Summary
Dit artikel beschrijft hoe in vivo (met behulp van oppervlakte- en naaldelektrodearrays) en ex vivo (met behulp van een diëlektrische cel) elektrische impedantiemyografie op de gastrocnemiusspier van knaagdieren kan worden uitgevoerd. Het zal de techniek demonstreren bij zowel muizen als ratten en de beschikbare modificaties (d.w.z. zwaarlijvige dieren, pups) beschrijven.
Abstract
Elektrische impedantiemyografie (EIM) is een handige techniek die kan worden gebruikt in preklinische en klinische studies om de gezondheid en ziekte van spierweefsel te beoordelen. EIM wordt verkregen door een lage intensiteit, richtingsgerichte, elektrische stroom toe te passen op een spier van belang over een reeks frequenties (d.w.z. van 1 kHz tot 10 MHz) en de resulterende spanningen te registreren. Hieruit worden verschillende standaard impedantiecomponenten verkregen, waaronder de reactantie, weerstand en fase. Bij het uitvoeren van ex vivo metingen aan uitgesneden spieren kunnen ook de inherente passieve elektrische eigenschappen van het weefsel, namelijk de geleidbaarheid en relatieve permittiviteit, worden berekend. EIM is op grote schaal gebruikt bij dieren en mensen om spierveranderingen bij een verscheidenheid aan ziekten te diagnosticeren en te volgen, in relatie tot eenvoudige atrofie van onbruik, of als een maat voor therapeutische interventie. Klinisch gezien biedt EIM het potentieel om de progressie van de ziekte in de loop van de tijd te volgen en de impact van therapeutische interventies te beoordelen, waardoor de mogelijkheid wordt geboden om de duur van het klinische onderzoek te verkorten en de vereisten voor de steekproefomvang te verminderen. Omdat het niet-invasief of minimaal invasief kan worden uitgevoerd in levende diermodellen en mensen, biedt EIM het potentieel om te dienen als een nieuw translationeel hulpmiddel dat zowel preklinische als klinische ontwikkeling mogelijk maakt. Dit artikel bevat stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van in vivo en ex vivo EIM-metingen bij muizen en ratten, inclusief benaderingen om de technieken aan te passen aan specifieke omstandigheden, zoals voor gebruik bij pups of zwaarlijvige dieren.
Introduction
Elektrische impedantiemyografie (EIM) biedt een krachtige methode om de spierconditie te beoordelen, waardoor mogelijk de diagnose van neuromusculaire aandoeningen, het volgen van ziekteprogressie en de beoordeling van de respons op therapiemogelijk wordt 1,2,3. Het kan analoog worden toegepast op dierziektemodellen en mensen, waardoor een relatief naadloze vertaling van preklinische naar klinische studies mogelijk is. EIM-metingen kunnen eenvoudig worden verkregen met behulp van vier lineair geplaatste elektroden, waarbij de twee buitenste een pijnloze, zwakke elektrische stroom toepassen over een reeks frequenties (meestal tussen 1 kHz en ongeveer 2 MHz), en de twee binnenste de resulterende spanningen registreren1. Uit deze spanningen kunnen de impedantiekenmerken van het weefsel worden verkregen, waaronder de weerstand (R), een maat voor hoe moeilijk het is voor stroom om door het weefsel te gaan, en de reactantie (X) of "oplaadbaarheid" van het weefsel, een maat die verband houdt met het vermogen van het weefsel om lading op te slaan (capaciteit). Uit de reactantie en weerstand wordt de fasehoek (θ) berekend via de volgende vergelijking: 
, die een enkele summatieve impedantiemaat oplevert. Dergelijke metingen kunnen worden verkregen met behulp van elk multifrequent bio-impedantie-apparaat. Omdat myofiberen in wezen lange cilinders zijn, is spierweefsel ook zeer anisotroop, waarbij stroom gemakkelijker langs vezels stroomt daneroverheen 4,5. EIM wordt dus vaak in twee richtingen uitgevoerd: met de array langs de vezels geplaatst, zodat de stroom parallel aan hen loopt, en over de spier zodat de stroom loodrecht op hen stroomt. Bovendien kunnen in ex vivo metingen, waarbij een bekend volume weefsel wordt gemeten in een impedantiemeetcel, de inherente elektrische eigenschappen van de spier (d.w.z. de geleidbaarheid en relatieve permittiviteit) worden afgeleid6.
De term "neuromusculaire aandoeningen" definieert een breed scala aan primaire en secundaire ziekten die leiden tot structurele spierverandering en disfunctie. Dit omvat amyotrofische laterale sclerose en verschillende vormen van spierdystrofie, evenals eenvoudigere veranderingen in verband met veroudering (bijv. Sarcopenie), atrofie van het gebruik (bijvoorbeeld als gevolg van langdurig bedrust of microzwaartekracht) of zelfs letsel7. Hoewel de oorzaken overvloedig zijn en afkomstig kunnen zijn van het motorneuron, zenuwen, neuromusculaire juncties of de spier zelf, kan EIM worden gebruikt om vroege veranderingen in de spieren als gevolg van veel van deze processen te detecteren en om progressie of reactie op therapie te volgen. Bij patiënten met Duchenne spierdystrofie (DMD) is bijvoorbeeld aangetoond dat EIM ziekteprogressie en respons op corticosteroïden detecteert8. Recent werk heeft ook aangetoond dat EIM gevoelig is voor verschillende onbruiktoestanden, waaronder fractionele zwaartekracht9, zoals zou worden ervaren op de maan of Mars, en de effecten van veroudering10,11. Ten slotte, door voorspellende en machine learning-algoritmen toe te passen op de dataset die bij elke meting wordt verkregen (multifrequentie en richtingsafhankelijke gegevens), wordt het mogelijk om histologische aspecten van het weefsel af te leiden, waaronder myofibergrootte 12,13, ontstekingsveranderingen en oedeem14, en bindweefsel en vetgehalte15,16.
Verschillende andere niet-invasieve of minimaal invasieve methoden worden ook gebruikt om de spiergezondheid bij mens en dier te evalueren, waaronder naaldelektromyografie17 en beeldvormingstechnologieën zoals magnetische resonantiebeeldvorming, computertomografie en echografie 18,19. EIM laat echter duidelijke voordelen zien in vergelijking met deze technologieën. Elektromyografie registreert bijvoorbeeld alleen de actieve elektrische eigenschappen van de myofibermembranen en niet de passieve eigenschappen, en kan dus geen echte beoordeling van de spiersamenstelling of -structuur geven. In een bepaald opzicht zijn beeldvormingsmethoden nauwer verwant aan EIM, omdat ook zij informatie geven over de structuur en samenstelling van weefsel. Maar in zekere zin bieden ze te veel gegevens, waardoor gedetailleerde beeldsegmentatie en deskundige analyse nodig zijn in plaats van alleen een kwantitatieve output te leveren. Bovendien worden beeldvormingstechnieken, gezien hun complexiteit, ook sterk beïnvloed door de specifieke kenmerken van zowel de hardware als de software die wordt gebruikt, idealiter het gebruik van identieke systemen vereisen, zodat datasets kunnen worden vergeleken. Het feit dat EIM veel eenvoudiger is, betekent daarentegen dat het minder wordt beïnvloed door deze technische problemen en geen enkele vorm van beeldverwerking of deskundige analyse vereist.
Het volgende protocol demonstreert hoe in vivo EIM bij ratten en muizen kan worden uitgevoerd, met behulp van zowel niet-invasieve (surface array) als minimaal invasieve (subdermale naaldarray) technieken, evenals ex vivo EIM op vers weggesneden spieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van beth Israel Deaconess Medical Center onder protocolnummers (031-2019; 025-2019). Draag de juiste PBM-apparatuur om dieren te hanteren en houd u aan de IACUC-richtlijnen voor al het dierenwerk.
1. In vivo oppervlakte-EIM
- Plaats het dier in een anesthesiedoos om anesthesie te induceren.
OPMERKING: Voor ratten werden 1,5% -3,5% isofluraan en 2 O2 L·min-1 gebruikt en voor muizen werden 2% isofluraan en 1 O2 L·min-1 gebruikt. - Eenmaal volledig verdoofd, zoals aangegeven door de afwezigheid van respons na het knijpen van de voet van het dier, plaatst u de muis op de bank in een buikligging en gebruikt u de neuskegel om de anesthesie te handhaven met behulp van 1,5% isofluraan en een zuurstofstroom van 1 L·min-1.
- Plaats de te analyseren poot van het dier in een hoek van 45° met het heupgewricht (knie gestrekt) en bevestig de voet met medische tape.
- Gebruik een tondeuse om de vacht die de gastrocnemiusspier bedekt te trimmen.
- Breng een dikke laag ontharingscrème aan op de huid van het dier en laat het 1 min zitten. Gebruik vervolgens zout verzadigd gaas om het ontharingsmiddel te verwijderen. Herhaal dit proces tot drie keer totdat alle vacht die de gastrocnemiusspier bedekt, is verwijderd.
OPMERKING: Plaats een gaasje gedrenkt in zoutoplossing over de huid wanneer er geen metingen worden uitgevoerd om uitdroging van de huid te voorkomen. - Sluit de surface array (figuur 1) aan op het EIM-apparaat en laat de elektroden rusten op een stuk gaas gedrenkt in een zoutoplossing.
- Plaats de surface array direct op de huid over de gastrocnemius spier, longitudinaal georiënteerd op de spiervezels.
- Na controle op het juiste contact, dat wordt aangegeven door alle balken die groen lijken op de software die de stabiliteit van de 50 kHz weerstand, reactantie en fasewaarden weergeven, verwerft u de EIM-metingen.
OPMERKING: Curven moeten in realtime worden gecontroleerd om de juiste gegevensverzameling te garanderen. - Draai de oppervlaktearray 90° en verplaats deze op de huid over de gastrocnemius om de dwarsmetingen te verkrijgen (controleer op groene balken die de stabiliteit aangeven).
- Herhaal stap 1.7, 1.8 en 1.9 om in totaal vier metingen per spier te krijgen: twee longitudinale en twee transversale.
OPMERKING: Gebruik een ontharingsmiddel niet meer dan één keer (d.w.z. maximaal drie toepassingen in hetzelfde geval) om de twee weken om overmatige huidirritatie en letsel te voorkomen. Het is belangrijk om de metingen uit te voeren binnen ongeveer 5-10 minuten na het verwijderen van de ontharingscrème, omdat de ontwikkeling van gelokaliseerd huidoedeem geïnduceerd door het ontharingsmiddel van invloed kan zijn op de verzamelde impedantiegegevens. Herstel van dieren is onmiddellijk na het stoppen van isofluraan-anesthesie en de procedure vereist geen pijnstillende behandeling.
2. In vivo naald array EIM
- Verdoof het dier en bereid het been voor volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 1.1-1.4. Het is echter niet nodig om een ontharingsmiddel te gebruiken bij het uitvoeren van in vivo EIM met behulp van een naaldarray.
- Sluit de naaldarray (figuur 2A-F) aan op het EIM-apparaat en laat deze rusten in een weegboot met zoutoplossing. Controleer op connectiviteit en signaalstabiliteit (aangegeven door groene balken).
- Desinfecteer de huid en naalden met alcohol. Plaats de naald in een longitudinale positie in vergelijking met de myofibers en druk deze stevig in de huid totdat alle naalden de huid en de onderliggende spier binnendringen tot aan de plastic beschermkap op de array. Gegevens verzamelen.
- Verwijder de array voorzichtig en plaats deze opnieuw door de huid en in de spier in een hoek van 90° ten opzichte van de eerste meting, in de dwarsrichting. Gegevens verzamelen.
OPMERKING: Bij gebruik van naaldarrays mogen metingen slechts eenmaal in elke richting worden uitgevoerd om de impact van de naaldelektroden op de huid en het spierweefsel te verminderen. Als er een bloeding optreedt, veegt u het bloed voorzichtig weg voordat u de tweede meting uitvoert. Herstel van dieren is onmiddellijk na het stoppen van isofluraan-anesthesie en de procedure vereist geen pijnstillende behandeling.
3. Ex vivo EIM
- Bereid de ex vivo diëlektrische cel (figuur 2G,H), voeg een zoutoplossing toe aan de kamer en sluit de cel aan op het EIM-apparaat om de referentiewaarden te verkrijgen.
OPMERKING: De fase- en reactantiewaarden van zoutoplossing moeten constant op of in de buurt van nul blijven en de weerstandswaarden van zoutoplossing moeten constant blijven op ongeveer 100 ± 25 Ω over het frequentiebereik van 1 kHz tot 1 MHz. - Euthanaseer het dier volgens de respectieve IACUC-richtlijnen.
- Knip met een schaar de huid in de buurt van de achillespees. Trek met een pincet de huid in een opwaartse beweging om de onderliggende spieren en fascia te onthullen. Ontleed voorzichtig de biceps femoris die de gastrocnemiusspier bedekt en snijd de heupzenuw.
- Knip de achillespees om het distale uiteinde van de gastrocnemius- en soleusspieren te bevrijden en trek de pees voorzichtig omhoog terwijl u een schaar gebruikt om eventuele aanhechtingen te verwijderen. Zodra alle aanhechtingen zijn verwijderd, gebruikt u een schaar om het rostrale uiteinde van de soleusspier te knippen en te verwijderen.
- Gebruik een schaar om de hoofden van de gastrocnemiusspier rond de patella te ontleden.
OPMERKING: Na verwijdering van de gastrocnemiusspier is het belangrijk om de oorspronkelijke oriëntatie van de myofiber te onthouden. - Plaats de gastrocnemiusspier op een vel tandwas en snijd deze door met een scheermesje en een liniaal om een sectie van 10 mm x 10 mm uit het midden van de gastrocnemiusspier te verkrijgen.
OPMERKING: De diëlektrische celgrootte kan worden aangepast. Voor ratten werd een cel van 10 mm x 10 mm gebruikt en voor muizen een cel van 5 mm x 5 mm. - Plaats met behulp van een pincet voorzichtig de gastrocnemius in de diëlektrische cellen en zorg ervoor dat de vezels longitudinaal zijn georiënteerd (d.w.z. caudale en rostrale ledematen moeten de elektroden raken). Zorg ervoor dat de spier volledig in contact staat met de metalen elektroden.
- Bevestig het bovenste deel van de diëlektrische cel en steek twee monopolaire naalden (26 G) in de twee gaten. Sluit de draden van het EIM-apparaat aan op de ex vivo-cel in de volgende volgorde: (1: I +, 2: V +, 3: V-, 4: I-, waarbij I de stroomelektroden vertegenwoordigt en V de spanningselektroden). Verkrijg de longitudinale meting.
- Open de diëlektrische cel en heroriënteer de spier in de dwarsrichting door deze 90° te draaien. Bevestig de bovenkant van de diëlektrische cel opnieuw. Verkrijg de transversale meting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EIM kan in vele omstandigheden worden verkregen, waaronder oppervlakte-in vivo arrays (figuur 1), naald in vivo arrays (figuur 2A-F) en ex vivo diëlektrische cellen (figuur 2G,H).
EIM biedt een vrijwel onmiddellijke momentopname van de spierconditie op basis van de gemeten impedantiewaarden. Metingen worden snel verkregen en resulteren in een eenvoudig uitvoergegevensbestand waarvoor geen speciale software nodig is (figuur 3A). Inderdaad, elk multifrequent impedantie-apparaat dat gegevens voor individuele frequenties levert, kan een standaard .csv-uitgang produceren die onafhankelijk kan worden geopend. Het systeem dat in dit protocol wordt beschreven, biedt ook de naam en voorwaarden van het experiment, met waarden van fase, reactantie en weerstand voor elke proef op elke gemeten frequentie, binnen het uitvoerbestand. Om de reproduceerbaarheid te waarborgen, worden over het algemeen twee studies met longitudinale (trials 1 en 3) en transversale (trials 2 en 4) waarden verkregen en gemiddeld, en gebruikt voor alle daaropvolgende analyses.
Wanneer ze worden weergegeven als een functie van de frequentie, resulteren EIM-waarden in standaardcurven die kunnen worden geanalyseerd om valse of met artefacten besmette gegevens te detecteren. Dergelijke onregelmatigheden houden meestal verband met contactproblemen bij oppervlaktemetingen, wat resulteert in extreme waarden die worden waargenomen bij lage frequenties (meestal grote positieve of negatieve waarden). Representatieve curven worden weergegeven voor fasemetingen (figuur 3B), reactantie (figuur 3C) en weerstand (figuur 3D) voor longitudinale (blauwe cirkels) en transversale (grijze vierkanten). Een grafiek met de reactantie als functie van weerstand (Cole-Cole plot) in zowel longitudinale als transversale richtingen wordt ook weergegeven (figuur 3E). Deze stap is van cruciaal belang omdat het deel uitmaakt van de gegevenscontrole, waardoor de eenvoudige detectie van valse of met artefacten besmette gegevens mogelijk is. Als overmatig artefact (meestal als gevolg van slecht contact tussen de oppervlaktearray en de huid) wordt gedetecteerd, kunnen verschillende procedures worden gevolgd om het contact te verbeteren. Deze omvatten het aanbrengen van een extra toepassing van ontharingscrème, het bevochtigen van de huid gedurende ongeveer 1 minuut met een zout gedrenkt gaasje of het uitoefenen van zachte druk op de elektrode-array. Over het algemeen zal het eenvoudige proces van het meerdere keren herhalen van de meting ook helpen dit op te lossen.
EIM-metingen weerspiegelen de reactie van het spierweefsel op elektrische stroom over een breed scala aan frequenties, elk gericht op verschillende structuren. Lage frequenties (d.w.z. 5 kHz) dringen bijvoorbeeld niet door het myofibermembraan, waardoor een analyse wordt gegeven van de extracellulaire kenmerken die kunnen worden gebruikt om ontsteking en neutrofiele infiltratie te detecteren14. Daarentegen kunnen hoge frequenties (>1 MHz) celmembranen binnendringen en daarom zowel intracellulaire als extracellulaire ruimtes ondervragen en zijn ze gebruikt om spiervezel type1 te differentiëren.
Figuur 1: 3D-geprinte oppervlaktearray. Foto's van een oppervlaktearray die 3D-geprint was om oppervlakte-impedantiemetingen (zowel longitudinaal als transversaal) in muizen in vivo te verkrijgen. (A) Een foto van de oppervlaktearray die op het acquisitieapparaat is aangesloten. (B) Een close-up van de oppervlaktearray met het wiel dat wordt gebruikt om de array op 90° te draaien om zowel longitudinale als transversale metingen te verkrijgen. (C) Een close-up van de oppervlakte-elektroden. De oppervlakte-elektroden hebben de volgende kenmerken: elektroden breedte = 0,5 mm, buitenste elektroden lengte = 4 mm, binnenste elektroden lengte = 3 mm, en afstand tussen elektroden = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Andere arrays die kunnen worden gebruikt om specifieke experimentele ontwerpen te accommoderen. Foto's van: (A) een naaldenreeks die voor ratten wordt gebruikt en gecoat (met behulp van niet-metaalachtige nagellak) om de bijdrage van onderhuids vet te verminderen (2 mm ruimte, 4 mm diep, 2 mm coating); B) een naaldarray met een afstand van 2 mm en een diepte van 4 mm; C) een naaldarray met een afstand van 2 mm en een diepte van 3 mm; D) een naaldarray met een afstand van 2 mm en een diepte van 2 mm; E) een naaldenreeks voor kleinere dieren en jongen met een afstand van 1 mm en een diepte van 2 mm; F) een naaldarray met een afstand van 1 mm en een diepte van 1 mm; (G) een ex vivo diëlektrische cel op maat gemaakt voor volwassen muisspieren (5 mm x 5 mm); en (H) een ex vivo diëlektrische cel op maat gemaakt voor rattenspieren (10 mm x 10 mm). Wijzigingen (resultaten die hier niet worden gepresenteerd) om metingen te verkrijgen bij zwaarlijvige dieren (d.w.z. ob / ob- of db / db-muizen) kunnen worden uitgevoerd door de naaldlengte te vergroten, niet-geleidende coating toe te voegen en de naaldafstand te vergroten / verminderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gegevensoutput en representatieve curven verkregen bij muizen met in vivo oppervlakte-EIM in de longitudinale (blauwe) en transversale (grijze) richting. (A) Uitvoerbestand in .csv formaat verkregen na de verwerving van twee longitudinale (metingen 1 en 3, gekleurd in blauw) en twee transversale (metingen 2 en 4, gekleurd in grijs) EIM-metingen in vivo . De waarden worden aangegeven voor elke frequentie (kolom A). Analyses worden vervolgens uitgevoerd met behulp van de gemiddelde waarde van respectievelijk de longitudinale en transversale metingen. Informatie in cellen A1:B4 wordt automatisch ingevuld door de software, volgens de labels die zijn gekozen tijdens EIM-acquisitie. Representatieve curven voor zowel longitudinale (blauwe cirkels) als transversale (grijze vierkanten) waarden van fase (B), reactantie (C) en weerstand (D) als functie van de frequentie. In overeenstemming met standaardpraktijken op het gebied van impedantie wordt de x-as aangegeven met behulp van een logaritmische schaal. (E) Representatieve reactantiecurven als functie van de weerstand voor zowel longitudinale als transversale metingen. LP: longitudinale fase; TP: dwarse fase; LX: longitudinale reactantie; TX: transversale reactantie; LR: longitudinale weerstand; en TR: dwarsweerstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel biedt de basismethoden voor het uitvoeren van EIM bij knaagdieren, zowel in vivo als ex vivo. Om betrouwbare metingen te verkrijgen, is het van cruciaal belang om een reeks stappen uit te voeren. Ten eerste moet men de spier van belang goed identificeren, omdat elke spier verschillende reacties op ziekten, behandeling en pathologie zal hebben. Men moet er rekening mee houden dat de gegevens die zijn verkregen over één spier (bijv. Gastrocnemius) niet dezelfde informatie zullen opleveren als over een andere spier (bijv. tibialis anterior). Ten tweede moet men zorgvuldig de beste elektrode-array kiezen om de impedantiemetingen uit te voeren. Hoewel elk arraytype zowel voor- als nadelen heeft, is het belangrijk om een array te kiezen die past bij het experimentele ontwerp, rekening houdend met ziekteprogressie en het effect op de anatomie (bijv. Ernstige atrofie). Ten slotte stelt EIM onderzoekers in staat om binnen enkele seconden een ongelooflijke hoeveelheid gegevens te verzamelen, maar kwaliteitscontrole moet goed worden uitgevoerd om de afwezigheid van artefacten te garanderen.
Het EIM-systeem is op verschillende niveaus zeer aanpasbaar. Hoewel het hier gebruikte systeem is ontworpen voor klinische en preklinische gegevensverzameling, kan elk multifrequent impedantiemeetsysteem voor dit doel worden gebruikt, zolang het individuele frequentiegegevens levert. Over het algemeen bieden impedantiesystemen een standaard .csv bestand als uitvoer. Op dezelfde manier kunnen aanvullende wijzigingen worden aangebracht met betrekking tot de arrays, omdat alles wat echt nodig is, vier elektroden zijn die in een lijn worden geplaatst. In dit protocol zijn bijvoorbeeld verschillende op maat gemaakte elektroden gebruikt om aan de vereisten te voldoen, maar arrays kunnen worden aangepast aan individuele behoeften met behulp van eenvoudige (bijv. Epoxylijm, subdermale naalden) of complexe (bijv. 3D-printers) gereedschappen. Als alternatief kunnen de vier elektroden worden gecombineerd tot een enkele naald, zoals eerder beschreven20. In ons laboratorium zijn arrays ontwikkeld voor pups door de afstand tussen elektroden te verkleinen om ervoor te zorgen dat kleine spieren zowel in de longitudinale als in de dwarsrichting kunnen worden gemeten. Bij het werken met zwaarlijvige dieren, die een aanzienlijk grotere laag onderhuids vet hebben, wordt het gebruik van gedeeltelijk gecoate naaldelektroden aanbevolen. Dit maakt een grotere bijdrage van het spierweefsel aan de impedantiemeting mogelijk, terwijl de bijdrage van het vetweefsel wordt verminderd21.
Hoewel naaldmethoden en oppervlaktemethoden kunnen worden gebruikt bij zowel ratten als muizen, zoals beschreven en gedemonstreerd, wordt het over het algemeen aanbevolen om de naaldmetingen bij ratten te gebruiken, omdat deze sneller zijn omdat ze geen inspanning vereisen om de huid voor te bereiden. Bovendien betekent hun grotere formaat dat de naaldelektroden de spier slechts minimaal verwonden. Bij muizen worden, gezien hun kleine formaat, oppervlaktemetingen aanbevolen om spierletsel te voorkomen en gezien het feit dat de huidvoorbereiding relatief eenvoudig en snel is.
Elke EIM-techniek heeft zijn eigen beperkingen. Een belangrijke beperking is dat elektrode-arrays niet direct beschikbaar zijn via leveranciers en in plaats daarvan aangepaste generatie in het laboratorium vereisen. Om nieuwe onderzoekers te helpen, bevat dit protocol metingen voor verschillende arrays (zowel handgemaakt als 3D-geprint), en de auteurs zullen aangepaste arrays leveren of de gerelateerde CAD-bestanden op verzoek beschikbaar stellen. Zoals eerder vermeld, is de gegevenskwaliteit van cruciaal belang en kunnen extra problemen de gegevenskwaliteit voor elk van de meettypen (bijv. Oppervlak, naald en ex vivo) verstoren. Voor goede oppervlaktegegevens is het noodzakelijk om het haar volledig te verwijderen, en waarschijnlijk ook het stratum corneum van de huid, om de beste resultaten te krijgen met minimaal contactartefact. Het gebruik van het ontharingsmiddel betekent echter ook dat de huid na verloop van tijd langzaam oedemateus zal worden, dus het is noodzakelijk om de impedantiemetingen na ontharing snel te voltooien. 10 minuten of langer wachten kan aanzienlijk andere waarden opleveren in vergelijking met het uitvoeren van de metingen binnen een minuut of twee na ontharing. Naaldarraymetingen bij ratten of muizen veroorzaken meestal ten minste een kleine hoeveelheid bloedingen, wat de metingen kan beïnvloeden als het verandert in een groter hematoom rond de ingebrachte naalden. Ten slotte vereisen ex vivo metingen speciale zorg om ervoor te zorgen dat de spiervezels in de diëlektrische cel nauwkeurig worden uitgelijnd ten opzichte van de metalen platen. Ten slotte kan het bij kleine of zieke muizen onmogelijk zijn om transversale metingen te verkrijgen, gezien de kleine omvang van de spieren. Maar zoals hierboven vermeld, blijft het mogelijk om aangepaste 4-elektrode arrays te ontwerpen die voldoende klein kunnen zijn om longitudinale metingen uit te voeren in zelfs de kleinste spieren.
Data-analyse kan vrij eenvoudig worden gehouden - bijvoorbeeld door het meten van een enkele uitgang (bijv. fase) op een enkele frequentie (bijv. 50 kHz) in een enkele richting (bijv. Longitudinaal) - of vrij complex, door alle impedantieparameters over het gehele frequentiespectrum in zowel longitudinale als transversale richting op te nemen. Wanneer impedantiewaarden met één frequentie worden gebruikt, liggen deze meestal in het bereik van 30-100 kHz, omdat spieren de neiging hebben om het meest reactief te zijn (d.w.z. het meest "oplaadbaar") in dit frequentiebereik. Gecondenseerde of ingeklapte parameters, die proberen de vorm van het frequentiespectrum vast te leggen, zijn echter ook gebruikt. Deze waarden omvatten hellingen van lineaire pasvormen van de weerstand, reactantie en fasegegevens22 en 2-frequentieverhoudingen23. Als alternatief kunnen Cole-Cole-parameters worden berekend op basis van aanvallen van de impedantiegegevens, waaronder de R0 (bepaling van de weerstand bij nulfrequentie), Rinf (bepaling van de weerstand bij oneindige frequentie) en fc (middenfrequentie)24,25,26,27. Ten slotte kan machine learning worden gebruikt om alle gegevens in één keer te analyseren en voorspellende modellen te verbeteren, zowel voor regressie 12,13,15,16 als classificatie.
Ondanks deze beperkingen is EIM een krachtig en relatief eenvoudig hulpmiddel om meerdere aspecten van de spiergezondheid te beoordelen. Hoewel de focus van dit manuscript ligt op een enkele spier (gastrocnemius), is er niets dat het gebruik van EIM op andere oppervlakkige spieren (bijv. Quadriceps of biceps brachii) met behulp van oppervlakte-elektroden of diepere spieren met behulp van de naaldelektrode-array uitsluit. Inderdaad, bij mensen is de techniek gebruikt in een breed scala van spieren, waaronder zowel bovenste als onderste extremiteitsspieren 8,28, evenals axiale spieren (bijv. paraspinale spieren en buikspieren)29,30.
Het is aangetoond dat EIM betrouwbare metingen biedt met betrekking tot ziekteprogressie, remissie van atrofie en behandeling in de loop van de tijd. Gegevens met één frequentie kunnen volledig voldoende zijn om de ziektestatus in de loop van de tijd te beoordelen31; niettemin is de waarde van multifrequente gegevens dat ze nog steeds kunnen helpen bij het beoordelen van de kwaliteit van de meting, zoals hierboven beschreven. Gegevens met één frequentie afzonderlijk kunnen aanzienlijk worden verontreinigd door contactartefacten, en dit zou niet duidelijk zijn zonder het hele impedantiespectrum te bekijken. In klinische studies kan oppervlakte-EIM vaak worden gebruikt om pijnloze metingen te verkrijgen, waardoor het een eenvoudig hulpmiddel is om32 toe te passen. Deze overvloed aan gegevens kan van cruciaal belang zijn voor het gevoeliger volgen van de progressie van de ziekte. Bovendien kan de toevoeging van EIM aan klinische protocollen het aantal deelnemers dat nodig is tijdens een klinische studie aanzienlijk verminderen28,31.
EIM vindt steeds meer toepassing bij de beoordeling van een verscheidenheid aan neuromusculaire aandoeningen bij mensen. Dienovereenkomstig helpt het vermogen om de techniek effectief uit te voeren bij knaagdieren om de potentiële praktische waarde van de technologie uit te breiden en tegelijkertijd ons begrip van de relatie tussen verschillende EIM-outputs en onderliggende histologie te vergroten. De techniek is over het algemeen gemakkelijk te gebruiken en verdient het om samen met de nuttige kwantitatieve gegevens die het oplevert, te worden opgenomen in het standaard armamentarium van hulpmiddelen voor de beoordeling van zenuw- en spieraandoeningen in knaagdierziektemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S. B. Rutkove heeft aandelen in, en dient als consultant en wetenschappelijk adviseur van, Myolex, Inc., een bedrijf dat impedantie-apparaten ontwerpt voor klinisch en onderzoeksgebruik, en het mView-systeem dat hier wordt gebruikt. Hij is ook lid van de Raad van Bestuur van het bedrijf. Het bedrijf heeft ook een optie om gepatenteerde impedantietechnologie in licentie te geven waarvan S. B. Rutkove als uitvinder wordt genoemd. De andere auteurs hebben geen andere relevante banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financieel conflict met het onderwerp of de materialen die in het manuscript worden besproken, afgezien van de bekendgemaakte.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Charley's Fund en NIH R01NS055099.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
- Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
- Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
- Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
- Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
- Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
- Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
- Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
- Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
- Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
- Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
- Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
- Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
- Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
- Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
- Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
- Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
- Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
- Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
- Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
- Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
- Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
- Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
- Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
- Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
- Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
- Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
- Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
- Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
- Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
- Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
- Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
- Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).
