.
그림 6. 트리밍 후 RIBO-seq 및 RNA-seq 라이브러리에 대한 모든 베이스에 걸쳐 품질 점수의 상자 와 수염 플롯의 예. 그림은 포자 유도 (0) 및 4 시간 포자 유도 전에 수확 된 야생 유형 (WT) B. 서브틸리스로부터의 샘플을 포함한다; 문자 "R"은 RIBO-seq 샘플을 지칭하고 문자 "m"은 RNA-seq 샘플을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 트리밍 후 RIBO-seq 및 RNA-seq 라이브러리에 대한 모든 서열의 GC 함량 및 서열 길이 분포의 플롯의 예. 그림은 포자 유도 후 4시간(4시간) 수확된 야생형(WT) B. 서브틸리스로부터의 샘플을 나타낸다. 문자 "R"은 RIBO-seq에 대한 샘플을 의미하며 문자 "m"은 RNA-seq에 대한 샘플을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
RIBO-seq 데이터가 선택한 길이의 임의mRNA 단편이 아닌 진정한 리보소말 발자국에 대한 정보를 제공하는지 확인하기 위해 RIBO-seq 데이터분석(49)의웹 서버인 RiboToolkit을 사용하여 RIBO-seq 및 RNA-seq의 시퀀싱 데이터를 비교했습니다. 리보-세크 데이터는 RNA-seq데이터(도 8B)에서관찰되지 않는 도 8A에도시된 바와 같이 RF의 시동 리보솜 및 특성에 대응하는 삼중 주기성과 키가 크고 좁은 피크를 나타낸다. 더욱이, 코딩 서열(CDS)에서 RF 및 mRNA 단편의 평균 커버리지의 프로파일을 보여주는 메타진 플롯은 예상대로 RIBO-seq 데이터 세트(도8C)에서CDS에 매핑된 판독값의 높은 비율을 나타냈다.
그림 8. CDS에 대한 RF 및 mRNA 단편의 메타진 주기도 플롯 및 평균 범위. 메타진 프로파일은 통합 웹서버(49)인리보툴킷(RiboToolkit)과 함께 수득되었다. CDS 길이는 1값으로 정규화되었고 각 CDS는 100개의 동일한 저장소로 나뉘었다. 그림은 1시간 후 포화 유도를 수확한 야생형(WT) B. 서브틸리스로부터의 샘플을 나타낸다. 문자 "R"은 RIBO-seq에 대한 샘플을 의미하며 문자 "m"은 RNA-seq에 대한 샘플을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에 제시된 RIBO-seq 프로토콜이 표준 RF 복구 방법(자당 그라데이션 초원심분리)에 의해 얻어진 것과 유사한 결과를 산출하는지 여부를 비교하기 위해, 우리는 두 가지 방법에 따라 준비된 라이브러리로부터의 시퀀싱 결과를 평행화하였다. WT B. 서브틸리스에서 포자화 시 번역 조절을 조사하는 실험은 제시된 RIBO-seq 프로토콜에 따라 수행되었으며, 자당그라데이션 초원심분리에 의한 단일성 회수를 포함하는 표준 프로토콜을 따르고 있다. 두 실험에서 얻은 리보솜 커버리지 프로파일의 결과는 도 9에도시된다. 매핑된 RF의 시각화는 두 실험 과 생물학적 정보 분석 시 유사한 결과를 산출한 것과 매우 유사합니다.
그림 9. 얻어진 RF의 시각화는 게놈에 매핑되었다. 이 수치는 야생형 B. 서브틸리스로부터 얻어진 RF를 4시간 후 포자 유도후 4시간 동안 수확하고 표준 프로토콜(WT4-R-s, 상부 패널) 또는 제시된 프로토콜(WT4-R, 하부 패널)에 따라 제조된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
리보솜 프로파일링의 주요 기술적 과제는 특정 생리학적 인 관심 상태에서 mRNA에 리보솜의 스냅 샷을 캡처하기 위해 번역을 신속하게 억제 할 필요가있다. 이를 달성하기 위해, 번역 억제제, 액체 질소의 신속한 수확 및 플래시 동결이 일반적으로 사용됩니다. 항생제를 적용하는 것은 유물을 일으킬 수 있기 때문에 선택 사항입니다. 클로람페니콜은 세균RIBO-seq에서 길쭉한 리보솜을 체포하기 위해 일반적으로 사용되는 약물입니다. 그러나 개시를 막지 는 못하여 번역 개시사이트(14)의하류에 약 6개의 코돈이 축적되는 것을 방지한다. 더욱이, 펩디딜트랜스퍼라제 반응을 억제하는 능력은 리보소말 P-및 A-사이트 기판의 성질에 의존할 수 있다. 아마도, CAM은 초기 펩티드17,38,50의끝에서 두 번째 아미노산으로 글리, 알라, 세르, Cys, 또는 Thr와 리보솜을 보다 효과적으로 체포한다. 이것은 실험 설계 및 생물 정보 분석 중에 고려 가치가 있다, 특히 리보소말 일시 중지 를 공부 할 때17. CAM은 또한 스톱 코돈 판독 및 프레임 변속51을촉진하여 번역 정확도에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, CAM 억제는 전형적인 RIBO-seq 연구에 비교적 빠르고 충분하며14일 오해를 유발하지않는다.51. 항생제에 의한 유물 중 일부는 약물 량9를증가시킴으로써 피할 수 있다. 당사의 프로토콜에 적용된 CAM 농도는 RIBO-seq 실험7,14,21에사용되는 일반적인 양이지만, 농도는 상이한 미생물에 대해 다를 수 있으며 시료 수확 전에 최적화되어야 한다. 번역 억제제적용으로 인한 유물의 발생 가능성으로 인해, 연구질문에 필요하지 않은 경우 억제제 치료를 피하고 신속한 수확이 가능한 경우14. 빠른 세포 수집은 특히 억제제 처리 없이 수행되는 경우, 장기간 수확하면 변화하는 환경조건에대한 응답으로 트랜스라토메의 폴리올어 손실 및/또는 변화를 초래할 수 있기 때문에 매우 중요하다. 따라서, 온도 및/또는 흔들림을 포함한 배양 성장과 동일하거나 유사한 조건하에서 수행될 수 있으므로 여과를 수확 방법으로 사용하는 것이 좋습니다. 필터 표면에서 수집된 여과 세포는 지속적으로 성장 배지로 플러시되어 세포 밀도, 산소화 및 아미노산 및 기타 영양소의 수준을 감지하는 데 방해가된다. 여과는 부드럽고 원심분리보다 빠를 수 있으며, 배양밀도가 보통인 경우, 그렇지 않으면 많은 수의 세포가 필터 모공을 막고 과정을 늦출 수 있다. 장기간 여과가 발생할 가능성이 있는 경우, 번역 이형으로 인해 수확 시간을 연장할 수 있는 문화의 클로람페니콜 사전 처리를 권장합니다. 필터 막힘으로 인해 여과가 완료되기 어려워지면 여과를 멈추고 필터에 수집된 배양의 과잉 배양 및 플래시 동결 부분을 제거하는 것이 좋습니다. 우리는 조밀 한 세균 배양의 50 mLRIBO-seq를 수행 하기에 충분 한 관찰. 액체 질소에서 세포의 후속 플래시 동결은 즉시 번역을 중지하는 가장 보편적이고 효과적인 접근방식이다 8,21,52.
리보누알리스 소화는 양질의 RF를 획득하는 데 필요한 중요한 단계입니다. 리보솜 서브유닛은 소화될 수 있는 RNA 분자로 구성되어 리보솜의 무결성을 방해하여 rRNA 오염을 일으키고 RF44를파괴하는 것이 중요하다. 원래 RNase 나는 진핵 생물1에서mRNA 및 RF 생성의 소화에 사용되었다. 이 효소는 박테리아에서 비활성 것처럼 보였기 때문에 황색 포도상 구균(21)에서미세 코칼 뉴클레아제 (MNase)로 대체되었습니다. 나중에 RNAE 내가 실제로 세균 성 샘플의 소화를 수행 할 수 있음을 보여 주었다, 그러나 MNase는이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 남아53. MNase의 단점은 그 촉매 활성의 서열 바이어스에 있다, 이는 30 배 증가 근위가 A 또는 T에, 결과 80% mRNA 조각의 시작 A 또는 T로 시작14 14. 그러나, 이것은 길이의 변화의 대부분이 RF의 5′-end에서 발생하고, 3′-end에 리보솜 밀도를 할당하는 것은 리보솜 위치에 대한 정확하고 정확한 정보를 산출한다는 관측에 의해 극복되었습니다7. MNase 활동은 효소 농도, pH 및 소화 시간에 의해 영향을 받고 각각의 새로운 MNase 배치에 대해 결정되어야 한다. 증가된 뉴클레아제 활성은 rRNA 오염을 증가시키는 반면, 활동이 감소하면 리보소말 발자국의 정확한 분열이 줄어듭니다. 이는 크기 선택적 겔 정제 절차에서 RF의 전체 수율을 감소시키고 mRNA14에대한 리보솜 위치에 대한 보다 정확한 정보를 제공할 수 있다. 따라서 필요한 양의 MNase는 신중하게 결정되어야 합니다. 우리의 실험을 위해 우리는 문학에서 보고된 농도가 RNA의 1 mg 당 소우주 핵의 712.5 U를 적용하는 동안 문헌에 보고된 농도는 50 U38,450 U34,1000 U14 및 1500 U 1500 U15,21,36 RNA의 1 mg 당 변화합니다. 위에서 언급 한 바와 같이, MNase는 그 활동에 대한 칼슘 이온의 존재를 필요로한다. 표준 프로토콜 EGTA에서, 마그네슘에 비해 칼슘에 대한 더 높은 친화력을 가지고 이온을위한 킬라팅 에이전트(54)칼슘을 결합하고 MNase를 활성화하여 소화를 중지하는 데 사용됩니다. 그러나, 우리의 프로토콜에서 소화 반응은 뉴클레아제와 인큐베이션 후 RNA 청소 키트를 직접 사용하여 중지된다.
표준 프로토콜에서, 다음 단계는 자당 쿠션 초원심분리또는 자당그라데이션 초원심분리에 의한 리보솜회수8,14이다. 자당 그라데이션 원심분리는 서브유닛 및 다각성으로부터 단량체의 선택적 분리를 가능하게 하지만 그라데이션 믹서 및 초원심분리기와 같은 특정 장비가 필요합니다. 또한, 이 방법의 처리량은 용자의 500-700 μL로 제한됩니다. 한편, 자당 쿠션 초원심분리 펠릿 대부분의 리보소말 입자는 12밀리리터 이상의 리보소이트 처리를 가능하게 하며 필요한 계측측면에서 덜 까다롭다. 그러나 두 가지 접근 방식은 최소 4 ~6.5 시간14 시간이 걸리고 초원심 분리기가 필요하기 때문에 길다. 우리의 프로토콜에서 이 단계는 15% TBE-urea 폴리아크라이알라미드 젤에서 크기 선택으로 직접 진행함에 따라 생략된다. 전기 전도는 RNA의 이차 구조를 전개하고 분자 내 상호 작용을 방지하기 위해 데우마화 조건하에서 수행됩니다. 우리는 리보소말 발자국의 좁은 범위를 절제하기위한 마커로 26 nt, 29 nt 및 32 nt 올리고 뉴클레오티드를 사용합니다. 우리는 실제 RF의 농도가 그 범위의 리보솜 mRNA 또는 rRNA 단편에 의해 보호되지 않는 무작위로 간주되는 거짓 RF로 잠재적 인 오염을 크게 초과한다고 가정합니다. 프로토콜을 사용하여 얻은 결과는 실제로 선택한 크기 범위에서 RF의 풍부한 분수를 보여 주었다. Agilent 2100 Bioanalyzer와의 품질 검사는 RIBO-seq 라이브러리를 단일로 잘 정의하고 밴드와 피크를 잘 정의하며, 훨씬 더 넓은 얼룩과 봉우리로 시각화되는 RNA-seq 라이브러리와 는 대조적으로보여줍니다(그림 5). 또한, 수득된 리보-세크 데이터는 RNA-seq데이터(도 8B)에서관찰되지 않는 삼중 주기성(도8A)을나타낸다. 더욱이, 게놈에 매핑된 얻어진 RF의 시각화는 당사의 생체정보분석(도 9)에서더욱 확인된 발자국 격리 방법에 관계없이 매우 유사한 발현 패턴을 보여준다. 여전히, 우리는 거짓 RF가 얻어진 신호를 방해할 수 있는 게놈에 지도할 수 있다는 것을 알고 있습니다. 그러나 거짓 RF가 무작위로 생성된다는 사실은 게놈의 한 곳에 축적되어서는 안되며, 따라서 유물과 잘못된 결과를 초래해서는 안 된다는 것을 의미합니다. 또한,53,55를 격리해야 하는 RFs의 크기에 관한 세균 연구에서 합의가 없고 길이 범위의 서브절율만 선택하면결과(17)의오해로 이어질 수 있다는 점에 유의해야 한다. 세균 발자국에 대한 특성길이의 넓은 범위는 MNase 소화(55)보다는대핵 리보솜 행동의 결과이다. 예를 들어, 작은 리보소말 서브유닛에서 16S rRNA의 3′ 말단과 mRNA의 샤인 달가르노 모티프 사이의 상호 작용은 더 긴 RF56을초래할 수 있다. 세균 발자국의 길이의 넓은 범위를 고려, 모하마드 등. 15~40nt17,55사이의 사이즈 선택을 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 잠재적으로 전체 범위의 RF를 격리하고 번역 주기의 다양한 단계에서 리보솜을 포괄적으로 표현하도록 해야 합니다. 진행 중인 토론으로 인해 절제 범위를 신중하게 고려해야 하며 잘못된 선택이 RF의 일부 위반을 배제하고 후속 분석에서 편향으로 이어질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.
핵소화 후 직접 수행되는 크기 선택과 극심분리에 의한 단조로운 절연을 생략하여, 우리의 프로토콜은 빠르고, 상대적으로 쉬우며, 표준 실험실 장비로 수행될 수 있다. RNA 및 DNA 를 세척하기 위한 전용 키트를 사용하여 mRNA 및 도서관 준비의 정화는 표준화와 반복성을 보장합니다. RNA 세척 중에 에탄올의 더 많은 부피를 애포핑하여 <200nt RNA단편(57)의정제 효율을 증가시킨다. 라이브러리 준비에 대한 수정 - 인큐베이션 시간을 연장하고 어댑터 결찰 중 온도를 증가 - rRNA와 같은 메틸화 RNA에 대한 결찰 효율을 감소시키고 rRNA오염(58)을감소시키기 위해 적용된다. 우리의 프로토콜은 다양한 성장 조건 (준비 중인 간행물)에서 번역 규정을 조사하는 데 사용되었지만 TIS 검출과 같은 번역의 다른 측면을 연구하거나 게놈 주석을 개선하고 프로테오믹 연구를 지원하기 위해 적용 할 수 있습니다. 연구 질문에 의존하는 프로토콜에 대한 추가 수정은 리보솜을 관심의 단백질과 교차하거나 리보솜의 농축 된 분수의 결과로 관심의 정제를 교차하는 등 쉽게 포함 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜을 통해 RIBO-seq 절차는 과학자들에게 더 쉽게 접근 할 수 있으므로 새로운 발견을 촉진하고 현장의 발전을 가속화 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
ALS는 EMBO 설치 보조금 IG 3914 및 POIR의 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 04.04.00-00-3E9C/17-00은 유럽 지역 개발 기금에 따라 유럽 연합이 공동 자금을 지원하는 폴란드 과학 재단의 첫 번째 팀 프로그램 내에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X TBE (powder) | Invitrogen | AM9864 | |
| 2-Mercaptoethanol, 99%, pure | Acros Organics | 125472500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| Aluminium oxide calcinated pure p.a. | Chempur | 114560600 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881-500G | |
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | 190321 | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4004 | |
| Dnase I recombinant, Rnase-free | Roche | 4716728001 | |
| EDTA disodium salt | Fisher Scientific | E/P140/48 | |
| Ethyl Alcohol Absolut 99,8% Pure-P.A.-Basic | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | BA6480111 | |
| Filtration apparatus | VWR Collection | 511-0265 | all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask |
| Gel 40 (19:1) | Rotiphorese | 3030.1 | |
| Gel Loading Dye, Blue, 6X | New England Biolabs | E6138G | |
| Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G0635-25MG | |
| labZAP | A&A Biotechnology | 040-500 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| MCE membrane fiter | Alfatec Technology | M47MCE45GWS | pore size: 0.45um |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Purification | Invitrogen | AM1905 | |
| Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina | New England Biolabs | E7300S | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | |
| Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 744330113 | |
| Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | E7323A | |
| RNA Clean & Concentrator -25 | Zymo Research | R1018 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | 223530-500G | |
| Sodium hydrogen carbonate pure p.a. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 810530115 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Life Technologies | S11494 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| TBE-Urea Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC6876 | |
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% | AlfaAesar | J65594 | |
| Triton X-100, 98% | Acros Organics | 327371000 | |
| Urea G.R. | lach:ner | 40096-AP0 |
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