Summary
適切な麻酔下で、マウスの心臓を肋間腔から外在化し、ほとんどの検査室で容易に入手できる材料を使用して左前下行動脈(LAD)を結紮することにより、心筋梗塞の誘発に成功しました。
Abstract
心筋梗塞(MI)は、主要な死因の1つです。心筋梗塞モデルは、心筋梗塞後のリモデリングの病態メカニズムの調査や新規治療法の評価に広く用いられています。心筋梗塞を誘発するために、さまざまな方法(例、イソプロテレノール治療、凍結傷害、冠動脈結紮術など)が用いられてきた。 イソプロテレノール治療および凍結傷害と比較して、冠動脈結紮術は、心筋梗塞後の虚血反応および慢性リモデリングをよりよく反映している可能性がある。しかし、マウスにおける冠動脈結紮術の従来の方法は技術的に困難である。現在の研究は、容易に入手可能な材料を用いてマウスにMIを誘導するための単純で効率的なプロセスについて説明しています。マウスの胸部皮膚は安定した麻酔下で切り開かれた。心臓は、大胸筋と小胸筋を鈍く分離した後、肋間腔を介して直ちに外在化されました。左前下行枝(LAD)は、その起点から3mmの6-0縫合糸で結紮されました。LADライゲーション後、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)で染色すると、心筋梗塞の誘導が成功し、心筋梗塞後の瘢痕サイズの経時的変化が示されました。一方、生存解析の結果は、心筋梗塞後7日以内の明白な死亡率を示しており、これは主に心臓破裂によるものであった。さらに、心筋梗塞後の心エコー検査評価では、収縮機能障害の誘導と心室リモデリングの成功が示されました。習得すると、すぐに入手できる材料を使用して、2〜3分以内にマウスでMIモデルを確立できます。
Introduction
心筋梗塞(MI)は、世界中の死亡および障害の重要な原因の1つです1,2,3,4,5。タイムリーな再灌流にもかかわらず、現在、MI後の心臓リモデリングを治療するための効果的な治療法が不足しています。これに対応して、MI 6,7,8 のメカニズムの探索と治療の活用にかなりの努力が払われてきました。注目すべきは、MIモデルの確立がこれらの目的を達成するための前提条件であることです。
小動物にMIモデルを誘導するために、いくつかの方法(例えば、イソプロテレノール治療、凍結傷害、冠動脈結紮術など)が提案されている。イソプロテレノール治療は、心筋梗塞を誘導する簡便な方法であるが、標的部位の梗塞を誘発することはできない9。凍結傷害は、直接的な虚血ではなく、氷晶の生成と細胞膜の破壊を介して心筋壊死を引き起こします10。対照的に、冠動脈結紮術は、閉塞部位と梗塞領域の範囲を正確に制御し、梗塞後のリモデリング応答を忠実に再現します11,12。冠動脈結紮術は通常、挿管、人工呼吸器、開胸術の後に行われますが、これは技術的に困難です13,14。冠動脈結紮術のためのいくつかの修正されたプロトコル(例:.、換気なし)が報告され、MIの誘導を増強したが、詳細な視覚的実証が不足している15,16,17。これらの問題は、MIモデルを用いた研究に従事したいグループにとって、財政的および技術的に大きな障壁となっています。本報告では、マウスにおける心筋梗塞誘導のアプローチについて紹介する。現在の方法は簡単で時間を節約でき、ほとんどの検査室ですぐに見られる手術器具や機器を使用します。
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Protocol
動物実験は、上海交通大学医学部仁済病院の実験動物福祉倫理委員会(R52021-0506)から必要なすべての承認を得て実施されます。この研究には、8〜10週齢の雌雄のC57BL / 6Jマウスが使用されました。
1.簡易麻酔器の準備(オプション)
注:これはオプションの術前セットアップであり、セクション2で説明したように滴定可能な麻酔に置き換えることができます。この設定を動物の手順に適合させる前に、施設の動物倫理委員会と獣医師に相談する必要があります。
- 15 mLの遠心チューブを用意し、開口部から約3cmのところにチューブの長軸に対して垂直に切り込みを入れます。
注意: バルブを正常に挿入できるように、カットがチューブルーメンの円周の半分より大きいことを確認してください。 - カットとチューブ開口部の間の遠心分離管の壁に穴(直径2 mm)を開けます。
- プラスチックシートから適切なサイズのバルブを切り取り、チューブ壁の切り込みにバルブを挿入します。
注:バルブは、挿入の深さを変更することにより、イソフルランの放出速度を制御するために使用できます。 - ドラフト内で、チューブの底を切り開き、酸素供給に接続します。チューブの下端近くに綿球を置き、綿球に0.5 mLのイソフルラン(得られたもの、 材料表を参照)を負荷し、バルブを閉じます。
- 上記のように調製したチューブでマウスをマスキングすることにより、麻酔効果を試験する。つま先のつまみ反応による呼吸数と麻酔深度を監視します。
注意: 呼吸数が10回/ 10秒未満の場合は、過度の麻酔を示唆しており、バルブの挿入深さを調整する必要があります。麻酔を伴うすべての処置では、活性炭シートで満たされたガスフィルターを使用しなければならず(図1A-i)、手術はフード内で行う必要があります。
2.手術の準備と麻酔
- 鉗子、マイクロカ止血剤、手術用ハサミ、針ホルダー2本、4-0シルク手術用縫合糸、6-0シルク手術用縫合糸、ガスフィルター、光源など、手術当日に必要なすべての器具を準備して滅菌します(図1A)。
- サージカルマスクと滅菌手袋を着用してください。
- 脱毛クリームをマウスの胸部に塗り、1分間待ちます。脱毛クリームと髪を濡れたガーゼでやさしく拭き取ります。
- 脱毛後、利き手でマウスを持ちます。酸素供給(1L / min)で気化したイソフルラン(4%)を吸入して麻酔を誘発し、2〜3%のイソフルランに維持します。
- つま先のつまみ反応がないことで適切な麻酔を確認します。
- 角膜の乾燥を防ぐために、滅菌アイクリームを両目に塗ります。
- マウスを手術台に仰臥位で固定します。ポビドンヨード綿棒( 材料表を参照)を胸部に3回塗布し、消毒した胸部を滅菌ドレープで覆います。
3.心筋梗塞の誘発
- 汚染された手袋を交換して、無菌性を確保してください。
- リドカインで局所ブロックした後、剣状突起と脇の下を結ぶ線に沿って0.5cmの皮膚を切断します。.
- 鉗子と微小蚊止血剤を使用して大胸筋と小胸筋を鈍く分離し、第4肋間腔を露出させます。
- マイクロ蚊の止血剤を使用して4番目の肋間腔を開きます。
- 左手の人差し指で心臓を第4肋間腔に押し込むことにより、心臓を外在化します。
- 左手で心臓を固定し、左前下行枝を起点から3mmの6-0縫合糸で結紮します。
- 心臓を胸腔にすばやく戻します。
注:心臓を30秒未満で外部化しても安全です。 - 胸腔を手動でそっと押して、胸腔から空気を排出します。
- 肋骨の上の筋肉層を6-0シルク縫合糸で閉じます。
- 4-0シルク縫合糸で皮膚を閉じます。
- 手術後すぐにマウスをパッド(37°C)に置きます。
- ブプレノルフィン(0.05-0.1mg / kg)を4〜6時間ごとに皮下注射して、術後の痛みを最大72時間軽減します。.
- 完全に回復したら、手術したマウスをケージに戻します。
注:マウスは手術後3〜5分以内に完全に回復します。 - マウスを注意深く監視し、最大7日間ウェットフードを提供します。
4. ティッシュの採取
- 子宮頸部脱臼による心筋梗塞確立後のさまざまな時点でマウスを犠牲にします。
- 犠牲にしたマウスを手術台に仰臥位で固定します。
- 上腹部に腹側切開(3~4cm)を行います。胸腔の両側から肋骨を切り取り、横隔膜を取り除きます。
- 心室内注射により、10 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS、4°C)で心臓を灌流します。
- 大動脈根を切除して心臓を採取し、直ちに-80°Cで保管します。
注:著者の経験によると、保存後2週間以内にTTC染色を行うことは可能です。 - 心臓を2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)で染色します。
- 凍った心臓を氷の上でカミソリの刃を使って厚さ1mmにスライスします。
- 調製したハートスライスを1%TTC溶液(1x PBSに溶解)中で37°Cで10〜15分間インキュベートします。
注:15分間のインキュベーション後、TTC溶液を廃棄し、染色したハートスライスを1x PBSに浸します。
- デジタルカメラでスライスを撮影します。
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Representative Results
実験プロトコルといくつかの重要なステップを 図1に示します。簡易麻酔装置は麻酔を誘発した。 図2Aに示すように、誘発された麻酔は、通常の呼吸数(試験されたマウスでは90〜107呼吸/分)に反映されるように安定していました。冠動脈結紮術後、TTC染色解析により、心筋梗塞の誘発に成功し、心筋梗塞後の瘢痕サイズの経時的変化が示されました(図2B)。一方、生存解析の結果、C57BL/6Jマウスの雌雄では、心筋梗塞後7日以内の明白な死亡率が示されました(図2C、D)。心室破裂(雄マウスで56%、雌マウスで40%)は、心筋梗塞後の死亡の一般的な理由であった。さらに、心筋梗塞後の心エコー検査評価では、収縮機能障害と心室リモデリングの誘導に成功しました(図2E、F)。
図1:MI誘導の修正された方法の材料と重要なステップ 。 (A)このプロトコルに必要な手術器具および材料。(a)4-0シルク縫合糸。(b)6-0シルク縫合糸。(c)鉗子。(d) はさみ。(e-f)ニードルホルダー。(g)マイクロカ止血剤。(h)光源。(i)ガスフィルター。(B)マウスに心筋梗塞を誘導するための重要なステップを示す代表的な画像。(a)麻酔後にマウスを固定し、ポビドンヨードを手術部位に塗布した。(b)手術部位はドレープされています。(c)リドカインによる局所ブロック後の手術部位の0.5cmの切り傷。(d)露出した肋骨。矢印はリブを示しています。(e)大胸筋と小胸筋を解剖し、第4肋間腔を露出させた。(f) 外在化した心臓。(g-h)6-0の絹の縫合糸でLADを結紮しました。矢印はLADを示します。(i)心臓を胸腔に戻します。(j)胸腔から空気が排出された。(k)筋層は6-0のシルク縫合糸で肋骨の上で閉じ、皮膚は4-0のシルク縫合糸で閉じました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:冠動脈結紮術後の組織学的および機能的変化。 (A)簡易麻酔装置で麻酔したマウスの呼吸数(n=10)。(B) 心筋梗塞後の異なる時点で、心臓切片(各心臓から4切片)のTTC染色結果を収集しました。白い領域は梗塞領域を示し、赤い領域は生存可能な心筋を示しました。 (C) Kaplan-Meier曲線は、雄マウスの心筋湡後死亡率を示しています(グループあたりn = 20)。 (D) Kaplan-Meier曲線は、雌マウスの心筋梗塞後の死亡率を示しています(n=20/グループ)。(E)心筋梗塞後のさまざまな時点(偽、心筋梗塞後3日、7日、21日、および28日後)での心エコー検査の代表的な画像。(F)示されたグループ間の左心室駆出率(LVEF)、左心室部分短縮(LVFS)、左心室収縮末期直径(LVsD)、および左心室拡張末寸法(LVdD)値の定量的分析(グループあたりn = 5)。**p<0.01 または ***p<0.001 対真似事;##p< 0.01 または ###p< 0.001 対MIの3日後。 事後テューキーHSD(正直有意差)検定による一元配置分散分析を統計分析のために実行しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本報告は、Gao16によって報告された方法から修正された、容易に入手可能な材料を用いたマウスにおけるMI誘導のための簡単なプロトコルを実証した。マウスMIモデルは、MI後の機能障害とリモデリングのメカニズム探索と薬物スクリーニングに不可欠です12。心筋梗塞誘導の既存の技術の中で、冠動脈結紮術が最も一般的に行われているものです。冠動脈結紮術は、心筋梗塞の虚血の性質を忠実に再現し、臨床シナリオ18,19と同様の瘢痕治癒およびリモデリング反応をもたらします。しかし、冠動脈結紮術の従来のプロトコルでは、挿管、換気、胸部の広い開口が必要であり、技術的に困難で時間がかかります。過去数年間で、冠動脈結紮のさまざまなプロトコルが報告されており、MIの確立をある程度増強しました15,16,17。現在の研究では、ほとんどの検査室で容易に見られる手術器具と機器を使用したシンプルで効率的なプロトコルが提示されました。
重要な手順とトラブルシューティング
このメソッドを実践する際に最適なパフォーマンスを発揮するには、いくつかの重要なステップに注意する必要があります。心臓を外部化するために、胸腔を強く圧迫してはいけません、それは冠状動脈の血流に悪影響を及ぼし、冠状動脈を覆い隠し、冠状動脈の見えにくくなり、LAD結紮の失敗につながります。さらに、これは重度の肺損傷を引き起こす可能性があります。ほとんどの場合、胸壁の右側を優しく押すと、開いた肋間腔から心臓をうまく外在化できます。時折、心臓の外在化中の抵抗感は、心臓の頂点と肋間開口部の不一致を示している可能性があります。これは、腋窩中線に沿った微小蚊止血のわずかな動きによって対処できます。もう一つの重要なポイントは、筋肉と皮膚を縫合する前に、胸腔内の残留空気を適切に排出することです。そうしないと、気胸による術後死亡率が増加します。
利点と制限
従来の冠動脈結紮術の方法では、挿管、人工呼吸、肋骨の切断が必要であり、心拍数が高いため冠動脈の同定は容易ではありませんでした。これらの問題は、手術時間を劇的に延長し、手術関連の死亡率を増加させます。従来の方法と比較して、修正されたプロトコルには次の利点があります:(1)時間の節約になります(すなわち、麻酔、LAD結紮から皮膚縫合の成功まで約3分かかります)。(2)必要な手術器具と材料は、ほとんどの検査室ですぐに入手できます。しかし、このユニークな方法の重大な制限は、機械的換気サポートがないため、心臓の外在化後にLAD結紮に許容される時間が限られていることです。したがって、気胸による高い死亡率は、初心者に期待できます。著者らの経験に基づくと、30秒未満の心臓の外在化は、試験したすべてのマウスで十分に許容される。この時間枠は、経験豊富な技術者が周術期死亡率を低くして心筋梗塞導入を終了するのに十分です (<5%)。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(81930007、81625002、81800307、81470389、81500221、81770238)、上海優秀学術指導者プログラム(18XD1402400)、上海市科学技術委員会(201409005200)、上海浦江人材プログラム(2020PJD030)、中国ポスドク科学基金会(2020M671161、BX20190216)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA | T8877-25G | TTC staining |
| 4-0 silk suture | YUANKANG | 4-0 | Surgical instrument |
| Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | Sterilization for the solid |
| Buprenorphine | Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd. | H10940181 | reduce post-operative pain |
| Centrifugation tube | Biological Hope | 1850-K | 15ML |
| Depilatory cream | ZIKER BIOTECHNOLOGY | ZK-L2701 | Depilation agent for laboratory animals |
| Forcep | RWD | F12028 | Surgical instrument |
| Gas filter | ZHAOXIN | SA-493 | Operator protection |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | Used for anesthesia |
| Light source | Beijing PDV | LG-150B | Operating lamp |
| Micro-mosquito hemostat | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Needle | BINXIONG | 42180104 | Surgical instrument |
| Needle and the 6-0 silk suture | JIAHE | SC086 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32030 | Surgical instrument |
| Needle holder | ShangHaiJZ | J32010 | Surgical instrument |
| Povidone-iodine swabs | SingleLady | GB26368-2010 | Skin disinfection |
| Scissors | CNSTRONG | JYJ1030 | Surgical instrument |
| Sterile eye cream | Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H10940177 | prevent corneal dryness |
| Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals | VisualSonics | Vevo 2100 | Echocardiographic analysis |
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