Summary
La transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis es un método de lesión relevante para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal mediante la realización de un corte transversal que corta completamente la médula espinal a nivel torácico.
Abstract
La lesión de la médula espinal (LME) es una aflicción permanente, que afecta los nervios motores y sensoriales del sistema nervioso central (SNC), lo que resulta en parálisis debajo del sitio de la lesión. Hasta la fecha, no existe una terapia de recuperación funcional para la LME, y hay una falta de claridad con respecto a los muchos complejos y eventos dinámicos que ocurren después de la LME. Muchos organismos no mamíferos pueden regenerarse después de una LME grave, como los peces teleósteos, los anfibios urodele y las etapas larvales de los anfibios anuros, incluidos los renacuajos Xenopus laevis . Estos son organismos modelo de buena fe para estudiar y comprender la respuesta a la LME y los mecanismos subyacentes a los procesos regenerativos exitosos. Este tipo de investigación puede conducir a la identificación de posibles dianas para la intervención terapéutica de LME. Este artículo describe cómo realizar la transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis , incluida la cría, la cirugía, la atención posterior a la cirugía y la evaluación de pruebas funcionales. Este método de lesión se puede aplicar para dilucidar los diferentes pasos de la regeneración de la médula espinal mediante el estudio de los mecanismos celulares, moleculares y genéticos, así como la evolución histológica y funcional después de la LME y durante la regeneración de la médula espinal.
Introduction
La lesión de la médula espinal (LME) es una aflicción que afecta aproximadamente a 250,000-500,000 personas en todo el mundo cada año1. Además de esta alta prevalencia, la LME afecta a los nervios sensoriales y motores, generando parálisis debajo del sitio de la lesión y desconexión de algunos órganos internos del control del SNC. La médula espinal, una parte del SNC, no puede regenerarse, y debido a la complejidad de la aflicción y la falta de comprensión completa de todos los procesos involucrados, todavía no hay terapias eficientes que permitan la recuperación funcional.
Los organismos no mamíferos, como los peces teleósteos, los anfibios urodele y las etapas larvales de los anfibios anuros, que pueden regenerar la médula espinal después de una SCI2 grave,3,4, son excelentes organismos modelo para estudiar los procesos que gobiernan un evento regenerativo exitoso y comprender el fracaso de la regeneración de los mamíferos. Esta comprensión es de gran interés, ya que podría proporcionar información original para desarrollar nuevas dianas terapéuticas y posibles terapias para la LME.
La rana anuro, Xenopus laevis, es un excelente organismo modelo para estudiar la LME. Tiene excelentes capacidades regenerativas durante las etapas de renacuajo, que se pierden progresivamente durante la metamorfosis, permitiendo la experimentación en las etapas regenerativa y no regenerativa3,5. El método de lesión establecido para el estudio de la LME en renacuajos Xenopus laevis consiste en la amputación de la cola, donde se extirpa toda la cola, incluyendo tejidos como el músculo, la notocorda y la médula espinal6. Este enfoque ha sido fundamental en la comprensión de los mecanismos generales de los procesos regenerativos4,7,8,9,10.
Como la amputación de la cola involucra múltiples tejidos además de la médula espinal, que es diferente de lo que sucede después de la LME humana, se necesita un paradigma de lesión más relevante para el estudio de la LME. Nos hemos basado en estudios utilizados en el pasado11 para generar descripciones exhaustivas de paradigmas de lesión5,12,13,14 y diferentes métodos para el estudio de SCI12,13,14,15,16,17,18 . Después de la transección de la médula espinal, la porción caudal de la médula espinal se puede aislar para la expresión de ARN y proteínas y análisis de alto rendimiento14,19,20,21. Adicionalmente, las inyecciones intracelómicas de fármacos y moléculas pequeñas, así como la electroporación de ADNc, ARN o morfolinos, antes o después de la transección medular, permiten estudiar los efectos de estas moléculas en la prevención o tratamiento de la LME o de eventos específicos ocurridos después de la LME y la regeneración de la médula espinal13,14 . Además, la evolución de la lesión y los procesos regenerativos se pueden estudiar en diferentes momentos después de la lesión utilizando enfoques bioquímicos, moleculares, histológicos y funcionales12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Por último, todas las técnicas mencionadas pueden ser utilizadas en etapas no regenerativas, destacando una de las ventajas más importantes de utilizar Xenopus laevis como organismo modelo para estudiar sci, los estudios comparativos de mecanismos regenerativos y no regenerativos en una misma especie13,19,20,21,22. Este artículo presenta un protocolo para la transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis, comenzando con la estadificación y selección de los renacuajos regenerativos de Nieuwkoop y Faber (NF) etapa 50. Esto es seguido por la descripción de los procedimientos para la cirugía de la médula espinal para producir animales simulados y transectados, la atención postquirúrgica y, finalmente, el análisis de la recuperación funcional mediante la medición de la distancia de natación del renacuajo libre.
Protocol
Este protocolo proporciona suficiente información para realizar con éxito la transección de la médula espinal. Cabe destacar que existen excelentes protocolos detallados de estas técnicas publicados en otra parte14, que pueden complementar el aquí presentado. Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité de Bioética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Apareamiento natural de ranas
- De tres a cinco días antes del apareamiento, preinyectan por vía subcutánea ranas macho y hembra con 50 unidades de gonadotropina coriónica humana (hCG). Use la técnica de "garra de hierro" para restringir a las ranas; como las ranas son resbaladizas, use una red para rodear a la rana si es necesario. Inserte la punta de una aguja de 26 G x 1/2" posterior a la línea lateral, empujándola dorsalmente a una profundidad de 1 cm, entre la piel y el músculo.
- Antes del apareamiento, inyecte al macho 300 unidades y a la hembra 700 unidades de hCG.
- Para que se produzca el apareamiento, coloque al macho y a la hembra en 2 L de solución de Barth 0.1x inmediatamente después de enfriar la solución a 4 ° C durante 15 minutos para que se parezca a las condiciones de primavera y deje durante la noche a 18 ° C.
- Dieciséis horas después, recoge cuidadosamente los embriones con la ayuda de una pipeta pasteur de plástico, con la punta cortada, y colócalos en placas de Petri de 10 cm de diámetro. Retire la capa de gelatina embrionaria incubando los embriones con 25 ml de cisteína al 2% en agua destilada (pH 7.8; asegúrese de que la solución cubra los embriones) durante 5 min con una ligera agitación. Lavar 3 veces con agua destilada y 3 veces con 0,1x solución de Barth (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico ácido (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).
- Seleccione embriones sanos que tengan un color marrón y blastómeros que se dividan simétricamente. Coloque los embriones en placas de Petri de 10 cm de diámetro con 50 ml de solución de Barth 0.1x a una densidad de no más de 100 embriones por plato.
2. Ganadería
- Durante la primera semana, mantenga los embriones a 18 °C hasta que salgan del saco vitelino. Durante este tiempo, cambie la solución de Barth todos los días, y retire los embriones muertos blanquecinos y renacuajos que presenten cualquier alteración anatómica visible o renacuajos sin ningún movimiento de natación.
- Después de la primera semana, transfiera los renacuajos al agua libre de cloro en tanques de plástico a una densidad de 10 animales por litro. Cultive renacuajos a 20-21 ° C con un ciclo de luz de 12 h / oscuridad de 12 h, con piedras de oxígeno disponibles en cada tanque para airear el agua y alimentado una vez al día con 0,5 mg por animal. Reemplace el agua una vez a la semana y verifique diariamente si hay desechos acumulados y animales muertos24.
3. Puesta en escena
- De tres a cuatro semanas después de la fertilización, coloque a los animales en una placa de Petri; luego, uno por uno, verifique la morfología y la apariencia de las extremidades anteriores y posteriores. Si es necesario, anestesiar a los animales colocando los animales en una placa de Petri con 50 ml de mesilato de tricaína al 0,02% en solución de Barth 0,1x para una mejor manipulación. Después de no más de 2 minutos, coloque a los animales en una solución de Barth 0.1x para la recuperación de la anestesia.
- Busque las siguientes características anatómicas de los animales en estadio 5025: extremidades anteriores que acaban de aparecer y son esféricas (Figura 1); extremidades posteriores que sobresalen y son esféricas (Figura 1).
NOTA: Los animales de las etapas 49 a 51 pueden ser utilizados para este procedimiento (Figura 1); para obtener más información acerca de las etapas, consulte nieuwkoop y la tabla normal de Faber de Xenopus laevis25.
4. Cirugía: transección de la médula espinal y animales operados simuladamente
- Anestesiar los renacuajos de etapa 50 colocándolos en una placa de Petri con 50 ml de mesilato de tricaína al 0,02% en solución de Barth 0,1x durante 2 min.
- Con la ayuda de una cucharada y fórceps, coloque el renacuajo, dorsal hacia arriba, sobre un trozo húmedo de gasa en la mitad superior de una placa de Petri de vidrio.
- Realice una incisión de la piel y los músculos dorsales a nivel torácico medio (Figura 2A, B) utilizando tijeras de resorte de microdisección.
- Para los animales simulados de control, asegúrese de que el tamaño de la incisión sea de solo ~ 0.2 mm (Figura 2C); no dañan la médula espinal (Figura 2D,D').
- Para los animales transectados, realice una segunda incisión de ~0,2 mm (Figura 2C) para transectar completamente la médula espinal (Figura 2E, E').
5. Cuidados postquirúrgicos
- Después de la cirugía, transfiera los renacuajos a un tanque que contenga 0.5 L de 0.1x solución de Barth con 1x Penicilina-estreptomicina, a una densidad de 10-12 animales por tanque. Mantenga los animales transectados y controle a los animales simulados en tanques separados.
NOTA: Los renacuajos se recuperarán de la anestesia en un par de minutos. - Mantenga los renacuajos con aireación a una temperatura de 20-21 °C.
- Cambie la solución de Barth con antibióticos cada dos días hasta el final del experimento.
- Comience a alimentar a los animales un día después de la cirugía, una vez al día.
- Eliminar animales muertos.
6. Ensayo de natación
- Obtenga una caja con iluminación LED desde el interior, cubierta con una lámina de poliestireno transparente, que permita el paso de la luz.
- Instale una cámara sobre la caja LED.
- Coloque una placa de Petri de 15 cm de diámetro encima de la caja, llena con 100 ml de solución de Barth 0.1x.
- Un día después de la transección, coloque un renacuajo en la placa de Petri y déjelo durante un período de adaptación de 5 minutos.
- Después de la adaptación, comience a rastrear en video el comportamiento de natación libre utilizando el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos.
- Después de completar el video, transfiera el renacuajo de regreso a su tanque.
- Repita el seguimiento de vídeo 5, 10, 15 y 20 días después de la transección (Figura 3).
7. Consideraciones bioéticas
NOTA: La mortalidad de los animales después de la cirugía simulada y la transección es del 13% y 30%, respectivamente. Además, se necesita un mínimo de 15-20 animales por grupo para el análisis estadístico. Por lo tanto, comience con 23 animales simulados y 26 transectados.
- Anestesiar a los animales con mesilato de tricaína al 0,02% durante 2 min para asegurar la reducción de la actividad neuronal y motora y el dolor antes de la cirugía.
- Después de la cirugía, revise a los animales para que se recuperen de la anestesia. Además, alimente y revise a los animales diariamente.
- Después de terminar el ensayo de natación, sacrifique a los animales con una sobredosis de mesilato de tricaína (mesilato de tricaína al 1% preparado en solución de bicarbonato de sodio de 30 mM).
Representative Results
El protocolo aquí descrito permite el estudio de la regeneración de la médula espinal en Xenopus laevis. Los efectos de tratamientos farmacológicos específicos y la contribución de la expresión génica específica en la regeneración de la médula espinal se pueden evaluar midiendo sus efectos sobre la recuperación de la natación. La distancia total de natación se traza contra los días posteriores a la lesión para comparar los animales de control y tratados en un punto de tiempo específico o durante un período específico. La recuperación de la función motora a través del tiempo se ejemplifica en la Figura 3, que muestra la distancia de natación a los 5, 10, 15 y 20 días después de la transección. A los 5 días después de la transección, los animales nadaron un promedio de 0,7 m en 5 min, mostrando una capacidad de natación reducida. Esta capacidad aumentó con el paso de los días, ya que se observó un promedio de 2,1 y 3,1 m/5 min después de 10 y 15 días después de la transección, respectivamente, y se observó una recuperación completa de las capacidades de natación a los 20 días después de la transección, con un promedio de 5,7 m/5 min.
Figura 1: Puesta en escena del renacuajo Xenopus. Imágenes representativas de las etapas 49-51, mostrando las extremidades delanteras y traseras para referencia de estadificación animal. Barras de escala = 2 mm. Las ampliaciones de la región en caja se muestran en la parte inferior derecha de cada imagen. Barras de escala = 1 mm. En la etapa 49, las extremidades anteriores no se observan, mientras que las extremidades posteriores solo están apareciendo, mostrando una forma esférica. La etapa 50 presenta extremidades anteriores que acaban de aparecer, mostrando una forma esférica y extremidades posteriores que sobresalen con una forma esférica. En la etapa 51, las extremidades anteriores presentan una forma esférica sobresaliente y las extremidades posteriores una forma alargada que sobresale. Los contornos discontinuos muestran las extremidades delanteras y traseras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Transección de la médula espinal. (A) Imagen representativa que muestra el posicionamiento correcto del animal, dorsal hacia arriba, para la realización de la cirugía. Barra de escala = 2 mm. (B) La ampliación de A muestra la ubicación y el alcance de la lesión. La cruz roja muestra la ubicación exacta del sitio de la lesión en el nivel torácico de la médula espinal, y la línea discontinua muestra la extensión de la lesión. Barra de escala = 1 mm. (C) Imagen representativa que muestra una vista lateral del nivel torácico de la médula espinal. Se muestra la extensión de la incisión simulada y la transección. Las líneas discontinuas delinean los límites de la médula espinal. Barra de escala = 1 mm. (D) Imagen representativa que muestra un animal simulado con la médula espinal intacta. Barras de escala = 1 mm. (E) Imagen representativa que muestra un animal transectado con una médula espinal interrumpida. Barras de escala = 1 mm. Las ampliaciones de la región en caja se muestran en la parte inferior derecha de cada imagen (D' y E'). Barras de escala = 1 mm. Abreviaturas: S = incisión simulada; T = transección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recuperación de la función de natación a lo largo del tiempo. Diagrama de puntos representativo de la distancia de natación recorrida por los animales transectados en 5 min a los 5, 10, 15 y 20 días después de la transección. En la parte superior se muestran muestras de trayectorias de natación. Los datos presentados como media ± SEM de 10 renacuajos. Abreviaturas: dpT = días posteriores a la transección; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo descrito en este documento es un excelente método para realizar SCI y evaluar la recuperación funcional. Para la reproducibilidad, es esencial cultivar renacuajos sanos y elegir animales que sean similares en tamaño. La falta de una alimentación adecuada genera estrés nutricional, lo que se traduce en escasas capacidades regenerativas26; por lo tanto, se debe prestar especial atención a la alimentación con renacuajos. A medida que los renacuajos alcanzan la etapa 50 después de 3-4 semanas, pueden criarse a temperaturas más altas para acelerar el proceso de crecimiento, siendo óptimo 18-25 °C27. La calidad del agua es importante, ya que los animales son sensibles a las condiciones del agua y a los productos químicos. Las condiciones óptimas del agua incluyen el uso de agua filtrada con carbón y libre de cloro con los siguientes parámetros: pH (6.5-7.5), cloruro (<0.02 mg / L), conductividad del agua (1.0 mS / cm ± 0.1 unidades), cobre (<0.3 mg / L); dureza del carbonato (KH: 5-10 dKH); dureza general (GH: 6-16 dGH); nitrato (NO3: <20 mg/L); y nitrito (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. Además, para evitar la contaminación, los tanques de plástico deben limpiarse una vez a la semana para criar animales o cada dos días después de la cirugía lavándose bien con agua sin cloruro y una esponja; debe evitarse el detergente.
Para una mejor tasa de supervivencia después de la cirugía, los renacuajos no deben exponerse a la anestesia durante largos períodos (no más de 2 min). Además, se recomienda anestesiar un renacuajo a la vez. Como los animales necesitan mantenerse hidratados, mantenga a los animales inmersos en solución todo el tiempo antes y después de la cirugía, y vierta la solución con una cuchara sobre el renacuajo antes de comenzar la cirugía. Asegúrese de que el daño sea lo suficientemente extenso como para cubrir toda la médula espinal, pero no demasiado extenso, ya que puede inducir una recuperación funcional deficiente o la muerte. Si la notocorda está dañada, el animal se doblará y la recuperación funcional se verá afectada. Si el daño se extiende más allá de la notocorda, la probabilidad de muerte aumenta14. Durante el ensayo de natación, la grabación se considera correcta si el software identifica a cada animal con una sombra azul; de lo contrario, la grabación debe repetirse. Es importante evitar el movimiento y los cambios de aire o luz durante el proceso de grabación para evitar errores de grabación.
Todavía hay muchas preguntas abiertas sobre los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al daño y la regeneración de la médula espinal. El protocolo descrito en este trabajo se puede utilizar para estudiar la contribución de diferentes eventos celulares, expresión génica y tratamientos sobre la recuperación funcional, determinados mediante la medición de las capacidades de natación. Además, se pueden aplicar muchas otras técnicas a los animales operados. La médula espinal puede aislarse para realizar extracción de proteínas y/o ARNm14 para estudiar perfiles de expresión proteica y génica tras daño y tratamiento19,20. Esta cirugía también ha sido la base para estudiar la respuesta celular de la médula espinal22 y el comportamiento de las células progenitoras madre neurales12,13,22 después de una lesión medular. Las cascadas de señalización implicadas en la regeneración de la médula espinal también se han estudiado utilizando el paradigma del daño medular descrito en este documento23. En resumen, el protocolo aquí descrito es un excelente modelo para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal y se ha utilizado para muchos estudios que han contribuido al conocimiento existente sobre el tema.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas de investigación de: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
| ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
| Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
| Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
| Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
| HEPES | Gibco | 11344-041 | |
| Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
| KCl | Merck Millipore | 104936 | |
| LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
| MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
| Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
| NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
| Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
| Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| pH meter | |||
| Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
| Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
| Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
| Sterilized gauze | |||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
| Tablespoon | |||
| Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
| Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |
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