Summary
Presentiamo un protocollo di imaging live senza etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa per catturare immagini, analizzare e quantificare la cinetica di crescita del fungo filamentoso A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con la microscopia a fluorescenza.
Abstract
È ben noto che la crescita delle colonie di funghi filamentosi, per lo più dipendente dai cambiamenti nel tasso di crescita apicale di ife/micelio, è stimata macroscopicamente su mezzi solidificati confrontando le dimensioni della colonia. Tuttavia, misurare quantitativamente il tasso di crescita di ceppi o ceppi fungini geneticamente diversi in diverse condizioni ambientali / di crescita (pH, temperatura, fonti di carbonio e azoto, antibiotici, ecc.) è impegnativo. Pertanto, la ricerca di approcci complementari per quantificare la cinetica di crescita diventa obbligatoria al fine di comprendere meglio la crescita delle cellule fungine. Inoltre, è ben noto che i funghi filamentosi, tra cui Aspergillus spp., hanno modalità distinte di crescita e differenziazione in condizioni sub-aeree su mezzi solidi o colture sommerse. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo microscopico quantitativo per analizzare la cinetica di crescita del fungo modello Aspergillus nidulans, utilizzando l'imaging dal vivo sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Catturiamo immagini, analizziamo e quantifichiamo i tassi di crescita di diversi ceppi fungini in modo riproducibile e affidabile utilizzando un software gratuito open source per bio-immagini (ad esempio, Fiji), in un modo che non richiede alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell'utente.
Introduction
I funghi filamentosi sono di grande importanza socioeconomica ed ecologica, essendo sia cruciali come strumenti industriali / agricoli per la produzione di enzimi e antibiotici1,2 e come agenti patogeni delle piante coltivate3,insetti parassiti4 e umani3. Inoltre, i funghi filamentosi come Aspergillus nidulans sono ampiamente utilizzati come organismi modello per la ricerca fondamentale, come studi in genetica, biologia cellulare ed evolutiva, nonché per lo studio dell'estensione ifale5. I funghi filamentosi sono organismi altamente polarizzati che si allungano attraverso l'apporto continuo di lipidi/proteine di membrana e la sintesi de novo della parete cellulare alla punta estensente6. Un ruolo centrale nella crescita della punta ifale e nel mantenimento della polarità è una struttura specializzata chiamata 'Spitzenkorper' (SPK), una struttura altamente ordinata costituita principalmente da componenti citoscheletriche e dalla distribuzione polarizzata del Golgi6,7,8.
Stimoli /segnali ambientali, come l'interfaccia acqua-aria, la luce, la concentrazione di CO2 e lo stato nutrizionale sono responsabili delle decisioni di sviluppo prese da queste muffe9. Nelle colture sommerse (liquide) la differenziazione di A. nidulans è repressa e la crescita avviene per allungamento della punta ifale6. Durante la crescita vegetativa, le spore asessuate (conidi) germinano per estensione apicale, formando una rete indifferenziata di cellule ifali interconnesse, il micelio, che può continuare a crescere indefinitamente finché i nutrienti e lo spazio sono disponibili. D'altra parte, sui mezzi solidi le punte ifali si allungano e dopo un periodo definito di crescita vegetativa (competenza evolutiva), viene avviata la riproduzione asessuata e i gambi conidiofori aerei si estendono da cellule del piede specializzate del micelio6. Questi danno origine a strutture multicellulari di sviluppo specializzate chiamate conidiofori, che producono lunghe catene di conidiaploidi 10 che possono riavviare la crescita in condizioni ambientali favorevoli.
Un metodo ampiamente utilizzato per misurare la crescita fungina filamentosa è quello di inoculare le spore sull'agar nutriente contenuto in una capsula di Petri e misurare macroscopicamente il diametro della colonia pochi giorni dopo11. Il diametro/area della colonia, più dipendente dalle variazioni del tasso di crescita miceliale e meno dalla densità conidioforica12,viene quindi utilizzato come valore di crescita. Sebbene la misurazione delle dimensioni della popolazione fungina (colonia) che cresce su superfici solide sia abbastanza adeguata, non è affatto la misura più accurata della crescita. Rispetto alle medie del livello di popolazione (medie delle dimensioni delle colonie fungine), le misurazioni delle singole cellule possono catturare l'eterogeneità di una popolazione cellulare e consentire l'identificazione di nuove sotto-popolazioni di cellule, stati13, dinamiche,percorsi e i meccanismi biologici con cui le cellule rispondono ai cambiamenti endogeni e ambientali14,15. Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è probabilmente l'approccio quantitativo di osservazione a singola cellula più ampiamente utilizzato.
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging dal vivo privo di etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa (come contrasto di fase, contrasto di interferenza differenziale (DIC) e microscopia polarizzata) per acquisire immagini, che indipendentemente dall'uso combinato della microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per analizzare e quantificare la crescita polare dei ceppi di A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi.
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Protocol
1. Preparazione dell'inoculo
NOTA: tutti i passaggi devono essere eseguiti in un armadio a flusso laminare.
- Strisciare il ceppo fungino di interesse, da un ceppo di glicerolo (-80 °C) utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, su piastre di mezzi minimi (MM) integrate con i requisiti nutrizionali appropriati relativi al ceppo esaminato [MM: 10,0 g/L di glucosio, 20 mL/L di soluzione salina (soluzione salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L cloroformio) e 1 mL/L oligoelementi (oligoelementi: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH, aggiungere l'1 % (p/v) di agar e gli integratori necessari come descritto in16 e autoclave] (Figura 1).
NOTA: La soluzione salina, la soluzione di oligoelementi e gli integratori sono autoclavati. - Incubare per 2-3 giorni a 37 °C.
- Utilizzare uno stuzzicadenti sterile (o un anello di inoculazione), trasferire un piccolo numero di conidi, toccando delicatamente una singola colonia, in piastre di mezzi completi (CM) [CM: 10,0 g / L di glucosio, 2,0 g / L di peptone, 1,0 g / L di estratto di lievito, 1,0 g / L di acidi casamino, 20 mL / L soluzione salina, 1 mL / L oligoelementi, 5 mL / L soluzione vitaminica (soluzione vitaminica: 0,1 g/L riboflavina, 0,1 g/L nicotinamide, 0,01 g/L p-ammino-acido benzoico, 0,05 g/L piridossina HCl, 1,0 mg/L biotina), regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH, aggiungere l'1 % (p/v) di agar e gli integratori necessari come descritto in16 e autoclave]. Autoclave e conservare la soluzione vitaminica in un flacone scuro a 4 °C.
NOTA: Nel caso in cui la crescita fungina sia troppo densa per identificare e isolare le singole colonie, ri-strisciare su una nuova piastra di agar per ottenere singole colonie. - Incubare per 3-4 giorni a 37 °C.
- Ottenere una sospensione conidiale di circa 2 x 106 cellule/mL grattando 1 cm dalla superficie di una colonia fungina conidiata cresciuta su piastre di agar CM, utilizzando uno stuzzicadenti sterile (Figura S1).
NOTA: Quando necessario, contare i conidi con un emocitometro. - Raccogliere conidi di A. nidulans in un tubo centrifugo sterile da 1,5 mL con 1,0 mL di acqua distillata autoclavata contenente lo 0,05% (v/v) Tween 80 per ridurre il numero di ciuffi di conidi.
NOTA: Conidia può essere conservato fino a 2-3 settimane a 4 °C senza una rilevante perdita di vitalità (A. Athanasopoulos e V. Sophianopoulou, dati non pubblicati). Tuttavia, si raccomanda di filtrare e/o lavare la sospensione conidiale per rimuovere le parti miceliali e le sostanze nutritive, al fine di prevenire il gonfiore conidiale.
2. Preparazione per l'imaging di funghi filamentosi che crescono su mezzi agar (solidi)
NOTA: viene utilizzata una versione modificata del metodo17,18 dell'agar invertito.
- Inizialmente, individuare aliquote di 10 μL di conidiale vigorosamente vorticoso (circa 2 x 104 cellule/mL) in più punti su piastre di Petri (Ø9 cm) 15 mL di MM con 1% (p/v) di agar (Figura 2).
NOTA: Utilizzando la versione modificata del "metodo dell'agar invertito", è possibile eseguire l'immagine di campioni fungini per molte ore senza apparenti effetti deleteri sulla crescita delle ife. - Incubare la coltura sperimentale secondo lo stadio di sviluppo che si intende indagare.
- Tagliare un blocco di agar ≈ 0,8 mm2 contenente la colonia usando un bisturi sterile.
NOTA: Le dimensioni del blocco di agar da tagliare dipendono dalle dimensioni dell'apparecchiatura da posizionare successivamente. Nel presente lavoro vengono utilizzate 8 diapositive ben μ (vedi sotto). - Invertire e posizionare il blocco di agar in un pozzettino di un μ-slide o simile a 8 camere con coperchio con coperchio adatto per l'imaging dal vivo.
NOTA: Nel caso in cui la microscopia ottica trasmessa venga utilizzata in combinazione con la microscopia a fluorescenza (etichettatura), il blocco di agar può essere invertito su una goccia di mezzo liquido contenente il colorante colorante colorante per cellule vive, appena prima dell'imaging.
3. Preparazione per l'imaging di funghi filamentosi che crescono su terreno liquido
- Trasferire aliquote di 10 μL di una sospensione conidiale vigorosamente vorticosa (circa 2 x 104 cellule/mL) nei pozzeli di un 8 pozzedi μ-vetrino contenente 200 μL di MM (liquido) con gli appositi integratori (vedi sopra).
- Incubare per il tempo desiderato alla temperatura desiderata (Figura 3).
NOTA: Se la microscopia a luce trasmessa verrà utilizzata in combinazione con la microscopia a fluorescenza (etichettatura), le colture liquide hanno il grande vantaggio che i coloranti fluorescenti possono essere aggiunti in qualsiasi punto temporale desiderato durante l'esperimento19.
4. Cattura immagini
NOTA: La scelta del microscopio dipende dall'attrezzatura disponibile. In ogni caso la configurazione del microscopio dovrebbe includere uno stadio invertito, una camera ambientale o almeno una stanza con un controllo preciso della temperatura dell'aria.
- Preriscaldare la camera del microscopio termostatato a 37 °C (se non diversamente indicato o come adatto alle specie fungine utilizzate) per stabilizzare la temperatura prima dell'inizio. Questa camera consente la modulazione della temperatura dell'ottica del microscopio e dello stadio del campione durante gli esperimenti time-lapse. Tenere presente che le aberrazioni ottiche20 vengono introdotte quando gli oli per immersione normale (progettati per l'uso a 23 °C) vengono utilizzati oli a 37 °C o superiori.
NOTA: con un budget limitato, le camere di incubazione possono essere realizzate in cartone e materiale di imballaggio isolante21 o utilizzando una stampante 3D22. - Accendere il microscopio, l'alimentazione dello scanner, l'alimentazione del laser e il computer e caricare il software di imaging. Posizionare il μ-vetrino (preparato in precedenza) nella fase del microscopio e mettere a fuoco.
- Trova campi di vista che contengono celle isolate / non sovrapposte (o almeno non sovraffollate), al fine di facilitare le misurazioni della crescita durante l'analisi delle immagini. Cattura almeno 50 cellule in crescita per campione per consentire una solida analisi statistica.
- Selezionare l'approccio al microscopio ottico trasmesso desiderato. Ridurre il tempo di esposizione o la potenza del laser e il tempo di permanenza dei pixel e/o aumentare i diametri dei fori stenopeici, al fine di ridurre al minimo la fotosciviazione delle cellule fungine, come descritto altrove 23,24.
- Impostare il microscopio per acquisire immagini agli intervalli di tempo desiderati e avviare l'acquisizione di serie temporali.
NOTA: per correggere la deriva focale nel tempo (specialmente per esperimenti lunghi), a causa della deriva termica, delle diverse dimensioni delle cellule e del movimento cellulare, utilizzare una strategia di messa a fuoco automatica, se disponibile nel software del microscopio.
5. Analisi delle immagini
NOTA: questa sezione descrive i passaggi chiave dell'elaborazione di immagini al microscopio time-lapse per misurare il tasso di crescita di A. nidulans. L'apertura, la visualizzazione e l'elaborazione delle immagini viene eseguita con il software open source ImageJ / Fiji25.
- Importa le immagini nelle Figi usando Plugins | Bio-Formati | Bio-Formats Importer dal menu Fiji con impostazioni predefinite (Figura 4A).
NOTA: verificare se l'importatore di bio-formati riconosce correttamente la calibrazione dell'immagine. La dimensione dell'immagine mostrata nella finestra dell'immagine del campo informazioni superiore deve essere uguale alle dimensioni dell'immagine originale (Figura 4B). Premere Maiusc + P per visualizzare e modificare le proprietà dell'immagine nel software ImageJ/Fiji. - Se necessario, utilizzare la corrispondenza dell'istogramma26 per la correzione dell'illuminazione tra fotogrammi diversi (Image | Regolare | | di correzione della candeggina Istogramma Corrispondente) (Figura 4C).
- Dove necessario, utilizzare l'algoritmo SIFT (Plugins | | di registrazione Allineamento lineare dello stack con SIFT) per allineare o abbinare le pile di immagini (Figura 4D). La selezione di "Traduzione" dal menu di trasformazione prevista dovrebbe essere sufficiente per correggere qualsiasi deriva x-y.
NOTA: altri plugin possono essere utilizzati anche per allineare una pila di sezioni di immagine, come Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) o StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Seleziona le ife che crescono parallelamente al coverslip, evitando quelle inclinate. Assicurati di selezionare le ife che si propagano per estensione polare ed evita che le ife presentino ramificazioni laterali e/o apicali.
- Usa MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin per tenere traccia delle punte ifali in crescita (Figura 4E)27. Per aggiungere una traccia, selezionate il pulsante Aggiungi nella barra degli strumenti e posizionate il primo punto in una punta ifale con il tasto sinistro del mouse. La serie temporale passerà automaticamente al fotogramma successivo. Per completare il processo di tracciamento, fare doppio clic con il mouse sul punto finale (o premere il tasto Esc) (Figura 4F). Spostati in un altro punto di interesse (ad esempio, la punta ifale in crescita) nel periodo di tempo iniziale e riavvia la procedura misurando il tasso di crescita di un'altra ifa.
NOTA: per installare MTrackJ seguire le istruzioni presentate in https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Fare clic sul pulsante Misura nella finestra di dialogo MTrackJ (Figura 4G) per aprire la tabella di output. Salva le misurazioni delle tracce (File | Salva connome ) nel formato di file desiderato (ad esempio, csv), analizzali e tracciali (Figura 4H).
NOTA: selezionando il pulsante Filmato, viene prodotto un filmato che mostra l'immagine e tiene traccia dei progressi.
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Representative Results
Seguendo questo protocollo, abbiamo catturato e analizzato varie immagini corrispondenti a diversi stadi di crescita / sviluppo del fungo filamentoso A. nidulans. I dati presentati in questo studio sono stati elaborati e analizzati utilizzando il software Fiji. Le misurazioni sono state salvate come file csv, analizzate statisticamente e preparate come grafici utilizzando software statistici commerciali e / o linguaggio di programmazione Python utilizzando librerie software come pandas, numpy, statsmodels, matplotlib e seaborn. Maggiori dettagli possono essere trovati nelle pubblicazioni originali citate.
Al fine di interpretare la risposta delle popolazioni, è importante determinare l'eterogeneità dei parametri chiave all'interno delle popolazioni e identificare in modo efficiente sottopopolazioni fisiologicamente distinte28. La figura 5 mostra la crescita del ceppo mutante azhAΔ ngnAΔ, che porta delezioni in due geni, i cui prodotti sono implicati nella disintossicazione e nell'assimilazione del fitoprodotto tossico L-azetidina-2- acido carbossilico29, rispetto al ceppo WT. Misurando il loro tasso di crescita in colture liquide sommerse, rileviamo un tasso di crescita inferiore statisticamente significativo del doppio mutante rispetto al ceppo WT (t(715) = 20,61, p = <0.0001) (Figura 5A-B). Questa differenza di crescita non è stata rilevabile misurando solo l'area della colonia di questi ceppi (Figura 5C-D), sottolineando che l'analisi microscopica a singola cellula è più efficace nel determinare piccole differenze nei tassi di crescita che sono difficili da rilevare con l'osservazione macroscopica della colonia.
L'imaging dal vivo a lungo termine a singola cellula ha un valore significativo nello sforzo di ottenere informazioni spaziali e temporali sulla dinamica delle proteine cellulari. L'imaging a lungo termine di cellule vive (Figura 6, Video 1) della germinazione conidiale co-esprimendo la proteina eisosomiale centrale marcata GFP PilA e l'istone mRFP H1 mostra che PilA30 forma strutture statiche con bassa mobilità alla membrana plasmatica fungina31,32. Inoltre, la Figura 7 mostra che i coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per l'imaging dal vivo di ceppi coltivati su terreno agar, al fine di studiare la dinamica degli organelli e delle strutture cellulari. Qui, FM4-6433 è stato utilizzato per visualizzare la rete mitocondriale e il sistema vacuolare in A. nidulans.
Figura 1: Rappresentazione schematica della procedura di preparazione dell'inoculo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica della procedura seguita per l'imaging di funghi filamentosi che crescono su un mezzo agar. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione schematica della procedura seguita per l'imaging di funghi filamentosi che crescono in terreno liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione schematica della procedura di analisi delle immagini. Passaggi per l'elaborazione di immagini al microscopio time-lapse e la misurazione del tasso di crescita di A. nidulans. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Confronto delle misurazioni tradizionali della popolazione con le misurazioni a cella singola. (A) Immagini rappresentative al microscopio confocale di azhAΔ ngnAΔ double delezioni e ceppi WT, coltivati in colture liquide sommerse contenenti urea come unica fonte di azoto a 25 °C. Tutti i ceppi sono stati incubati per un totale di 18 ore, a 25 °C e i fotogrammi sono stati catturati a intervalli di 15 minuti. Le immagini di 2048 × 2048 pixel sono state raccolte con una dimensione dei pixel di 115,02 x 115,02 nm utilizzando un microscopio TCS SP8 MP (Leica, Germania) dotato di HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 oil immersion objective. (B) Le misure di (A) sono tracciate in appezzamenti di scatola e baffi. La significatività statistica è stata analizzata tramite t-Test ed è rappresentata da asterischi (***), che indicano p < 0,001. (C) Crescita a 25 °C di WT e doppia deformazione di delezione su MM solido. Le colonie sono state fotografate a diversi intervalli di tempo (18 h, 36 h e 72 h), calibrate spazialmente e misurate manualmente con un righello nel programma ImageJ. (D) Le misurazioni della superficie delle colonie presentate in (C) sono tracciate come trame a scatola e baffi. Le differenze dell'area delle colonie non erano statisticamente significative tra i diversi punti temporali del doppio mutante rispetto al ceppo WT (18h: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Imaging a lungo termine di cellule vive di proteine co-esprimenti di interesse con germinazione conidiale fuse con tag fluorescenti geneticamente codificati. (A) Proiezioni di intensità massima (MIP) di 4 fette generate nel piano z, di un ceppo coesposto PilA-GFP e H1-mRFP. I conidi sono stati individuati su terreno di agar e incubati per circa 1 ora a 30 °C al fine di favorire l'adesione delle cellule all'agar. Il blocco di agar contenente conidi è stato tagliato, posto in pozzetti di un μ-slide e incubato per un totale di 18 ore, a 30 °C. I fotogrammi sono stati catturati a intervalli di 25 minuti, utilizzando un microscopio TCS SP8 MP (Leica, Germania) dotato di obiettivo hc plan APO 63x, N.A. 1.40 ad immersione in olio (con una dimensione dei pixel di 92,26 x 92,26 nm). Le immagini sono state ottenute con GFP eccitante a lunghezza d'onda di 488 nm e rilevando la fluorescenza nella banda spettrale che va da 495 a 558 nm, e dall'eccitante mRFP a 561 nm di lunghezza d'onda e rilevando la fluorescenza nella banda spettrale che va da 580 a 660 nm. (B) Le misure (velocità di germinazione ed estensione della punta ifale) di (A) sono tracciate come grafico a linee. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Etichettatura FM4-64 delle ife che crescono su un terreno solido. I conidi di un ceppo WT sono stati coltivati su piastre di Petri MM di agar all'1% per 16 ore a 30 °C. I germling in crescita sono stati incubati per 20 minuti con 10 μL di MM contenenti 10 μM FM4-64. Dopo l'incubazione, un blocco di agar contenente germling macchiati è stato tagliato, posto in 8 μ-slide seguito da un inseguimento di 47 minuti a 30 ° C. I fotogrammi sono stati catturati ogni 7 minuti a 30 °C utilizzando un microscopio TCS SP8 MP dotato di obiettivo hc Plan APO 63x, N.A. 1.40 ad immersione in olio (con una dimensione dei pixel di 184,52 x 184,52 nm). Le immagini sono state ottenute emoitando FM4-64 a una lunghezza d'onda di 514 nm e rilevando la fluorescenza nella banda spettrale che va da 596 a 682 nm. Il segnale di fluorescenza FM4-64 viene mostrato come immagine invertita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Fasi iniziali della formazione del conidioforo. (A) I conidi del ceppo WT sono stati coltivati su terreno di agar per 136 ore a 30 °C, tagliati e posti in pozzezzeli di un μ-scivolo. I fotogrammi sono stati catturati ogni 20 minuti. Le immagini di 2048 × 2048 pixel sono state raccolte con una dimensione dei pixel di 245,2 x 245,2 nm utilizzando un microscopio TCS SP8 MP (Leica, Germania), dotato di HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 oil immersion objective. Le immagini mostrano la formazione di vescicole conidiofore (freccia nera) così come la formazione (freccia marrone) e la maturazione delle metulae (freccia blu). (B) Le misurazioni (velocità di germinazione ed estensione della punta ifale unipolare) di (A) sono tracciate come grafico a linee. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Imaging a lungo termine di cellule vive della germinazione conidiale co-esprimendo PilA-GFP e H1-mRFP. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Prime fasi della formazione di conidiofori in A. nidulans. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura S1: Preparazione della sospensione conidiale. Raschiando con uno stuzzicadenti sterile una superficie di circa1 cm 2 di una piastra conidiata, si ottiene una sospensione di circa 2 x10 6 conidi/ml. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è un approccio potente per valutare il comportamento cellulare in tempo reale e quantitativamente e determinare con precisione se un particolare trattamento farmacologico e / o intervento genetico si traduce in una crescita cellulare rilevabile o differenze fenotipiche nel tempo.
In questo studio, è stata descritta una metodologia affidabile di imaging a cellule vive per misurare e analizzare quantitativamente lo sviluppo fungino, compresa la dinamica della crescita del tubo germinale e della punta ifale in A. nidulans. Monitorare i cambiamenti morfologici nel tempo, utilizzando tecniche di microscopia ottica trasmessa, può essere molto utile per identificare le cellule stressate, morenti o morte. Una conoscenza dettagliata di tali processi dinamici a livello di singola cellula consente di valutare l'eterogeneità all'interno di una popolazione mista di cellule e in una prospettiva di lungo periodo, consente l'identificazione di percorsi e meccanismi dettagliati attraverso i quali le cellule rispondono ai segnali endogeni e ambientali.
Un vantaggio di questo metodo è che si basa su un approccio di imaging privo di etichette (che tuttavia può essere facilmente combinato con la microscopia a fluorescenza) che utilizza le proprietà intrinseche di rifrazione della luce delle cellule per creare un contrasto di immagine senza introdurre coloranti / etichette, che possono confondere i risultati. Mentre i marcatori fluorescenti possono essere utilizzati per etichettare compartimenti cellulari e proteine e facilitare significativamente la segmentazione e il tracciamento delle cellule, la microscopia ottica trasmessa aggira la necessità di cellule geneticamente modificate, consentendo ai ricercatori di evitare i costi e l'ottimizzazione del colorante / etichetta che richiede tempo e anche di evitare probabili effetti di fototossicità derivanti dall'imaging a fluorescenza13,34.
Questo protocollo è adatto per studiare la cinetica di crescita dei funghi che formano ife o pseudoife. Inoltre, questo approccio è altamente adatto per l'imaging di diverse strutture cellulari di diversi ceppi e in diversi stadi di sviluppo. Nella Figura 8 e nel Video 2,presentiamo le fasi iniziali dello sviluppo di A. nidulans conidiophore (cioè strutture portatrici di spore asessuate). Va notato, tuttavia, che questo metodo non è il più adatto per l'imaging della formazione di conidiofori, poiché la fame di carbonio / azoto e l'esposizione all'aria, entrambe necessarie per lo sviluppo di conidiofori, non possono essere standardizzate dal nostro approccio35.
Inoltre, questo protocollo è poco adatto per tracciare i biofilm fungini, che sono soggetti a estensione verticale formando una densa colonia eterogenea associata alla superficie composta da ife filamentose, cellule pseudoinfali, cellule a forma di lievito e varie forme di matrice extracellulare36. Un altro limite della tecnica è che, sebbene l'analisi microscopica label free rappresenti un metodo preciso per l'analisi qualitativa e quantitativa delle dinamiche di germinazione/differenziazione, la valutazione manuale di tali dati richiede molto tempo soprattutto quando vengono esaminati molti ceppi e/o condizioni. Pertanto, i dati provenienti dalla microscopia di imaging time-lapse ad alto rendimento dovrebbero essere analizzati da un software computazionale adatto che consenta l'analisi automatizzata o semi-automatizzata delle immagini dello sviluppo ifale e della germinazione conidiale37,38,39.
In sintesi, qui presentiamo un protocollo per analizzare la cinetica di crescita fungina in modo riproducibile e affidabile senza la necessità di alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell'utente. Questo protocollo consente una quantificazione oggettiva e accurata della crescita e della differenziazione dei funghi e fornisce un approccio di imaging complementare per studiare i cicli di vita dei funghi e la patogenicità fungina37.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal progetto "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) che è implementato nell'ambito dell'azione "Rafforzamento dell'infrastruttura di ricerca e innovazione", finanziato dal programma operativo "Competitività, imprenditorialità e innovazione" (NSRF 2014-2020) e cofinanziato dalla Grecia e dall'UE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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