Summary
Vi præsenterer en etiketfri live imaging protokol ved hjælp af transmitterede lysmikroskopi teknikker til at fange billeder, analysere og kvantificere vækst kinetik af filamentous svamp A. nidulans i både nedsænket kulturer og faste medier. Denne protokol kan bruges sammen med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Det er veletableret, at koloni vækst af filamentøse svampe, for det meste afhængig af ændringer i hyphae / mycelia apikale vækstrate, er makroskopisk anslået på størknede medier ved at sammenligne koloni størrelse. Det er imidlertid en udfordring kvantitativt at måle vækstraten for genetisk forskellige svampestammer eller -stammer under forskellige miljø-/vækstbetingelser (pH, temperatur, kulstof- og kvælstofkilder, antibiotika osv.). Således bliver forfølgelsen af komplementære tilgange til kvantificering af vækst kinetiker obligatorisk for bedre at forstå svampecellevækst. Desuden er det velkendt, at filamentøse svampe, herunder Aspergillus spp., har forskellige former for vækst og differentiering under sub-antenne betingelser på solide medier eller nedsænket kulturer. Her beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metode til analyse af vækstkinetik af modelsvampen Aspergillus nidulans, ved hjælp af levende billeddannelse i både nedsænkede kulturer og solide medier. Vi tager billeder, analyserer og kvantificerer vækstrater for forskellige svampestammer på en reproducerbar og pålidelig måde ved hjælp af en open source, gratis software til biobilleder (f.eks. Fiji), på en måde, der ikke kræver nogen forudgående billedanalyseekspertise fra brugeren.
Introduction
Filamentøse svampe er af stor socioøkonomisk og økologisk betydning, idet de begge er afgørende som industrielle / landbrugsmæssige værktøjer til enzym- og antibiotikaproduktion1,2 og som patogener af afgrødeplanter3,skadedyrsinsekter4 og mennesker3. Desuden er filamentøse svampe som Aspergillus nidulans meget udbredt som modelorganismer til grundforskning, såsom undersøgelser i genetik, celle- og evolutionær biologi samt til undersøgelse af hyphalforlængelse5. Filamentøse svampe er stærkt polariserede organismer, der forlænger gennem kontinuerlig forsyning af membran lipider / proteiner og de novo syntese af cellevæg ved den forlængende spids6. En central rolle i hyphal tip vækst og polaritet vedligeholdelse er en specialiseret struktur ved navn 'Spitzenkorper' (SPK), en højt bestilt struktur, der hovedsagelig består af cytoskeletale komponenter og polariseret distribution af Golgi6,7,8.
Miljømæssige stimuli / signaler, sådan vand-luft interface, lys, CO2 koncentration, og den ernæringsmæssige status er ansvarlige for de udviklingsmæssige beslutninger truffet af disse forme9. I nedsænkede (flydende) kulturer er differentiering af A. nidulans undertrykt, og væksten opstår ved hyphal tip elongation6. Under vegetativ vækst spirer aseksuel sporer (conidia) ved apikal udvidelse og danner et udifferentieret netværk af indbyrdes forbundne hyphalceller, myceliet, som kan fortsætte med at vokse på ubestemt tid, så længe næringsstoffer og plads er tilgængelige. På den anden side, på solide medier hyphal tips forlænge og efter en defineret periode med vegetativ vækst (udviklingskompetence), aseksuel reproduktion er indledt og antenne conidiophore stilke strækker sig fra specialiserede fodceller i mycelium6. Disse giver anledning til specialiserede udviklingsmæssige flercellede strukturer kaldet conidiophores, som producerer lange kæder af haploid conidia10, der kan genstarte væksten under gunstige miljøforhold.
En udbredt metode til måling af filamentøs svampevækst er at vaccinere sporer på næringsstof agar indeholdt i en petriskål og makroskopisk måle diameteren af kolonien et par dage senere11. Diameteren / området af kolonien, mest afhængig af ændringer i mycelial vækstrate og mindre på conidiophore tæthed12, bruges derefter som en værdi af vækst. Selvom måling af svampepopulationens (koloni) størrelse, der vokser på faste overflader, er helt tilstrækkelig, er det på ingen måde det mest nøjagtige mål for vækst. Sammenlignet med befolkningsgennemsnit (gennemsnit af svampekolonistørrelse) kan målinger af en enkelt celle fange en cellepopulations heterogenitet og gøre det muligt at identificere nye underpopulationer af celler, stater13, dynamik, veje samt de biologiske mekanismer, hvormed celler reagerer på endogene og miljømæssige ændringer14,15. Overvågning svampe cellevækst og fænotype ved time-lapse mikroskopi er velsagtens den mest udbredte kvantitative enkelt celle observation tilgang.
Heri beskriver vi en etiketfri live imaging protokol ved hjælp af transmitterede lysmikroskopiteknikker (såsom fasekontrast, differentialinterferenskontrast (DIC) og polariseret mikroskopi) for at fange billeder, som uafhængigt af den kombinerede brug af fluorescensmikroskopi kan anvendes til at analysere og kvantificere polarvæksten af A. nidulansstammer i både nedsænkede kulturer og faste medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inoculum forberedelse
BEMÆRK: Alle trin skal udføres under et laminar flow kabinet.
- Stime svampestammen af interesse ud, fra en glycerolbestand (-80 °C) ved hjælp af en steril podningsløkke, til plader af minimale medier (MM) suppleret med de relevante ernæringsmæssige krav, der er relevante for den undersøgte stamme [MM: 10,0 g/L glukose, 20 mL/L saltopløsning (saltopløsning: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L chloroform) og 1 mL/L sporstoffer (sporstoffer: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), juster pH til 6,8 med 1 M NaOH, tilsæt 1 % (w/v) agar og de krævede tillæg som beskrevet i16 og autoklave] (Figur 1).
BEMÆRK: Saltopløsning, sporstoffer opløsning og kosttilskud er autoklavet. - Inkuberes i 2-3 dage ved 37 °C.
- Brug en steril tandstikker (eller en podningsløkke), overfør et lille antal konidier ved forsigtigt at røre ved en enkelt koloni til plader af komplette medier (CM) [CM: 10,0 g/L glukose, 2,0 g/L peptone, 1,0 g/L gærekstrakt, 1,0 g/L casaminosyrer, 20 mL/L saltopløsning, 1 mL/L sporstoffer, 5 mL/L vitaminopløsning (vitaminopløsning: 0,1 g/L riboflavin, 0,1 g/L nicotinamid, 0,01 g/L p-amino benzoinsyre, 0,05 g/L pyridoxine HCl, 1,0 mg/L biotin), juster pH til 6,8 med 1 M NaOH, tilsættes 1 % (w/v) agar og de krævede tillæg som beskrevet i16 og autoklaven]. Autoklave og opbevar vitaminopløsningen i en mørk flaske ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvis svampevæksten er for tæt til at identificere og isolere individuelle kolonier, skal du re-streak på en ny agarplade for at opnå enkelte kolonier. - Inkuberes i 3-4 dage ved 37 °C.
- Opnå en konidial suspension på ca. 2 x 106 celler/mL ved at ridse 1 cm fra overfladen af en konificeret svampekoloni dyrket på CM agarplader ved hjælp af en steril tandstikker (figur S1).
BEMÆRK: Når det er nødvendigt, skal du tælle conidia med et hæmocytometer. - Høst conidia af A. nidulans i et sterilt 1,5 mL centrifugerør med 1,0 mL autoklavet destilleret vand indeholdende 0,05% (v/v) Tween 80 til reduktion af antallet af conidiaklumper.
BEMÆRK: Conidia kan opbevares i op til 2-3 uger ved 4 °C uden et relevant tab af rentabilitet (A. Athanasopoulos og V. Sophianopoulou, ikke-offentliggjorte data). Det anbefales dog at filtrere og/eller vaske konidial suspension for at fjerne myceliale dele og næringsstoffer for at forhindre konidial hævelse.
2. Forberedelse til billeddiagnostiske filamentøse svampe, der vokser på agar (faste) medier
BEMÆRK: En modificeret version af den omvendte agarmetode17,18 anvendes.
- I første omgang skal der i første omgang være 10 μL aliquots af kraftigt hvirvlet konidial (ca. 2 x 104 celler/mL) flere steder på petriskåle (Ø9 cm) 15 mm mm med 1% (w/v) agar (figur 2).
BEMÆRK: Ved hjælp af den modificerede version af den 'omvendte agarmetode' er det muligt at afbilde svampeprøver i mange timer uden tilsyneladende skadelige virkninger på voksende hyphae. - Inkuber den eksperimentelle kultur i henhold til udviklingsstadiet, der er beregnet til at blive undersøgt.
- Skær en ≈0,8 mm2 blok af agar, der indeholder kolonien ved hjælp af en steril skalpel.
BEMÆRK: Dimensionerne af den agarblok, der skal skæres ud, afhænger af dimensionerne af det udstyr, der skal placeres bagefter. I det foreliggende værk anvendes der 8 μ dias (se nedenfor). - Inverter og placere agar blok i en brønd af en μ-slide eller lignende 8 chambered coverglass med coverlip egnet til levende billeddannelse.
BEMÆRK: I tilfælde transmitteret lysmikroskopi vil blive brugt i kombination med fluorescens (mærkning) mikroskopi, kan agarblokken vendes på en dråbe flydende medium, der indeholder det levende cellefarvningsfarvestof, lige før billeddannelse.
3. Forberedelse til billeddiagnose filamentøse svampe, der vokser på flydende medium
- Overfør 10 μL aliquots af en kraftigt hvirvlet konidial suspension (ca. 2 x 104 celler/mL) i brøndene i en 8 brønd μ-slide indeholdende 200 μL (flydende) MM med de relevante tillæg (se ovenfor).
- Inkuber i den ønskede tid ved den ønskede temperatur (Figur 3).
BEMÆRK: Hvis der anvendes transmitteret lysmikroskopi i kombination med fluorescens (mærkning) mikroskopi, har flydende kulturer den store fordel, at fluorescerende farvestoffer kan tilsættes på ethvert ønsket tidspunkt under eksperimentet19.
4. Tag billeder
BEMÆRK: Valget af mikroskop afhænger af det tilgængelige udstyr. Under alle omstændigheder bør mikroskopopsætningen omfatte et omvendt stadium, et miljøkammer eller i det mindste et rum med præcis lufttemperaturkontrol.
- Forvarm det termostaterede mikroskopkammer ved 37 °C (medmindre andet er angivet eller som egnet til de anvendte svampearter) for at stabilisere temperaturen, inden temperaturen påbegyndes. Dette kammer tillader temperaturmodulering af mikroskopoptik og prøvefase under tidsforseende eksperimenter. Vær opmærksom på, at optiske afvigelser20 indføres, når der anvendes normale nedsænkningsolier (beregnet til brug ved 23 °C) olier ved 37 °C eller derover.
BEMÆRK: På et stramt budget kan inkubationskamre laves af pap og isolerende emballage21 eller ved hjælp af en 3D-printer22. - Tænd mikroskopet, scanneren magt, laser magt og computer, og indlæse billedbehandling software. Placer μ-slide (forberedt tidligere) i mikroskop fase og fokus.
- Find synsfelter, der indeholder isolerede/ikke overlappende celler (eller i det mindste ikke overfyldte) for at lette vækstmålinger under billedanalyse. Fang mindst 50 voksende celler pr. prøve for at muliggøre en robust statistisk analyse.
- Vælg den ønskede tilgang til transmitteret lysmikroskopi. Reducer eksponeringstiden eller laserkraften og pixelbebo tiden og/eller forøg pinhole-diametre for at minimere fotografering af svampeceller, som beskrevet andetsteds 23,24.
- Indstil mikroskop til at erhverve billeder med ønskede tidsintervaller og starttidspunkt serie erhvervelse.
BEMÆRK: For at korrigere for brændpunkt drift over tid (især for lange eksperimenter), på grund af termisk drift, forskellige cellestørrelser, og celle bevægelse bruge en autofokus strategi, hvis de er tilgængelige i dit mikroskop software.
5. Billedanalyse
BEMÆRK: I dette afsnit beskrives de vigtigste trin i behandlingen af time-lapse mikroskopibilleder til måling af vækstraten for A. nidulans. Åbning, visualisering og behandling af billeder udføres med open source ImageJ / Fiji software25.
- Importer billederne til Fiji ved hjælp af plugins | Bioformater | Bioformater Importør fra Fiji-menuen med standardindstillinger (Figur 4A).
BEMÆRK: Kontroller, om bioformatimportøren genkender billedkalibreringen korrekt. Den billeddimension, der vises i billedvinduet for de øverste oplysninger, skal være lig med de oprindelige billeddimensioner (Figur 4B). Tryk på Skift + P for at få vist og ændre billedegenskaber i ImageJ/Fiji-software. - Hvor det er nødvendigt, skal du bruge histogramme, der matcher26, til belysningskorrektion mellem forskellige rammer (Billede | Juster | Bleach korrektion | Histogram Matching) (Figur 4C).
- Hvor det er nødvendigt, skal du bruge SIFT-algoritme (Plugins | Tilmelding | Lineær stakjustering med SIGTEFT) til justering eller sammenholdelse af billedstakke (figur 4D). Hvis du vælger "Oversættelse" i den forventede transformationsmenu, skal det være nok til at rette enhver x-y-drift.
BEMÆRK: Andre plugins kan også bruges til at justere en stak billedudsnit, https://imagej.net/Image_Stabilizer f.http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ eks. - Vælg hyfan, der vokser parallelt med coverlip, så du undgår dem, der vippes. Sørg for at vælge hyphae, der formerer sig med polar forlængelse og undgå hyphae præsentere laterale og / eller apikale forgrening.
- Brug MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin til at spore voksende hyphal tips (Figur 4E)27. Hvis du vil tilføje et spor, skal du markere knappen Tilføj på værktøjslinjen og placere det første punkt ved en hyfalspids ved hjælp af musens venstre klik. Tidsserien flyttes automatisk til den næste ramme. Dobbeltklik på musen på det sidste punkt (eller tryk på Esc-tasten) (Figur 4F)for at fuldføre sporingsprocessen. Flyt til et andet interessepunkt (dvs. voksende hyfalspids) inden for den indledende tidsramme, og genstart proceduren ved at måle vækstraten for en anden hypha.
BEMÆRK: Hvis du vil installere MTrackJ, skal du følge vejledningen på https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Klik på knappen Målpunkt i dialogboksen MTrackJ (Figur 4G) for at åbne outputtabellen. Gem spormålinger (fil | Gem som) i det ønskede filformat (f.eks. csv), analyser og plot dem (Figur 4H).
BEMÆRK: Ved at vælge knappen Film produceres der en film, der viser billedet og sporforløbet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter denne protokol fangede og analyserede vi forskellige billeder svarende til forskellige vækst / udviklingsstadier af filamentøs svamp A. nidulans. De data, der præsenteres i denne undersøgelse blev behandlet og analyseret ved hjælp af Fiji software. Målinger blev gemt som csv-filer, statistisk analyseret og udarbejdet som grafer ved hjælp af kommerciel statistisk software og / eller Python programmeringssprog ved hjælp af softwarebiblioteker som pandaer, numpy, statsmodeller, matplotlib og søfødt. Flere detaljer kan findes i de citerede originale publikationer.
For at fortolke populationernes reaktion er det vigtigt at bestemme heterogeniteten af nøgleparametre inden for populationerne og effektivt identificere fysiologisk forskellige delpopulationer28. Figur 5 viser væksten af azhAΔ ngnAΔ mutant stamme, forsynet med sletninger i to gener, hvis produkter er impliceret i afgiftning og assimilering af det giftige phytoproduct L-azetidin-2- carboxylic syre29, i sammenligning med WT-stammen. Måling af deres vækstrate i neddykkede flydende kulturer, vi registrerer en statistisk signifikant lavere vækstrate for den dobbelte mutant i forhold til WT stamme (t(715) = 20,61, p = <0.0001) (Figur 5A-B). Denne forskel i vækst var ikke påviselig måle kun koloni område af disse stammer (Figur 5C-D), understreger, at mikroskopiske enkelt celle analyse er mere effektiv til at bestemme små forskelle i vækstrater, der er vanskelige at opdage med makroskopisk observation af kolonien.
Enkeltcellet langsigtet levende billeddannelse er af betydelig værdi i bestræbelserne på at opnå rumlige og tidsmæssige oplysninger om cellulær proteindynamik. Langsigtet levende cellebilleddannelse (Figur 6, Video 1) af konidialspiration, der udtrykker det GFP-mærkede kerne eisosomalprotein PilA og mRFP-histone H1 , viser , at PilA30 danner statiske strukturer med lav mobilitet ved svampeplasmamembran31,32. Desuden viser figur 7, at fluorescerende farvestoffer kan anvendes til levende billeddannelse af stammer dyrket på agar medium, for at studere dynamikken i organeller og cellestrukturer. Her blev FM4-6433 brugt til at visualisere mitokondrienetværk og vakuolarsystemet i A. nidulans.
Figur 1: Skematisk repræsentation af inoculumforberedelsesproceduren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk repræsentation af den procedure, der følges for billeddiagnostiske filamentøse svampe, der vokser på agarmediet.
Figur 3: Skematisk repræsentation af den procedure, der følges for billeddiagnostiske filamentøse svampe, der vokser i flydende medium.
Figur 4: Skematisk repræsentation af billedanalyseproceduren. Trin til behandling af time-lapse mikroskopi billeder og måling af vækstraten af A. nidulans. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenligning af traditionelle befolkningsmålinger med enkeltcellemålinger. (A) Repræsentative konfokale mikroskopibilleder af azhAΔ ngnAΔ dobbeltsletnings- og WT-stammer, der dyrkes i neddykkede flydende kulturer, der indeholder urinstof som eneste kvælstofkilde ved 25 °C. Alle stammer blev inkuberet i alt 18 timer ved 25 °C, og rammer blev fanget med 15 minutters mellemrum. Billeder af 2048 × 2048 pixels blev indsamlet med en pixelstørrelse på 115,02 x 115,02 nm ved hjælp af et TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop udstyret med HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olie nedsænkningsmål. (B) Målinger af (A) er afbildet i kasse-og-whiskers plots. Statistisk signifikans blev analyseret via t-Test og er afbildet med stjerner (***), der angiver p < 0,001. (C) Vækst ved 25 °C WT og dobbelt sletningsbelastning på faste MM. Kolonier blev fotograferet med forskellige tidsintervaller (18 timer, 36 timer og 72 timer), rumligt kalibreret og målt manuelt med en lineal i ImageJ-programmet. (D) Målinger af det område af kolonier, der præsenteres i (C) er afbildet som box-and-whiskers parceller. Forskellene i koloniområdet var ikke statistisk signifikante mellem de forskellige tidspunkter for den dobbelte mutant sammenlignet med WT-stammen (18 timer: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Langsigtet levende cellebilleddannelse af konidialspiratoriske spirende spirende proteiner af interesse smeltet sammen med genetisk kodede fluorescerende tags. (A) Maksimale intensitetsfremskrivninger (MIP) på 4 skiver, der er genereret i z-flyet, af en stamme, der udtrykker PilA-GFP og H1-mRFP. Conidia blev spottet på agarmedium og inkuberet i ca. 1 time ved 30 °C for at hjælpe vedhæftningen af cellerne til agaren. Agarblokken, der indeholder conidia, blev skåret ud, anbragt i brønde af en μ-rutsjebane og inkuberet i alt 18 timer ved 30 °C. Rammer blev fanget med 25 min intervaller, ved hjælp af en TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop udstyret med HC Plan APO 63x, NC 1,40 olie nedsænkning mål (med en pixel størrelse på 92,26 x 92,26 nm). Billeder blev opnået ved spændende GFP ved 488-nm bølgelængde og detektering af fluorescens i spektralbåndet fra 495 til 558 nm og ved spændende mRFP ved 561 nm bølgelængde og detektering af fluorescens i spektralbåndet fra 580 til 660 nm. (B) Målinger (hastighed af spiring og hyphal spids forlængelse) af (A) er afbildet som linje graf. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: FM4-64 mærkning af hyphae, der vokser på fast medium. Conidia af en WT stamme blev dyrket på 1% agar MM Petri retter i 16 timer ved 30 °C. De voksende bakterier blev inkuberet i 20 min med 10 μL MM indeholdende 10 μM FM4-64. Efter inkubation blev en agarblok med farvede kimudsnit skåret ud, anbragt i 8 μ-slide efterfulgt af en 47 minutters jagt ved 30 °C. Rammer blev fanget hvert 7. minut ved 30 °C ved hjælp af et TCS SP8 MP mikroskop udstyret med HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 olie nedsænkningsmål (med en pixelstørrelse på 184,52 x 184,52 nm). Billeder blev opnået ved spændende FM4-64 ved 514-nm bølgelængde og detektering af fluorescens i spektralbåndet fra 596 til 682 nm. FM4-64 fluorescenssignalet vises som omvendt billede. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Tidlige stadier af conidiophore dannelse. (A) Conidia af WT stamme blev kultiveret på agar medium i 136 timer ved 30 °C, skåret ud og placeret i brønde af en μ-slide. Rammer blev fanget hvert 20. minut. Billeder af 2048 × 2048 pixels blev indsamlet med en pixelstørrelse på 245,2 x 245,2 nm ved hjælp af et TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop, udstyret med HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 olie nedsænkning mål. Billeder viser dannelsen af conidiophore vesikler (sort pil) samt dannelsen (brun pil) og modning af metulae (blå pil). (B) Målinger (spiringshastighed og unipolar hyphalspidsudvidelse) af (A) afbildes som linjegraf. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Langsigtet levende celle billeddannelse af konidial spiring co-udtrykke PilA-GFP og H1-mRFP. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Tidlige stadier af conidiophore formationin A. nidulans. Klik her for at downloade denne video.
Figur S1: Forberedelse af konidial suspension. Ved skrabning med en steril tandstikker opnås en ca. 1 cm2 overflade af en konidieret plade, opnås en suspension på ca. 2 x 106 conidia / ml. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overvågning svampecellevækst og fænotype ved time-lapse mikroskopi er en kraftfuld tilgang til at vurdere cellulære adfærd i realtid og kvantitativt og præcist afgøre, om en bestemt lægemiddelbehandling og / eller genetisk intervention resulterer i påviselig cellevækst eller fænotypiske forskelle over tid.
I denne undersøgelse blev en pålidelig live-celle billeddannelsesmetode beskrevet til at måle og kvantitativt analysere svampeudvikling, herunder dynamikken i kimrør og hyphal tipvækst i A. nidulans. Overvågning morfologiske ændringer over tid, ved hjælp af transmitteret lys mikroskopi teknikker, kan være meget nyttigt at identificere celler, der er stressede, døende eller døde. Et detaljeret kendskab til sådanne dynamiske processer på enkeltcelleniveau gør det muligt at vurdere heterogenitet i en blandet population af celler og i et langsigtet perspektiv gør det muligt at identificere veje og detaljerede mekanismer, hvorved celler reagerer på endogene og miljømæssige signaler.
En fordel ved denne metode er, at den er baseret på en etiketfri billeddannelsesmetode (som ikke desto mindre let kan kombineres med fluorescensmikroskopi), der bruger iboende lysbrydningsegenskaber for celler til at skabe billedkontrast uden at indføre farvestoffer / etiketter, hvilket kan forvirre resultaterne. Mens fluorescerende markører kan bruges til at mærke cellulære rum og proteiner og betydeligt lette segmentering og sporing af celler, overføres lysmikroskopi omgår behovet for genetisk engineering celler, så forskerne kan undgå omkostningerne og tidskrævende farvestof / etiket optimering og også for at undgå sandsynlige fototoksicitet virkninger, der kommer fra fluorescens imaging13,34.
Denne protokol er velegnet til at studere vækst kinetika af svampe, der danner hyphae eller pseudohyphae. Desuden er denne tilgang meget velegnet til billeddannelse forskellige cellestrukturer af forskellige stammer og under forskellige udviklingsstadier. I figur 8 og Video 2præsenterer vi de indledende faser af A. nidulans conidiophore (dvs. strukturer, der bærer aseksuel sporer) udvikling. Det skal dog bemærkes, at denne metode ikke er den mest egnede til billeddannelse af conidiophore dannelse, da kulstof / kvælstof sult og lufteksponering, begge er nødvendige for udviklingen af conidiophores, ikke kan standardiseres ved vores tilgang35.
Derudover er denne protokol dårligt egnet til at spore svampebiofilm, som er underlagt lodret udvidelse, der danner en tæt heterogen, overfladerelateret koloni bestående af filamentøs hyphae, pseudohyphalceller, gærformceller og forskellige former for ekstracellulær matrix36. En anden begrænsning af teknikken er, at selv om etiketfri mikroskopisk analyse repræsenterer en præcis metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af spirings-/differentieringsdynamikken, er manuel evaluering af sådanne data tidskrævende, især når man undersøger mange stammer eller/og betingelser. Således bør data fra høj-throughput time-lapse imaging mikroskopi analyseres ved passende beregningssoftware muliggør automatiseret eller semi-automatiseret billedanalyse af hyphal udvikling og konidial spiring37,38,39.
Sammenfattende præsenterer vi heri en protokol til analyse af svampevækst kinetik på en reproducerbar og pålidelig måde uden behov for nogen forudgående billedanalyseoplevelse fra brugeren. Denne protokol giver mulighed for objektiv og præcis kvantificering af svampevækst og differentiering og giver en supplerende billeddannelsesmetode til undersøgelse af svampelivscyklusser og svampepatogenitet37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af projektet "En græsk forskningsinfrastruktur til visualisering og overvågning af grundlæggende biologiske processer (BioImaging-GR)" (MIS 5002755), som gennemføres under aktionen "Styrkelse af forsknings- og innovationsinfrastrukturen", finansieret af det operationelle program "Konkurrenceevne, iværksætteri og innovation" (NSRF 2014-2020) og medfinansieret af Grækenland og EU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
