Summary
Xenopus laevis 올챙이 척수 transection은 흉부 수준에서 척수를 완전히 절단하는 횡단 절단을 만들어 척수 손상 및 재생을 연구하는 관련 손상 방법입니다.
Abstract
척수 손상 (SCI)은 중추 신경계 (CNS) 운동 및 감각 신경에 영향을 미치는 영구적 인 고통으로 부상 부위 아래의 마비를 일으 킵니다. 현재까지 SCI에 대한 기능적 회복 요법은 없으며, SCI 이후에 발생하는 많은 복합체 및 동적 사건에 대한 명확성이 부족합니다. 많은 비 포유류 유기체는 텔레 오스트 물고기, 우로델 양서류 및 제노푸스 laevis 올챙이를 포함한 아누란 양서류의 애벌레 단계와 같은 심각한 SCI 후에 재생 될 수 있습니다. 이들은 SCI에 대한 반응과 성공적인 재생 과정의 기초가되는 메커니즘을 연구하고 이해하는 진정한 모델 유기체입니다. 이러한 유형의 연구는 SCI 치료 개입에 대한 잠재적 표적의 확인으로 이어질 수 있습니다. 이 기사에서는 축산, 수술, 수술 후 치료 및 기능 테스트 평가를 포함하여 Xenopus laevis 올챙이 척수 횡단을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 손상 방법은 세포, 분자 및 유전 적 메커니즘을 연구함으로써 척수 재생의 여러 단계를 해명하는 데뿐만 아니라 SCI 후 및 척수 재생 동안 조직 학적 및 기능적 진화를 해명하는 데 적용될 수 있습니다.
Introduction
척수 손상 (SCI)은 매년 전 세계적으로 약 250,000-500,000 사람들에게 영향을 미치는 고통입니다1. 이러한 높은 유병률 외에도 SCI는 감각 및 운동 신경에 영향을 미쳐 부상 부위 아래에 마비를 일으키고 CNS의 제어에서 일부 내부 장기의 연결을 끊습니다. CNS의 일부인 척수는 재생이 불가능하며, 고통의 복잡성과 관련된 모든 과정에 대한 완전한 이해가 부족하기 때문에 기능적 회복을 허용하는 효율적인 치료법이 아직 없습니다.
중증 SCI2,3,4 후에 척수를 재생시킬 수 있는 텔레오스트 어류, 우로델 양서류 및 애벌레 단계와 같은 비포유류 유기체는 성공적인 재생 사건을 지배하는 과정을 연구하고 포유류 재생의 실패를 이해하기위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 이러한 이해는 SCI에 대한 새로운 치료 목표와 가능한 치료법을 개발하기위한 독창적 인 통찰력을 제공 할 수 있기 때문에 큰 관심사입니다.
아누란 개구리 인 Xenopus laevis는 SCI를 연구하는 훌륭한 모델 유기체입니다. 올챙이 단계에서 우수한 재생 능력을 가지고 있으며, 이는 변형 중에 점진적으로 손실되어 재생 및 비 재생 단계에서 실험을 허용합니다3,5. Xenopus laevis 올챙이에서 SCI를 연구하기위한 확립 된 부상 방법은 근육, notochord 및 척수와 같은 조직을 포함하여 꼬리 전체가 제거되는 꼬리 절단으로 구성됩니다6. 이 접근법은 재생 과정의 일반적인 메커니즘에 대한 이해에 도움이되었습니다4,7,8,9,10.
꼬리 절단은 척수 이외에 여러 조직을 포함하기 때문에 이는 인간 SCI 이후에 일어나는 일과 다르기 때문에 SCI의 연구에보다 관련성이 높은 손상 패러다임이 필요합니다. 우리는 부상 패러다임에 대한 포괄적 인 설명을 생성하기 위해 과거11에서 사용 된 연구에 의존했습니다.5,12,13,14 및 SCI12,13,14,15,16,17,18 연구를위한 다양한 방법 . 척수 절개 후, 척수의 꼬리 부분은 RNA 및 단백질 발현 및 고처리량 분석을 위해 단리될 수 있다14,19,20,21. 또한, 약물 및 소분자의 인트레이스롬성 주사뿐만 아니라 척수 횡단 전후에 cDNA, RNA 또는 모르폴리노의 전기천공은 SCI의 예방 또는 치료 또는 SCI 및 척수 재생 후에 발생하는 특정 사건에 대한 이러한 분자의 효과에 대한 연구를 가능하게 합니다13,14 . 또한, 부상 진화 및 재생 과정은 생화학적, 분자적, 조직학적, 기능적 접근법 12,13,14,17,19,20,21,22,23을 사용하여 부상 후 다른 타이밍에서 연구 될 수 있습니다.
마지막으로, 앞서 언급 한 모든 기술은 비 재생 단계에서 사용될 수 있으며, 동일한 종에서 재생 및 비 재생 메커니즘에 대한 비교 연구 인 SCI를 연구하기 위해 모델 유기체로 Xenopus laevis를 사용하는 가장 중요한 이점 중 하나를 강조합니다 13,19,20,21,22. 이 논문은 재생 Nieuwkoop 및 Faber (NF) 단계 50 올챙이의 준비 및 선택부터 시작하여 Xenopus laevis 올챙이 척수 횡단에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 가짜 및 횡단 동물을 생산하기위한 척수 수술의 절차, 수술 후 치료, 그리고 마지막으로 자유 올챙이 수영 거리의 측정에 의한 기능 회복의 분석에 대한 설명이 뒤 따른다.
Protocol
이 프로토콜은 척수 횡단을 성공적으로 수행하기에 충분한 정보를 제공합니다. 참고로, 다른 곳에 출판된 이러한 기술들에 대한 우수한 상세한 프로토콜들이 있다.14, 이는 여기에 제시된 것을 보완할 수 있다. 모든 동물 절차는 생물 과학 학부, Pontificia Universidad Católica de Chile의 생명 윤리 및 생물 안전위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 개구리의 자연 짝짓기
- 짝짓기 삼 ~ 5 일 전에 수컷과 암컷 개구리에게 50 단위의 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG)을 피하 주사하십시오. 개구리를 제지하기위한 "철 발톱"기술을 사용하십시오. 개구리가 미끄럽기 때문에 필요한 경우 그물을 사용하여 개구리를 둘러 쌉니다. 26G x 1/2" 바늘 후방의 끝을 횡선에 삽입하고 피부와 근육 사이의 1cm 깊이까지 등쪽으로 밀어 넣습니다.
- 짝짓기 전에 수컷에게 300 단위를, 암컷에게 700 단위의 hCG를 주입하십시오.
- 교미가 일어나도록 하기 위해, 수컷과 암컷을 스프링 조건과 유사하게 4°C에서 15분 동안 냉각시킨 직후에 0.1x Barth 용액 2 L에 놓고 18°C에서 밤새 방치한다.
- 16 시간 후, 팁이 잘린 플라스틱 파스퇴르 피펫의 도움으로 배아를 조심스럽게 모으고 직경 10cm 페트리 접시에 놓습니다. 배아를 증류수 중의 2% 시스테인 25 mL와 함께 인큐베이션하여 배아 젤리코트를 제거하고(pH 7.8; 용액이 배아를 덮도록 보장함) 약간의 교반으로 5분 동안 배양하였다. 증류수로 3회, 0.1x 바르트 용액 (8.9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238.1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산 (HEPES); 81.14 μM MgSO4; 33.88 μM Ca(NO3)2; 40.81 μM CaCl2, pH 7.6)로 3회 세척한다.
- 갈색을 띠고 대칭적으로 블라스토미어를 나누는 건강한 배아를 선택하십시오. 배아를 직경 10cm 페트리 접시에 50mL의 0.1x 바르트 용액과 함께 접시당 100개 이하의 배아 밀도로 놓습니다.
2. 축산
- 첫 주 동안, 배아가 비텔린 낭에서 내릴 때까지 18 °C에서 유지하십시오. 이 기간 동안 매일 Barth 용액을 바꾸고 수영 운동없이 눈에 띄는 해부학 적 변화나 올챙이를 나타내는 희끄무레 한 죽은 배아와 올챙이를 제거하십시오.
- 첫 주 후, 올챙이를 리터 당 10 마리의 동물 밀도로 플라스틱 탱크의 염소가없는 물로 옮깁니다. 올챙이를 20-21 °C에서 12-h 빛 / 12-h 암주기로 성장시키고, 각 탱크에 산소 돌을 사용하여 물을 통기시키고 동물 당 0.5mg을 하루에 한 번 먹입니다. 일주일에 한 번 물을 교체하고 매일 축적 된 폐기물과 죽은 동물을 확인하십시오24.
3. 스테이징
- 수정 후 삼 ~ 사주 후에 동물을 페트리 접시에 넣으십시오. 그런 다음 앞다리와 뒷다리의 형태와 모양을 하나씩 확인하십시오. 필요한 경우, 더 나은 조작을 위해 0.1x Barth 용액에 0.02% 트리카인 메실레이트 50 mL가 있는 페트리 접시에 동물을 넣어 동물을 마취시킨다. 2 분 이내의 후, 마취로부터의 회복을 위해 동물을 0.1x Barth 용액에 넣으십시오.
- 50 단계 동물의 다음과 같은 해부학 적 특성을 찾으십시오.25 : 방금 나타나고 구형 인 앞다리 (그림 1); 돌출되어 구형인 뒷다리(그림 1).
참고: 49단계부터 51단계까지의 동물을 이 절차에 사용할 수 있습니다(그림 1). 스테이지에 대한 자세한 내용은 Nieuwkoop 및 Faber의 Xenopus laevis25 정상 표를 참조하십시오.
4. 수술 : 척수 횡단 및 가짜 수술 동물
- 50 단계 올챙이를 0.1x Barth 용액에 0.02 % 트리케인 메실레이트 50 mL와 함께 페트리 접시에 넣고 2 분 동안 마취하십시오.
- 큰 스푼과 포셉의 도움으로 올챙이, 등쪽 옆구리를 유리 페트리 접시의 상반부에있는 젖은 거즈 조각에 놓습니다.
- 미세 해부 스프링 가위를 사용하여 흉부 중간 수준에서 피부와 등쪽 근육을 절개합니다 (그림 2A, B).
- 대조군 가짜 동물의 경우 절개 크기가 ~ 0.2mm에 불과한지 확인하십시오 (그림 2C). 척수를 손상시키지 마십시오(그림 2D,D').
- 횡단 동물의 경우 척수를 완전히 횡단하기 위해 ~ 0.2mm (그림 2C)의 두 번째 절개 (그림 2E, E')를 수행하십시오.
5. 수술 후 관리
- 수술 후, 올챙이를 탱크 당 10-12 마리의 동물 밀도로 1x 페니실린 스트렙토 마이신과 함께 0.1x Barth 용액 0.5 L를 함유 한 탱크로 옮깁니다. 횡단 된 가짜 동물을 별도의 탱크에 보관하고 통제하십시오.
참고 : 올챙이는 몇 분 안에 마취에서 회복됩니다. - 올챙이를 폭기로 20-21 °C의 온도에서 유지하십시오.
- 실험이 끝날 때까지 매일 항생제로 Barth 용액을 변경하십시오.
- 수술 후 하루 하루, 하루에 한 번 동물에게 먹이를 주기 시작하십시오.
- 죽은 동물을 제거하십시오.
6. 수영 분석
- 빛이 통과 할 수있는 투명한 폴리스티렌 시트로 덮인 내부에서 LED 조명이있는 상자를 얻으십시오.
- LED 상자 위에 카메라를 설치합니다.
- 직경 15cm 페트리 접시를 상자 위에 놓고 100mL의 0.1x Barth 용액으로 채운다.
- 어느 날 transection을 후, 페트리 접시에 올챙이를 놓고 5 분 적응 기간 동안 떠납니다.
- 적응 후 참조 된 소프트웨어 ( 자료 표 참조)를 사용하여 자유 수영 행동을 5 분 동안 비디오 추적을 시작하십시오.
- 비디오가 완료되면 올챙이를 다시 탱크로 옮깁니다.
- 횡단 후 5일, 10일, 15일 및 20일 동안 비디오 추적을 반복합니다(그림 3).
7. 생명 윤리적 고려 사항
참고 : 가짜 수술과 transection을 한 후 동물의 사망률은 각각 13 %와 30 %입니다. 또한 통계 분석을 위해 그룹당 최소 15-20 마리의 동물이 필요합니다. 따라서 23 개의 가짜와 26 마리의 횡단 동물로 시작하십시오.
- 수술 전에 신경 및 운동 활동과 통증의 감소를 보장하기 위해 2 분 동안 0.02 % 트리카인 메실레이트로 동물을 마취하십시오.
- 수술 후 마취에서 회복 할 동물을 확인하십시오. 또한 매일 동물에게 먹이를주고 확인하십시오.
- 수영 분석을 마친 후, 트리카인 메실레이트의 과다 복용으로 동물을 희생시킨다 (30 mM 중탄산나트륨 용액으로 제조된 1% 트리카인 메실레이트).
Representative Results
본원에 기재된 프로토콜은 제노푸스 laevis에서 척수 재생의 연구를 허용한다. 특정 약리학 적 치료의 효과와 척수 재생에서 특정 유전자 발현의 기여는 수영 회복에 미치는 영향을 측정함으로써 평가할 수 있습니다. 총 수영 거리는 특정 시점 또는 지정된 기간 동안 대조군과 치료 된 동물을 비교하기 위해 부상 후 일에 대해 플롯됩니다. 시간을 통한 운동 기능의 회복은 그림 3에 예시되어 있으며, 횡단 후 5, 10, 15 및 20일에서의 수영 거리를 보여줍니다. 횡단 후 5 일 동안, 동물들은 5 분 동안 평균 0.7m를 수영하여 수영 능력이 감소했습니다. 이 용량은 횡단 후 10 일과 15 일 후에 각각 평균 2.1 및 3.1 m / 5 분이 관찰되었고, 횡단 후 20 일에서 수영 능력의 완전한 회복이 관찰되어 평균 5.7m / 5 분으로 지나가는 날에 따라 증가했습니다.
그림 1: 제노푸스 올챙이 스테이징. 단계 49-51의 대표적인 이미지로, 동물 스테이징 참고를 위한 앞다리와 뒷다리를 보여준다. 스케일 바 = 2mm. 박스형 영역의 배율은 각 이미지의 오른쪽 하단에 표시됩니다. 스케일 바 = 1mm. 49 단계에서는 앞다리가 관찰되지 않고 뒷다리가 나타나 구형 모양을 보여줍니다. 스테이지 50은 막 나타나는 앞다리가 구형이고 뒷다리가 구형으로 돌출되어 있음을 보여줍니다. 단계 51에서, 앞다리는 돌출된 구형 형상을 나타내고 뒷다리는 돌출된 길쭉한 형상을 나타낸다. 파선 윤곽선은 앞다리와 뒷다리를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 척수 횡단. (A) 수술을 수행하기 위한 동물, 등쪽 위쪽의 정확한 위치를 보여주는 대표적인 이미지. 스케일 바 = 2mm. (B) A의 배율 은 부상의 위치와 정도를 보여줍니다. 빨간 십자가는 척수의 흉부 수준에서 부상 부위의 정확한 위치를 보여 주며 파선은 부상의 정도를 보여줍니다. 스케일 바 = 1 mm. (C) 척수의 흉부 수준의 측면도를 보여주는 대표적인 이미지. 가짜 절개와 transection의 확장이 표시됩니다. 파선은 척수의 한계를 묘사합니다. 스케일 바 = 1 mm. (D) 척수가 손상되지 않은 가짜 동물을 보여주는 대표적인 이미지. 스케일 막대 = 1 mm. (E) 척수가 중단된 횡단된 동물을 보여주는 대표적인 이미지. 스케일 바 = 1mm. 박스형 영역의 배율은 각 이미지의 오른쪽 하단(D' 및 E')에 표시됩니다. 스케일 바 = 1mm. 약어: S = 가짜 절개; T = 횡단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 시간 경과에 따른 수영 기능 회복. 횡단 후 5, 10, 15 및 20 일에서 5 분에서 횡단 동물에 의해 커버되는 수영 거리의 대표적인 점도표. 수영 궤적의 샘플이 상단에 표시됩니다. 10개의 올챙이로부터의 SEM± 평균으로 제시된 데이터. 약어 : dpT = 횡단 후 일; SEM = 평균의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 SCI를 수행하고 기능적 회복을 평가하는 우수한 방법이다. 재현성을 위해서는 건강한 올챙이를 키우고 크기가 비슷한 동물을 선택하는 것이 필수적입니다. 적절한 수유가 부족하면 영양 스트레스가 발생하여 재생 능력이 저하됩니다26; 따라서 올챙이 먹이기에 특별한주의를 기울여야합니다. 올챙이는 3-4 주 후에 50 단계에 도달하면 성장 과정을 가속화하기 위해 더 높은 온도에서 사육 될 수 있으며 18-25 ° C는 최적입니다27. 동물들은 수질 조건과 화학 제품에 민감하기 때문에 수질이 중요합니다. 최적의 물 조건은 pH (6.5-7.5), 염화물 (<0.02 mg / L), 물의 전도도 (1.0 mS / cm ± 0.1 단위), 구리 (<0.3 mg / L)의 매개 변수로 여과 된 염소가없는 물을 사용하는 것을 포함합니다. 탄산염 경도 (KH: 5-10 dKH); 일반적인 경도 (GH : 6-16 dGH); 질산염 (NO3: <20 mg/L); 및 아질산염 (NO2: <0.1 mg/L)14,27,28. 또한 오염을 피하기 위해 플라스틱 탱크는 동물을 기르기 위해 일주일에 한 번 청소하거나 수술 후 염화물이없는 물과 스폰지로 철저히 씻어서 청소해야합니다. 세제는 피해야합니다.
수술 후 더 나은 생존율을 위해, 올챙이는 오랜 기간 (2 분 이상) 마취에 노출되어서는 안됩니다. 또한 한 번에 하나의 올챙이를 마취하는 것이 좋습니다. 동물들은 수분을 유지해야하므로 수술 전후에 항상 동물을 용액에 담그고 수술을 시작하기 전에 올챙이 위에 숟가락으로 용액을 부으십시오. 손상이 전체 척수를 덮을만큼 충분히 광범위하지만 기능 회복이나 사망을 유발할 수 있으므로 너무 광범위하지 않은지 확인하십시오. notochord가 손상되면 동물이 구부러지고 기능 회복이 영향을받습니다. 피해가 노토코스를 넘어 확장되면 사망 확률이 증가합니다14. 수영 분석 중에 소프트웨어가 각 동물을 파란색 그림자로 식별하면 기록이 올바른 것으로 간주됩니다. 그렇지 않으면 녹음을 반복해야합니다. 녹음 과정에서 움직임과 공기 또는 빛의 변화를 피하여 녹음 실수를 방지하는 것이 중요합니다.
척수 손상과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 많은 공개 질문이 여전히 있습니다. 이 연구에 설명 된 프로토콜은 수영 능력을 측정하여 결정되는 기능 회복에 대한 다양한 세포 사건, 유전자 발현 및 치료법의 기여도를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 많은 다른 기술들이 조작된 동물에 적용될 수 있다. 척수는 단백질 및/또는 mRNA 추출14을 수행하여 손상 및 치료 후 단백질 및 유전자 발현 프로필을 연구하기 위해 단리될 수 있다19,20. 이 수술은 또한 척수 손상 후 척수 세포 반응22 및 신경 줄기 전구 세포12,13,22의 행동을 연구하기위한 기초가되었습니다. 척수 재생에 관여하는 신호전달 캐스케이드는 또한 본원에 기술된 척수 손상 패러다임을 사용하여 연구되었다23. 요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 척수 손상 및 재생을 연구하는 훌륭한 모델이며 주제에 대한 기존 지식에 기여한 많은 연구에 사용되었습니다.
Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 PG Slater: FONDECYT N° 3190820의 연구 보조금으로 지원되었습니다. J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
| ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
| Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
| Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
| Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
| HEPES | Gibco | 11344-041 | |
| Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
| KCl | Merck Millipore | 104936 | |
| LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
| MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
| Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
| NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
| Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
| Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| pH meter | |||
| Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
| Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
| Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
| Sterilized gauze | |||
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
| Tablespoon | |||
| Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
| Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |
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