Summary
透過光顕微鏡技術を用いたラベルフリーのライブイメージングプロトコルを提示し、水没培養物と固体培地の両方で、画像を撮影し、糸状菌 A.ニドゥラン の成長速度を分析し、定量化します。このプロトコルは蛍光顕微鏡法と共に使用することができる。
Abstract
糸状菌のコロニー増殖は、主にヒファエ/ミセリアの上端成長速度の変化に依存し、コロニーサイズを比較することによって固化した培地上でマクロ的に推定される。しかし、異なる環境/成長条件下での遺伝的に異なる真菌株または株(pH、温度、炭素および窒素源、抗生物質など)の増殖速度を定量的に測定することは困難である。したがって、成長速度を定量化するための補完的なアプローチの追求は、真菌細胞の成長をよりよく理解するために必須となる。さらに、アスペルギルスspp.を含む糸状菌は、固体培地または水没培養物上のサブ空中条件下での成長と分化の明確な様式を有することがよく知られている。ここでは、水没培養物と固体培地の両方で生画像化を用いて、モデル菌 アスペルギルスニデュランの成長動態を解析するための定量的な顕微鏡的方法を詳述する。私たちは、ユーザーからの事前の画像解析の専門知識を必要としない方法で、オープンソース、バイオイメージ(フィジーなど)のためのフリーソフトウェアを使用して、再現可能で信頼性の高い方法で異なる真菌株の成長速度をキャプチャし、分析し、定量化します。
Introduction
糸状菌は、酵素および抗生物質生産1、2、作物植物3、害虫昆虫4およびヒト3の病原体のための産業/農業用具として重要であること、社会経済的、生態学的に重要な大きな社会経済的、生態学的重要性を持つ。また、アスペルギルスニデュランなどの糸状菌は、遺伝学、細胞、進化生物学の研究や、ヒュファル拡張5の研究などの基礎研究のモデル生物として広く使用されている。糸状菌は、膜脂質/タンパク質の連続供給と延伸先端部の細胞壁のデノボ合成を通じて伸びる高度に偏光した生物である6。催眠先端の成長と極性維持における中心的な役割は、細胞骨格成分とゴルジ6、7、8の偏光分布を主に構成する高度に順序付けられた構造である「スピッツェンコルパー」(SPK)という特殊な構造です。
環境刺激/信号、水と空気の界面、光、CO2 濃度、栄養状態は、これらの金型9によって行われた発達上の決定に責任を負う。水没(液体)培養では 、A.ニデュラン の分化が抑圧され、ヒファル先端伸長6によって成長が起こる。栄養成長の間、無性胞子(コニディア)は、補助的な拡張によって発芽し、相互接続された催眠細胞、菌糸体の未分化ネットワークを形成し、栄養素および空間が利用可能である限り無限に増殖し続ける可能性がある。一方、固体培地の催眠のヒントは、栄養成長(発達能力)の定義された期間(発達能力)の後に、無性生殖が開始され、空気共生茎が菌糸体6の特殊な足細胞から伸びる。これらは、有利な環境条件下で成長を再開することができるハプロイドコニディア10 の長い鎖を生成するコニジオフォアと呼ばれる特殊な発達多細胞構造を生み出す。
糸状菌の成長を測定するために広く使用されている方法は、ペトリ皿に含まれる栄養寒天上の胞子を接種し、数日後にコロニーの直径をマクロコスコープで測定する。コロニーの直径/面積は、最も、心の成長速度の変化に依存し、コニディオフォア密度12に少ない、成長の値として使用されます。しかし、固体表面上に成長する真菌集団(コロニー)サイズを測定することは非常に適切であるが、それは決して最も正確な成長の尺度ではない。集団レベル平均(真菌コロニーサイズの平均)と比較して、単一細胞測定は、細胞集団の不均一性を捕捉し、細胞の新しいサブ集団、状態13、ダイナミクス、経路、ならびに細胞が内因性および環境変化に応答する生物学的メカニズムを同定することを可能にする14、15。タイムラプス顕微鏡による真菌細胞の増殖および表現型をモニタリングすることは、おそらく最も広く使用されている定量的単一細胞観察アプローチである。
ここでは、透過光顕微鏡技術(位相コントラスト、微分干渉コントラスト(DIC)、偏光顕微鏡など)を用いたラベルフリーライブイメージングプロトコルを詳述し、蛍光顕微鏡の併用とは無関係に、水没培養物と固体培地の両方でのA. ニドゥラン 株の極性成長を分析し定量することができる画像を取り込む。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 接種製剤
注: すべてのステップは、層流キャビネットの下で実行する必要があります。
- 目的の真菌株をストリークアウトし、無菌接種ループを使用したグリセロールストック(-80°C)から、検査された株に関連する適切な栄養要件を補った最小培地(MM)のプレートに[MM:10.0 g/Lグルコース、20 mL/L塩溶液(塩溶液:26 g/L KCl、26g/L MgSO4H、26g/L MgSO4H、 76 g/L KH2PO 4、2.0 mL/L クロロホルム)および 1 mL/L トレースエレメント (トレース要素: 40 mg/L Na2B4O7·H2O, 400 mg/L CuSO4,8 g/L ZnSO 4, 800 mg/L MnSO4,800 mg/L FePO4),1 M NaOHで pH を 6.8 に調整, 1 % (w/v) 寒天と必要なサプリメントを加えて 1 6とオートクレーブ] (図 1)。
注:塩溶液、微量元素溶液およびサプリメントはオートクレーブされています。 - 37°Cで2〜3日間インキュベートする。
- 滅菌爪楊枝(または接種ループ)を使用し、少数のコニディアを移し、 単一のコロニーに優しく触れることで、完全な培地(CM)のプレートに[CM:10.0 g/Lグルコース、2.0 g/Lペプトン、1.0 g/Lカザアミノ酸、20 mL/L塩溶液、1 mL/L微量元素、5 mL/Lビタミン溶液(ビタミン溶液:ビタミン溶液:1.0g/Lグルコース)に 0.1 g/L リボフラビン、 0.1 g/L ニコチンアミド、 0.01 g/L p-アミノ安息香酸、 0.05 g/L ピリドキシン HCl、1.0 mg/L ビオチン、1 M NaOH で pH を 6.8 に調整し、1%(w/v) 寒天とオートベに記載されている必須サプリメントを加える4°Cの暗いびんにビタミン液を詰め、保存してください。
注:真菌の成長が個々のコロニーを識別して分離するにはあまりにも密である場合は、単一のコロニーを得るために新しい寒天プレートに再ストリーク。 - 37°Cで3〜4日間インキュベートする。
- CM寒天プレート上で成長した結膜状の真菌コロニーの表面から1cmを掻き取ることによって、約2 x 106細胞/mLの円錐状懸濁液を得る、無菌爪楊枝を用いた(図S1)。
注:必要に応じて、ヘモサイトメーターでコニディアを数えます。 - A.ニデュランの収穫コニディアは、コニディア塊の数を減らすために0.05%(v/v)Tween 80を含む1.0mLのオートクレーブ蒸留水を有する無菌1.5 mL遠心分離管で収穫する。
注意:コニディアは、生存率の関連損失(A.アタナソプロスとV.ソフィアノプーロウ、未公開のデータ)の4°Cで最大2〜3週間保存することができます。しかし、心筋の腫れを防ぐために、心座の部分や栄養素を除去するために、耳間の懸濁液を濾過および/または洗浄することをお勧めします。
2. 寒天(固体)培地上で増殖する糸状菌のイメージング用製剤
注: '逆方寒天法17,18の変更されたバージョンが使用されます。
- 当初、ペトリ皿(Ø9 cm)15mLのMMの1%(w/v)寒天の上の数ポイントで、激しく渦状の円錐(約2 x 104セル/mL)の10 μLアリコートを見つける(図2)。
注:「逆天寒天法」の変更されたバージョンを使用して、ヒファエの成長に明らかな有害な影響を及ぼすことがなく、何時間も真菌サンプルを画像化することが可能です。 - 実験培養を調査対象とする発達段階に従ってインキュベートする。
- 滅菌メスを使用してコロニーを含む寒天の≈0.8 mm2 ブロックをスライスします。
注: スライスする寒天ブロックの寸法は、その後配置する機器の寸法によって異なります。現在の作品では、8つのウェルμスライドが使用されています(下記参照)。 - 生画像に適したカバースリップ付きのμスライドまたは同様の8室カバーグラスの井戸に寒天ブロックを反転して配置します。
注:透過光顕微鏡が蛍光(標識)顕微鏡と組み合わせて使用される場合、寒天ブロックは、イメージングの直前に、生細胞染色を含む液体培地の液滴に反転させることができます。
3. 液体培地上で増殖する糸状菌のイメージング用製剤
- 適当なサプリメント(上記参照)を含む8ウェルμスライドのウェルμスライドのウェルに、激しく渦状の円錐状サスペンション(約2 x 104 細胞/mL)の10 μLアリコートを移す。
- 所望の温度で所望の時間をインキュベートする(図3)。
注:透過光顕微鏡が蛍光(標識)顕微鏡法と組み合わせて使用される場合、液体培養物は実験19の間に任意の所望の時点で蛍光色素を添加できるという大きな利点を有する。
4. キャプチャ画像
メモ:顕微鏡の選択は、利用可能な機器によって異なります。いずれの場合も、顕微鏡のセットアップは、反転ステージ、環境室または少なくとも正確な温度制御を持つ部屋を含める必要があります。
- 温度記した顕微鏡室を37°C(特に示されていないか、または使用された真菌種に適していない限り)に予熱して、開始前に温度を安定させます。このチャンバーは、タイムラプス実験中に顕微鏡光学とサンプルステージの温度調節を可能にします。光学収差20 は、通常の浸漬油(23°Cで使用するように設計された)油が37°C以上で使用される場合に導入される点に注意してください。
注:厳しい予算では、インキュベーションチャンバーは、段ボールと絶縁梱包材21 から、または3Dプリンタ22を使用して作ることができます。 - 顕微鏡、スキャナーの電源、レーザーパワー、コンピュータをオンにし、イメージングソフトウェアをロードします。μスライド(前に準備)を顕微鏡の段階に置き、焦点を合わせます。
- 画像解析中の成長測定を容易にするために、孤立/重複していない(または少なくとも過密ではない)細胞を含む視野を見つけます。サンプルあたり少なくとも50個の増殖セルをキャプチャして、堅牢な統計分析を可能にします。
- 希望の透過光顕微鏡アプローチを選択します。露光時間またはレーザー電力を低減し、ピクセルのドウェル時間および/またはピンホール径を増加させると、他の場所で説明するように、真菌細胞の光の切開を最小限に抑えるために、23、24。
- 所望の時間間隔で画像を取得し、時系列取得を開始する顕微鏡を設定します。
注: 時間の経過に伴う焦点ドリフト(特に長い実験)を補正するには、熱ドリフト、多様なセルサイズ、および細胞運動のために、顕微鏡ソフトウェアで利用可能な場合はオートフォーカス戦略を使用します。
5. 画像解析
注: このセクションでは 、A. ニデュランの成長率を測定するためのタイムラプス顕微鏡画像の処理の重要な手順について説明します。画像の開く、視覚化と処理は、オープンソースのImageJ / フィジーソフトウェア25で達成されます。
- プラグイン|を使用してフィジーに画像をインポートします。バイオフォーマット|デフォルト設定のフィジーメニューのバイオフォーマット輸入者(図 4A)。
メモ:バイオフォーマットインポーターが画像キャリブレーションを正しく認識しているかどうかを確認してください。上部の情報フィールドの画像ウィンドウに表示されるピクチャー寸法は、元の画像の寸法と等しくなければなりません (図 4B)。Shift + Pキーを押して、ImageJ/Fiji ソフトウェアのイメージ プロパティを表示および変更します。 - 必要に応じて、異なるフレーム間の照明補正にヒストグラムマッチング26 を使用||を調整する漂白剤補正|ヒストグラムマッチング) (図 4C)
- 必要に応じて、SIFTアルゴリズム(プラグイン|登録|SIFT を使用した線形スタックの位置合わせ(画像スタックの位置合わせまたは一致を行う)(図4D)。必要な変換メニューから [翻訳] を選択すると、x-y ドリフトを修正できます。
注:他のプラグインは、イメージスタビライザー(https://imagej.net/Image_Stabilizer)やStackReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)などのイメージスライスのスタックを整列するためにも使用できます。 - 傾斜したものを避けて、カバースリップに平行に成長するヒファエを選択します。極性延長によって伝播するヒファエを選択し、ヒファエが横方向および/または尖形の分岐を提示するのを避けてください。
- MTrackJ (プラグイン|を使用します。MTrackJ)プラグインは、成長する催眠のヒントを追跡します (図 4E)27.トラックを追加するには、ツールバーの[追加]ボタンを選択し、マウスの左クリックを使用して、最初のポイントを催眠先端に配置します。時系列は自動的に次のフレームに移動します。追跡処理を完了するには、最後のポイントでマウスをダブルクリックします (または Esc キーを押します) (図 4F)。最初の時間枠で別の目的のポイント(すなわち、催眠先端の成長)に移動し、別の催眠の成長速度を測定することによって手順を再開します。
注:MTrackJをインストールするには、https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ に記載されている手順に従ってください - MTrackJ ダイアログボックスの測定ボタン (図 4G)をクリックして、出力テーブルを開きます。トラックの測定値を保存する (ファイル |目的のファイル形式(csvなど)に保存し、それらを分析してプロットします(図4H)。
注: [ムービー ] ボタンを選択すると、画像とトラックの進行状況を示すムービーが作成されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルに従って、フィラメント菌 A.ニドゥランの異なる成長/発達段階に対応する様々な画像をキャプチャし、分析しました。この調査で提示されたデータは、フィジーのソフトウェアを使用して処理および分析されました。測定値はcsvファイルとして保存され、統計的に分析され、パンダ、numpy、statsmodel、matplotlib、seabornなどのソフトウェアライブラリを使用して、商業統計ソフトウェアおよび/またはPythonプログラミング言語を使用してグラフとして準備されました。詳細は、引用されたオリジナル出版物に記載されています。
集団の応答を解釈するためには、集団内の主要パラメータの不均一性を決定し、生理学的に異なる亜集団28を効率的に同定することが重要である。図5は、azhA ΔngnAΔ変異株の成長を示し、2つの遺伝子における軸受欠失は、その生成物が、毒性植物性L-アゼチジン-2−カルボン酸29の解毒および同化に関与している、WT株と比較して示す。水没した液体培養物の成長率を測定して、WT株(t(715)=20.61、p=<0,0001)と比較して、二重突然変異体の統計的に有意な低成長率を検出する(図5A-B)。この成長の違いは、これらの株のコロニー面積のみを測定して検出できなかった(図5C-D)、コロニーの巨視的観察では検出困難な増殖速度の小さな違いを決定する際に顕微鏡的な単一細胞分析がより効果的であることを強調した。
単一細胞の長期ライブイメージングは、細胞タンパク質ダイナミクスの空間的および時間的な情報を得る努力において有意な価値がある。GFP標識コアアイソソームタンパク質PilAとmRFPヒストンH1を共同発現する共像的な放射能の長期生細胞イメージング(図6、ビデオ1)は、PilA30が真菌形質形質膜31,32において低移動性を有する静的構造を形成することを示す。また、図7は、細胞組織や細胞構造の動態を研究するために、寒天培地上で増殖した株の生画像化に蛍光色素を用いることができることを示す。ここで、FM4-6433は、A.ニドゥランにおけるミトコンドリアネットワークおよび真空系を可視化するために使用された。
図1:接種調製手順の概略図 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:寒天培地上で増殖する糸状菌を撮影するための手順の模式的な表現。
図3:液体培地で成長する糸状菌を撮影するための手順の模式的な表現。この図のより大きなバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
図4: 画像解析手順の概略図 時間経過顕微鏡画像を処理し 、A. ニドゥランの成長率を測定するためのステップ. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:従来の母集団測定値と単一細胞測定値の比較(A)25°Cで単独の窒素源として尿素を含む液状液体培養液中で成長したazhA ΔngnAΔ二重欠失およびWT株の代表的な共焦点顕微鏡画像。 全ての株を合計18時間インキュベートし、25°Cでフレームを15分間隔で捕捉した。2048 × 2048 ピクセルの画像は、HC プラン APO 63x、N.A. 1.40 オイル浸漬目的を搭載した TCS SP8 MP (ライカ、ドイツ) 顕微鏡を使用して、ピクセル サイズ 115.02 x 115.02 nm で収集しました。(B)(A)の測定値は箱ひげ図でプロットされます。統計的有意性はt検定を介して分析され、0.001
図6:遺伝的にコードされた蛍光タグと融合した、目的の円錐発芽共発現タンパク質の長期生細胞イメージング(A)Z平面で生成された4つのスライスの最大強度投影(MIP)、株の共発現ピルA-GFPとH1-mRFP.コニディアは、寒天培地上で発見され、細胞を寒天に接着するのを助けるために30°Cで約1時間インキュベートされた。コニディアを含む寒天ブロックをスライスし、μスライドの井戸に入れ、30°Cで合計18時間インキュベートした。 フレームは、HCプランAPO 63x、N.A.1.40油浸し目標(92.26 x 92.26 nmのピクセルサイズ)を搭載したTCS SP8 MP(ライカ、ドイツ)顕微鏡を使用して、25分間隔で捕獲された。画像は、488nm波長のGFPを励起し、495〜558nmのスペクトルバンドの蛍光を検出し、561nm波長でmRFPを励起し、580〜660nmのスペクトルバンドの蛍光を検出することによって得られた。(B)(A)の測定(発芽速度と催眠先端延長)は、線グラフとしてプロットされる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:固体培地上で生育するヒファエのFM4-64標識 WT株のコニディアは、30°Cで16時間1%寒天MMペトリ皿上で栽培した。 成長する胚芽は10 μM FM4-64を含む10 μLのMMで20分間インキュベートされた。インキュベーションに続いて、染色された胚芽を含む寒天ブロックをスライスし、8 μスライドに入れ、続いて30°Cで47分のチェイスを行った。 フレームは、HCプランAPO 63x、N.A.1.40油浸漬目標(ピクセルサイズ184.52 x 184.52 nm)を搭載したTCS SP8 MP顕微鏡を使用して、30°Cで7分ごとに捕捉しました。画像は、514nm波長での励起FM4-64と596〜682nmのスペクトルバンドの蛍光を検出することによって得られた。FM4-64蛍光信号は反転画像として示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:コニディオフォア形成の初期段階(A)WT株のコニディアを30°Cで136時間寒天培地上で培養し、スライスしてμスライドのウェルに入れた。フレームは20分ごとに捕獲された。2048 × 2048 ピクセルの画像は、TCS SP8 MP (ライカ、 ドイツ) 顕微鏡を使用してピクセル サイズ 245.2 x 245.2 nm で収集され、HC プラン APO 63x、N.A. 1.40 オイル浸漬目的を搭載しました。画像は、コニディオフォア小胞(黒い矢印)の形成だけでなく、形成(茶色の矢印)とメトゥラー(青い矢印)の成熟を示しています。(B)(A)の測定(発芽速度と単極性の先端延長)を折れ線グラフとしてプロットする。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1: 心結膜発芽の長期ライブ細胞イメージングは、PilA-GFPとH1-mRFPを共同 発現させる。
ビデオ2: A. ニドゥランでのコニディオフォア形成の初期段階。 このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
図S1:心座の懸濁液の調製。 約1cm2 の共和板の表面を無菌爪楊枝で掻き取ることによって、約2 x 106 のconidia/mlの懸濁液が得られる。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
経度経過顕微鏡による真菌細胞の増殖および表現型をモニタリングすることは、リアルタイムおよび定量的に細胞行動を評価し、特定の薬物治療および/または遺伝的介入が時間の経過とともに検出可能な細胞増殖または表現型の違いをもたらすかどうかを正確に判断するための強力なアプローチです。
本研究では 、A.ニドゥランにおける胚芽管およびヒファージ先端の成長のダイナミクスを含む真菌の発達を測定し、定量的に分析するための信頼性の高い生細胞イメージング方法論が説明された。時間の経過に伴う形態変化を監視することは、透過光顕微鏡技術を使用して、ストレス、死んでいるか死んでいる細胞を特定するのに非常に役立ちます。単一細胞レベルでのこのような動的プロセスの詳細な知識は、細胞の混合集団内で不均一性を評価することを可能にし、長期の視点で、細胞が内因性および環境信号に応答する経路および詳細なメカニズムの同定を可能にする。
この方法の利点の1つは、細胞の固有の光屈折特性を使用して染料/ラベルを導入することなく画像コントラストを作成するラベルフリーイメージングアプローチ(それにもかかわらず、蛍光顕微鏡と簡単に組み合わせることができる)に基づいていることであり、結果を混乱させる可能性がある。蛍光マーカーは、細胞区画およびタンパク質にタグ付けし、細胞のセグメンテーションと追跡を著しく容易にするために使用することができますが、透過光顕微鏡は、遺伝子工学的な細胞の必要性を回避し、研究者がコストと時間のかかる色素/ラベルの最適化を回避し、また蛍光イメージング13、34から来る可能性のある光毒性効果を避けることを可能にします。
このプロトコルは、ヒファエまたはシュードハイファを形成する真菌の成長動態を研究するのに適している。さらに、このアプローチは、異なる菌株の異なる細胞構造を、異なる発達段階下でイメージングするのに非常に適しています。 図8 と ビデオ2では 、A.ニドゥラン ・コニディオフォア(すなわち、無性胞子を持つ構造)の初期段階を示す。しかし、この方法は、コニジオフォア形成のイメージングに最も適しておらず、炭素/窒素の飢餓と空気暴露は共異性の発達に必要な両方であるため、我々のアプローチ35では標準化できない。
また、このプロトコルは、糸状性ヒファエ、シュードヒファル細胞、酵母形態細胞、および細胞外マトリックス36の様々な形態からなる緻密な異種、表面関連コロニーを形成する垂直拡張の対象となる、真菌バイオフィルムを追跡するのに適した。この技術のもう一つの制限は、ラベルフリー微視的分析は発芽/分化ダイナミクスの定性および定量的分析のための正確な方法を表すが、そのようなデータの手動評価は、特に多くの株または/および条件に対して時間がかかるということです。したがって、ハイスループットタイムラプスイメージング顕微鏡からのデータは、適当な計算ソフトウェアにより解析されるべきであり、ヒュファルの発達および円周発芽37、38、39の自動または半自動画像解析を可能にする。
要約すると、本明細書では、ユーザからの任意の事前の画像解析経験を必要とせずに再現可能かつ信頼性の高い方法で真菌増殖性キネティクスを分析するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、真菌の成長と分化の客観的かつ正確な定量を可能にし、真菌のライフサイクルおよび真菌病原性37を研究するための相補的なイメージングアプローチを提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究の一環として、運営プログラム「競争力、起業家精神、イノベーション」(NSRF 2014-2020)が出資する「研究・イノベーション基盤の強化」の活動の下で実施されるプロジェクト「基本的生物学的プロセスの視覚化と監視のためのギリシャ研究インフラ(BioImaging-GR)」(MIS 5002755)が支援し、ギリシャとEUが共同出資しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
