Summary
מודל עכבר של דלקת לבלב חריפה חמורה מתואר כאן. ההליך המוצג כאן הוא מהיר מאוד, פשוט ונגיש, ובכך עשוי לאפשר את חקר המנגנונים המולקולריים והתערבויות טיפוליות שונות בדלקת הלבלב החריפה בצורה נוחה.
Abstract
השכיחות של דלקת לבלב חריפה (AP), במיוחד דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP), גדלה בקבוצות גיל צעירות מדי שנה. עם זאת, קיים מחסור בטיפולים יעילים בפרקטיקה הקלינית הנוכחית. עם הנגישות הקלה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן, המאפשר מינונים מינימליים של תרופות הנדרשות להערכת vivo , מודל ניסיוני מבוסס היטב בעכברים עדיף למחקר AP. יתר על כן, SAP המושרה באמצעות נתרן taurocholate (TC) הוא כיום אחד הדגמים הנפוצים ביותר המאופיינים ביותר. מודל זה נחקר על טיפולים חדשניים ואירועים מולקולריים אפשריים במהלך התהליך של AP. כאן, אנו מציגים את הדור של מודל עכבר AP באמצעות נתרן taurocholate ו microsyringe תוצרת בית פשוטה. יתר על כן, אנו מספקים גם את המתודולוגיה לבדיקות ההיסטולוגיה והסראולוגיות הבאות.
Introduction
דלקת לבלב חריפה (AP) היא דלקת חריפה של הלבלב המאופיינת על ידי חסימה של צינור הלבלב הראשי עם התנפחות דביקה דביקה לאחר מכן ו autodigestion הלבלב על ידי אנזימים המופעלים באופן חריג שלה. הביטויים הקליניים שלה כוללים דלקת מקומית או מערכתית, כאבי בטן, והעלאה של עמילאז בסרום1,2. על פי סיווג החומרה3, AP יכול להציג בצורות קלות, מתונות וחמורות, וביניהם, דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP) היא המצב המדאיג ביותר בשל שיעור התמותה הגבוה שלה של יותר מ -30%4. בארצות הברית, AP היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר לאשפוז, המשפיעים על מעל 200,000 חולים5. יתר על כן, AP, במיוחד SAP, גדל מדי שנה ומשפיע על קבוצות גיל צעירות6. עם זאת, קיים מחסור באפשרויות טיפול יעילות בפרקטיקה הקלינית הנוכחית6,7. לכן, יש צורך לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים AP, ובכך להקל על שיפור הטיפול.
מודלים מבוססים של בעלי חיים ניסיוניים נדרשים לחקר המנגנונים המעורבים ב- AP ולהערכת האפקטיביות של שיטות טיפול שונות. עם הנגישות הקלה של זנים מהונדסים ונוקאאוט וגודלם הקטן, אשר ממזער את המינונים של תרופות הנדרשות להערכת vivo, עכברים עדיפים למחקר AP. לכן, מספר מודלים של AP פותחו בעכברים8,9.
עובד ממודל עכבר לבלב מתון המושרה באמצעות הממשל תוך ורידי של caerulein10, Niederau ואח 'פיתח מודל עכבר SAP שהוצג עם נמק תא acinar המושרה באמצעות אותה תרופה מסלול הזרקה11. למרות שלמודל זה יש מספר יתרונות, כולל אי-פולשניות, אינדוקציה מהירה, רבייה רחבה ותחולת, החיסרון העיקרי הוא שרק צורה קלה של AP מפותחת ברוב המקרים, ובכך מגבילה את הרלוונטיות הקלינית שלה. אלכוהול נחשב לאחד הגורמים האטיולוגיים העיקריים של AP; עם זאת, Foitzik ואח ' דיווח כי זה גורם לפגיעה בלבלב רק בשילוב עם גורמים אחרים, כגון גירוי יתר אקסוקריני12. יתר על כן, למרות מודלים AP המושרה אלכוהול שפותחו באמצעות נתיבי ממשל שונים, ומנות סמים דווחו13,14,15, החיסרון העיקרי שלהם הוא הקושי לשחזר אותם. ניהול intraperitoneal של L-ארגנין יכול גם לגרום AP בעכברים16; עם זאת, הרלוונטיות הקלינית הנמוכה שלה מעכבת את היישום שלה. Taurocholate, מלח מרה, הוצע לראשונה על ידי Creutzfeld ואח 'בשנת 1965 לגרימת מצב הדומה AP אנושי באמצעות עירוי צינור הלבלב17. למרות שקיימות מחלוקות לגבי הרלוונטיות הקלינית שלה בפתופיזיולוגיה18,19, דלקת הלבלב הנגרמת על ידי טאורוכולאט נותרה מודל חיוני עבור SAP.
כמו מודל זה הוא פשוט למימוש והוא גם יעיל בעכברים, זה עכשיו אחד המודלים הנפוצים ביותר AP עבור בעלי חיים קטנים במחקרים vivo. Perides ואח ' העסיקה נתרן טאורוכולאט (TC) כדי לגרום SAP בעכברים20, מתן תובנות כדי להבין את הפתולוגיה שלה. בשילוב עם טכניקות שינוי גנטי, מודל זה אפשר לנו לאשר מספר גנים ספציפיים המעורבים AP. לדוגמה, Bicozo ואח ' הראה כי נוקאאוט של הגן CD38 מוגן מפני מודל של דלקת לבלב עירוי TC וייחס את המנגנונים לשינויים Ca2 + איתות תאיים21. Fanczal ואח ' חקר את ההשלכות הפיזיולוגיות של ביטוי TRPM2 בקרום הפלזמה של אצינר לבלב עכבר ותאים דביקים, והפגין חומרה מופחתת של SAP המושרה TC בעכברים נוקאאוט TRPM222. יתר על כן, מודל זה מספק גם דרך פשוטה ויעילה לבדוק תרופות חדשניות רבות ב vivo. לדוגמה, שיטה זו אפשרה אימות של ההשפעות הטיפוליות של קפאין23, חומצה דהידרוקולית24, ונוגדי חמצון שונים ונוגדי קרישה25,26. ראיה זו מדגימה את הרב-תכליתיות של מודל SAP המושרה על-ידי TC. למרות ש-Wittel et al. תיארו מודל עכבר דומה27, היעדר פרטים על הליכי היישום עלול לגרום לחוסר יכולת לשחזר את הממצאים. במאמר זה, אנו מתמקדים בשיטות המשתמשות במיקרו-מזרק ביתי פשוט ולומדים SAP המושרה על ידי TC, ובכך מספקים הדרכה אפשרית לא רק למחקר נוסף של הפתוגנזה והטיפול ב- AP, אלא גם לשיטה ניסיונית הניתנת להתאמה מושלמת עבור חומרים רבים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת סוכו. כל הניתוחים הכירורגיים בוצעו בהרדמה מלאה. משככי כאבים לא שימשו כדי למנוע הפרעה עם המהלך הטבעי של המחלה על פי ספרות קודמת28,29. אישור להיעדר משככי כאבים ניתן גם על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת סוכו.
1. הכנה
- מהיר C57BL / 6 עכבר מסוג פראי 8-12 שעות לפני הניתוח.
- הכינו פתרון TC של 5% (w/v) (93 מ"ר) המדולל ל-0.9% נתרן כלורי. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- Autoclave את המכשירים והחומרים כירורגיים, כולל מלקחיים, מספריים, מחזיק להב, מחזיק מחט, קליפ המוסטטי, מלחציים וסקולריים, ווילונות סטריליים, באמצעות מחטא לחץ בטמפרטורה של 121 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
- הכינו מיקרו-מזרק תוצרת בית. לשם כך, התקן באופן ידני קצה אינסולין חד פעמי וטיפ פיפטה מפלסטיק ממושך על מזרק Microliter קצה שטוח 25 μL. לחטא באמצעות הקרנה.
2. הרדמה והכנה לפני הניתוח
- שוקלים 6-8 שבועות זכר C57BL / 6 עכברים מסוג בר (כ 21-23 גרם). לגרום להרדמה כללית עם הזרקה תוך-פטריטונית של תמיסת נתרן פנטוברביטל 1% במינון של 50 מ"ג/ק"ג.
- תקן את העכבר בתנוחה העליונה על צלחת שטוחה anirradiatedfoam עם הקלטת.
- הכן את אזור הפעולה של כל בעל חיים על ידי הסרת פרוותו עם קרם depilation מרמת תהליך xiphoid עד לקו המחבר של עמוד השדרה הכפיים העליון הדו-צדדי הקדמי, עם הצדדים השמאליים והימניים במקביל לקו הציר הקדמי.
- הכן שדה כירורגי סטרילי עם דגש מיוחד על האזור הניתוחי, המורכב מהאזור שהוכן על החיה ואת החלק הקדמי של המנתח.
- לחטא את הספסל.
- נקו את אתר החתך עם יישומים מרובים של פתרון קרצוף כירורגי. לנגב את העור פעמיים עד שלוש פעמים עם 0.5% יוד ולאפשר לו להתייבש במשך 1-2 דקות בכל פעם.
- לכסות את העכבר עם וילונות סטריליים.
3. הליך כירורגי
הערה: איור 1 מתאר את האנטומיה והמורפולוגיה של לבלב העכבר לפני ואחרי הזרקה מדרדרת של TC לצינור הביליופנקרטי באמצעות מיקרו-הזרקה.
- בצע חתך בטן חציוני באורך 2 עד 3 ס"מ.
- אתר את התריסריון משמאל לימין לאורך הבטן. שלפו בעדינות את התריסריון החוצה ולצד שמאל באמצעות מלקחיים כירורגיים וספוגית כותנה ספוגת חיטוי כדי לחשוף את הלבלב, את הצינור הביליופנקרטי ואת הפפילה התריסריון. הקפד לא לפגוע בדופן המעי או בכלי הדם הקשורים.
- השתמש 8-0 תפרים לעבור דרך החיבור בין התריסריון והלבלב סביב הפפילה, ולמשוך אותם לצד שמאל של גוף העכבר כדי לתקן את התריסריון.
- יש למשוך בעדינות את העור ואת הקצה התחתון של הכבד הצידה. מהדק את צינור הכבד המשותף, הקפדה לא להדק את וריד הפורטל או הלבלב. מהדקים את הצינור הביליופנקרטי הפרוקסימלי.
- נקב את המיקרו-גנרטור לתוך צינור הביליופנקרטי הדיסטלי בנסיגה. תקן את קצה המחט ליד פפילה התריסריון עם מלחציים. להחדיר 10 μL של 5% TC לתוך צינור הלבלב בקצב של 5 μL / min.
- שמור את צינור biliopancreatic סגור במשך 5 דקות כדי להשיג לחץ יציב. לאחר מכן, לשלוף את microinjector ולהסיר את מלחציים.
- לשחזר את התריסריון למצב האנטומי המקורי ולבדוק את הדימום.
- סגור את הפצע עם 6-0 תפרים ולחטא עם 0.5% יודופור.
4. התאוששות וניהול לאחר הניתוח
- לשחזר את בעלי החיים מהרדמה על כרית תרמית 37 °C (50 °F). אל תשלחו את החיות המופעלות לחדר הזמן לאחר הניתוח עד שכל החיות יתעוררו.
- לנהל 0.8 מ"ל של 0.9% מלוחים תת עורית ולאט עבור תוספי נוזלים.
- עקוב אחר בעלי החיים לאחר הניתוח על מצבם הכללי וסימני זיהום או מחלה.
5. בדיקות סרולוגיות והערכה היסטולוגית
- ב 24 שעות לאחר הניתוח, להרדים את העכברים עם נתרן pentobarbital באמצעות אותו מינון ומסלול הזרקה.
- לאסוף את כל הדם מאבי העורקים בבטן (כ 0.8 מ"ל לכל עכבר) ולסובב ב 1,500 x g במשך 15 דקות כדי לבודד את הסרום לבדיקות נוספות.
- לאסוף את רקמות הלבלב.
- פתח את חלל בית החזה כדי לאסוף את רקמות הריאה.
- למדוד את מדדי תפקוד הביוכימיה מהנסיוב, כולל עמילאז, ליפאז, תפקוד כבד (אלנין transaminase (ALT) ו transaminase אספרטט (AST)), ותפקוד הכליות (אוריאה וקריאטין), באמצעות ערכות מסחריות על פי הוראות היצרנים.
- הומוגניזציה של רקמות הריאה והלבלב ולמדוד את רמת myeloperoxidase (MPO) באמצעות ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן.
- פתחו את חלל בית החזה והגדילו עם 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) פעמיים, ואז אספו את הלבלב. יש לטבול בתמיסת 4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות. להתייבש בסדרה של ריכוזי אלכוהול ולהטמיע בפרפין.
- השתמש microtome כדי להכין 5 מיקרומטר עבה רקמת הלבלב חלקים.
- בצע הכתמת H&E להערכה היסטולוגית של הלבלב.
- להעריך את הציונים הפתולוגיים על פי הקריטריונים המוצעים על ידי שמידט ואח '30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על ידי ביצוע קפדני של ההוראות לעיל, השגנו משך ניתוח ממוצע של כ 40 דקות. העכברים היו מעט לא פעילים ואיבדו כ-0.5-1.75 גרם, 0.85-1.85 גרם ו-0.5-4.73 גרם משקל ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר הניתוח, בהתאמה (איור 2).
מרגע השלמת הניתוח ועד 24 שעות לאחר הניתוח, עם התפתחות המחלה, העכברים הפכו ללא פעילים והראו תגובות ופעולות איטיות.
שיעורי ההישרדות של השליטה ועכברי SAP היו 100% (8/8) ו-72.7% (8/11), בהתאמה, ב-72 שעות לאחר הניתוח (איור 3).
על פי הציון H&E (איור 4) וציון פתולוגי (איור 5) תוצאות מקטעי לבלב, בצקת ברורה (ציון: 3.14 ± 0.51 לעומת 0.10 ± 0.08), דלקת (ציון: 1.41 ± 0.81 לעומת 0) ונמק (ציון: 3.03 ± 0.77 לעומת 0) של רקמת הלבלב ניתן היה לראות בעכברים SAP ביחס לעכברי הבקרה. בינתיים לא ניתן היה למצוא שינויים משמעותיים בדימום (ציון: 0.125 ± 0.31 לעומת 0) בשתי קבוצות העכברים, וכתוצאה מכך ציון פתולוגיה כולל גבוה משמעותית בעכברים SAP (ציון: 7.72 ± 1.61 לעומת 0.10 ± 0.08).
יתר על כן, בהשוואה לאלו של עכברי הבקרה, רמות עמילאז מוגברות באופן משמעותי ([46,740.32 ± 12,801.30] U/L לעומת [3,324.40 ± 753.66] U/L, p < 0.001), ליפאז ([545.02 ± 356.28] U/L לעומת [18.32 ± 25.22] U/L, p < 0.05) ולבלב וריאות MPO (לבלב: [5.18 ± 3.26] U/g לעומת [0.71 ± 0.41] U/g, p < 0.05; ריאות: [11.70 ± 1.31] U/g לעומת [1.56 ± 0.45] U/g, p < 0.001) נמצאו בעכברים SAP (איור 6).
בנוסף, בהשוואה לעכברי בקרה, עכברי SAP הדגימו תפקודי כבד וכליות לקויים, כפי שמודגמים על ידי המדדים הבאים: ALT ([164.36 ± 47.66] U/L לעומת [77.15 ± 31.06] U/L, p < 0.001), AST ([222.35 ± 82.13] U/L לעומת [116.61 ± 64.79] U/L, p < 0.01), חנקן אוריאה דם (BUN) ([37.59 ± 16.36] mM לעומת [14.80 ± 3.74] mM, p < 0.001) וקריטינין ([40.33 ± 11.53] מיקרומטר לעומת [28.66 ± 4.53] מיקרומטר, p < 0.01) (איור 7).
איור 1. האנטומיה והמורפולוגיה של לבלב העכבר לפני ואחרי הזרקה מדרדרת של נתרן taurocholate (TC) לתוך צינור biliopancreatic. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. מהלך הזמן של שינויי המשקל של הפקד (n = 8) ודלקת לבלב חריפה חמורה (n = 11) עכברים. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן (SD). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. ניטור עקומת הישרדות של הפקד (n = 8) ודלקת לבלב חריפה חמורה (n = 11) עכברים. המספרים בכחול ואדום מייצגים את המספרים של העכברים ששרדו בנקודת זמן מסוימת בקבוצות הבקרה ו-SAP, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. היסטופתולוגיה של מקטעי הלבלב משליטה ודלקת לבלב חריפה חמורה (SAP) עכברים. חץ שחור מציין חדירת תאים דלקתיים, חץ אדום מציין דימום, משולש הפוך שחור מציין נמק acinar. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. ציונים היסטולוגיים. ציוני היסטולוגיה (כולל בצקת, נמק, דלקת, דימום, וציונים כוללים) של סעיף הלבלב משליטה ודלקת לבלב חריפה חמורה (SAP) עכברים. כל נקודה שחורה מייצגת את הציון המתאים מעכבר אחד. ns: לא משמעותי; **p < 0.01; עמ' < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. הערכה סרולוגית של עמילאז וליפאז וקביעה של פעילות הלבלב ומיאלופרוקסידאז הריאות (MPO). רמות גבוהות באופן משמעותי של עמילאז, ליפאז, לבלב, MPO ריאות נמצאו בעכברים SAP יחסית לעכברי בקרה. נקודה שחורה אחת מייצגת עכבר אחד. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן (SD). *עמ' < 0.05; עמ' < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. מדדי תפקוד כבד (ALT: אלנין aminotransferase, ו- AST: אספרטט aminotransferase) ואינדי מדדי תפקוד הכליות (קריאטינין ו BUN: חנקן אוריאה דם), בקרה ודלקת לבלב חריפה חמורה (SAP) עכברים. רמות מוגברות באופן משמעותי של ALT, AST, BUN, קריאטינין נמצאו בעכברים SAP ביחס לעכברי בקרה. נקודה שחורה אחת מייצגת עכבר אחד. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן (SD). *עמ' < 0.05; **p < 0.01; עמ' < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל SAP המושרה על ידי TC הוא כלי מחקר מצוין. כפי שמוצג במחקר זה, מודל זה מתממש בקלות רבה במעבדות כלליות מבלי להשתמש במכשירים ספציפיים. כאשר נעשה בו שימוש בשילוב עם היסטולוגיה וניתוח ביוכימי, הוא מספק עלות - (ריאגנטים זולים) וחיסכון בזמן (חלון זמן של 24 שעות) לגרימת והערכה של AP. התאמת הריכוז של TC מציעה גם את האפשרות לייצר AP מתון ומתון. Perides ואח 'גם העסיק TC כדי לגרום SAP בעכברים20, ואת ההבדל העיקרי היה שהם השתמשו במשאבה עבור עירוי TC, אשר עשוי לספק מינון עירוי מדויק יותר.
על פי הניסיון שלנו, במהלך התהליך הכירורגי של הקמת המודל, הגורמים החשובים ביותר כללו חשיפה מלאה של צינור biliopancreatic, ניקוב חלק של microinjector, והזרקת TC לתוך צינור biliopancreatic ואת צינור הלבלב במהירות קבועה יחסית. יש להקדיש תשומת לב לנקודות הבאות במהלך הניתוח. ראשית, התריסריון צריך להיות שלף בעדינות, כדי למנוע יישום של כוח מופרז, אשר עלול לגרום נמק התריסריון. הפתיחה של צינור biliopancreatic ממוקם לאורך הקצה הפנימי של התריסריון (המכונה גם פפילה התריסריון), ואת הצינור הביליופנקרטי יכול להיות ממוקם לאחר מכן. אם יצליחו, ניתן לזהות את הפפילה בתריסריון הלבן ואת הצינורות המעצבים את הצינור הביליופנקרטי ועוברים דרך הלבלב בצורת עלה. חשיפה נאותה של צינור biliopancreatic צריך להקל על ההליכים הבאים. שנית, כוח משיכה מתון צריך להיות מיושם בעת תיקון התריסריון לצד השמאלי התחתון של העכבר להציב בתנוחה supine באמצעות תפרים, ובכך ליישר את צינור biliopancreatic ללא אובדן מתח. כוחות משיכה מוגזמים ולא מספיקים עלולים לגרום לקריעת דופן התריסריון ולחשיפה לקויה של התעלה הביליופנקרטית, בהתאמה, מה שעלול להשפיע לרעה על הניקור הבא. זווית אנכית מומלצת כדי להבטיח נקב חלק כאשר התריסריון קבוע לצד השמאלי התחתון באמצעות תפרים. לאחר מכן, במהלך ניקוב, ודא כי כיוון הנקב מקביל לכיוון של צינור biliopancreatic. בעת ניקוב, המישור נוטה של קצה המחט צריך להיות מכוון כלפי מטה כדי לעבור דרך קיר התריסריון ולאחר מכן להיכנס צינור biliopancreatic, הקפדה להשתמש בכוח המתאים כדי למנוע ניקוב צינור biliopancreatic. לאחר נקב מוצלח, אין התנגדות צריכה להיות מורגשת בעת הכניסה לצינור הביליופנקרטי, ואת המתח של קיר צינור biliopancreatic צריך להיות מורגש כאשר בעדינות רועד קצה המחט. לבסוף, במהלך ההליך, התריסריון צריך להישמר לח עם מלוחים נורמליים חמים כדי לשמור על פעילותו.
עם זאת, לשיטה זו יש גם כמה מגבלות. ראשית, רבייה עשויה להיות מושפעת מתגובות שונות ל- TC מכל עכבר. לכן, ניתן לבצע השוואה משויכת של התוצאות המתאימות מכל עכבר כדי למזער השפעות אלה. שנית, פציעה של פפילה התריסריון היא תופעה נפוצה במהלך תהליך הנקב, אשר יכול גם לגרום דלקת לבלב חריפה. לכן, ייתכן שיידרש זמן אימון ארוך יותר כדי לפתח מיומנויות כירורגיות נאותות כדי למלא את שיטת הדוגמנות הזו. בנוסף, שמירה על העכברים בגודל מתאים יכול להיות מועיל להבטחת התוצאות הניתוחיות.
למרות מגבלות אלה, מודל זה הוא אחד המודלים הנפוצים והמאופיינים ביותר עד כה לזירוז AP וחקירת טיפולים חדשניים ואירועים מולקולריים אפשריים במהלך תהליך AP. על פי מחקרים קודמים, SAP המושרה באמצעות TC תוארה גם כמתאימה להערכת טיפול ממוקד מכיוון שהחומרה שהושגה עם מודל זה דומה למחלה אנושית וניתן לשחזר אותה בקלות. דווח על התערבות קוורצטין כדי להחליש את הנזק הפתולוגי של הלבלב והאילאל במודל SAP זה באמצעות עיכוב של הפעלת TLR4/MyD88/p38 MAPK ומתח רטיקולום אנדופלסמי (ERS) 31. הניהול של CM4620, חוסם ערוצי Orai1 סלקטיבי, יכול להפחית באופן משמעותי את החומרה של מודל SAP זה; מניעת הפעלת טריפסינוגן, מוות תאי acinar, NF-κB, וגורם גרעיני של תאי T מופעלים (NFAT) הפעלה ותגובות דלקתיות הוכחו לשמש את המנגנונים הבסיסיים32. בנוסף TC, חומצה taurolithocholic 3-סולפט (TLCS) היא עוד חומצת מרה בשימוש לעתים קרובות אינדוקציה AP. כפי שנסקר על ידי Petersen et al.33, ריכוזי יוני סידן גבוהים המושרים על ידי TLCS בתאי acinar יכול להשפיע לא רק על ייצור ATP מיטוכונדריאלי תאי, אלא גם תאים אחרים (acinar, stellate, ו macrophages) הממוקם בלבלב באמצעות exocytosis סידן יון; בעוד, TC עלול לגרום נזק עקיף לתאי acinar באמצעות השפעתו על תאים כוכביים periacinar.
לכן, מודל SAP המושרה על ידי TC מספק תובנות מצוינות על הפתוגנזה של AP והוא כלי רלוונטי מאוד לאימות פרה-קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, מודל זה יכול להיות מותאם לבעלי חיים גדולים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות הלא נעימות והבלתי צפויות הנובעות מטיפולים לטיפול AP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
אנו מודים על התמיכה מהמענקים הבאים: מענק מחקר תרגומי של NCRCH [2020WSA01], מענק מדעי KJXW מוועדת הבריאות של סוג'ואו לחוקרים צעירים [KJXW2020002], תוכנית מדע וטכנולוגיה של סוג'ואו סיטי (SKY2021038 ו- SKJY2021050), מענק מטעם תוכנית הלימודים האקדמית המועדפת לפיתוח מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (PAPD), ותוכנית מחקר ופיתוח חברתי ראשוני של מחוז ג'יאנגסו (BE2018659).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J.
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S.
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
